豬瘟的間接免光實驗

1、實實驗五驗五 豬瘟的間接免疫熒光實驗豬瘟的間接免疫熒光實驗龍巖學院生命科學學院2015.5.25一、實驗目的： 了解和掌握豬瘟的臨床診斷方法和實驗室診斷方法（間接免疫熒光法）。熒光免疫顯微技術熒光免疫顯微技術 直接法-熒光素標記ab直接檢測 間接法-熒光素標記二抗 補體結合法-熒光素標記抗補體ab 雙結合法-兩種熒光素標記ab二、實驗原理： 固定在載片上的待檢病變組織與適當稀釋的豬瘟陽性血清反應后，如果待檢組織中有豬瘟病毒抗原就會與豬瘟陽性血清中的抗體特異性結合，加入fitc(異硫氰酸熒光素)標記的的兔抗豬igg二抗又可與豬瘟陽性抗體特異性結合，在熒光顯微鏡下可見呈現(xiàn)綠色熒光。 熒光二抗熒光二

2、抗熒光素熒光素發(fā)射的發(fā)射的熒光色熒光色激發(fā)波長激發(fā)波長（nm）發(fā)射波長發(fā)射波長（nm）異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素（fitc） 綠綠495528四乙基羅丹明四乙基羅丹明 rb200 紅紅570595 熒光素及其激發(fā)波長和發(fā)射波長熒光素及其激發(fā)波長和發(fā)射波長三、試劑與儀器： 1.豬瘟病料、抗原片、fitc熒光標記的兔抗豬二抗、pbs緩沖液、豬瘟標準陰、陽性血清、封片介質:磷酸鹽緩沖甘油、蓋玻片、濾紙 2.熒光顯微鏡、搖床、移液器、吸管等生物薄片生物薄片生物薄片馬賽克：生物薄片馬賽克：將包被有不同基質的生物薄片固定在一個載片將包被有不同基質的生物薄片固定在一個載片反應區(qū)中，可同時檢測多種抗不同組織

3、或病原體的抗體。反應區(qū)中，可同時檢測多種抗不同組織或病原體的抗體。熒光顯微鏡：熒光顯微鏡：四、iif操作步驟：準備準備：取病豬的扁桃體，淋巴結、脾或其他組織一小片，用濾紙吸去外面的液體。用筆編號、標記。觸片：觸片：取干凈載玻片一塊，稍為烘熱，將組織小片的切面觸壓玻片，略加轉動，作成壓印置室溫內(nèi)干燥?；蛴盟傻牟±斫M織，做成切片。3. 固定：固定：滴加冷丙酮數(shù)滴，置20固定15一20分。4. 清洗：清洗：用pbs（ph7.2）洗滌3次，每次5 min，陰干。5. 第一次溫育第一次溫育：滴加25ul稀釋后的血清覆蓋觸片樣品，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測標本后才開始室溫溫育30分鐘。 四、iif操作步驟：6清洗清洗：用磷pbs沖洗載片（注意水流不要太急，不要直接對著觸片組織沖），然后立即將其浸入裝有磷酸鹽緩沖液的平皿中浸洗3次，每次5分鐘。7第二次溫育第二次溫育：滴上標記熒光抗體（30ul），置37飽和濕度箱內(nèi)處理1030分鐘。8清洗：清洗：用ph7.2的pbs漂洗3次，每次510分鐘。 9封閉：封閉：干后，滴上甘油緩沖液數(shù)滴，加蓋玻片封閉，用熒光顯微鏡檢查。10結果判斷結果判斷：如細胞胞漿內(nèi)有彌散性、絮狀或點狀的亮黃綠色熒光，為豬瘟，如僅見喑綠或灰藍則不是豬瘟。對照試驗用已知豬瘟病毒材料壓印片先用抗豬瘟血清處理，然后用豬瘟熒光抗體處如上檢查，應不出現(xiàn)豬瘟病毒感染的特異熒光