生化分析方法(熊)

1、指導(dǎo)老師：張宏姓名：熊昱什么叫生化分析，我們可以這樣理解：用生物、化學(xué)的原理和方法，研究生命現(xiàn)象的分析方法。研究生物體的化學(xué)組成、代謝、營(yíng)養(yǎng)、酶功能、遺傳信息傳遞、生物膜、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及分子病等等，闡明生命現(xiàn)象。 生化分析是進(jìn)行生命科學(xué)研究的一個(gè)重要手段，在生物醫(yī)藥研發(fā)、臨床生化診斷、生化產(chǎn)品生產(chǎn)等領(lǐng)域起著越來(lái)越重要的作用，是一門(mén)理論與實(shí)踐相結(jié)合的綜合性技術(shù)。從早期對(duì)生物總體組成的研究。進(jìn)展到對(duì)各種組織和細(xì)胞成分的精確分析。目前正在運(yùn)用諸如光譜分析、同位素標(biāo)記、x射線衍射、抗原抗體反應(yīng)、酶交聯(lián)的免疫吸附法、其他物理學(xué)、化學(xué)技術(shù)，對(duì)重要的生物大分子（如蛋白質(zhì)、核酸等）進(jìn)行分析，以期說(shuō)明這些生物大分子

2、的多種多樣的功能與它們特定的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)對(duì)不同的對(duì)象，有不同的分析方法，要達(dá)到不同的目的，也要使用不同的分析方法，因此分析方法也就多種多樣，在這里我就講蛋白質(zhì)的分析方法概述，拋磚引玉氨基酸蛋白質(zhì)的分析方法生物體中廣泛存在的一類生物大分子，由核酸編碼的氨基酸之間通過(guò)氨基和羧基形成的肽鍵連接而成的肽鏈，經(jīng)翻譯后加工而生成的具有特定立體結(jié)構(gòu)的、有活性的大分子。泛指某一類蛋白質(zhì)，與前面的限定詞組成復(fù)合詞時(shí)，一律用“蛋白質(zhì)”，如血漿蛋白質(zhì)、纖維狀蛋白質(zhì)、酶蛋白質(zhì)等，此時(shí)“質(zhì)”字不得省略(習(xí)慣詞除外，新命名者從此)。凡指具體蛋白質(zhì)時(shí)，“質(zhì)”字可省略，如血紅蛋白、肌球蛋白等。 蛋白質(zhì)四聚體蛋白質(zhì)四聚體(四級(jí)結(jié)構(gòu)

3、四級(jí)結(jié)構(gòu))1.氨基酸類藥物分析 藥典中氨基酸含量測(cè)定大多應(yīng)用化學(xué)滴定法,只有美國(guó)藥典中乙酰半胱氨酸采用高教液相色譜法( hplc ) 。1.1柱前衍生法柱前衍生法是將樣品制成適當(dāng)?shù)难苌镌龠M(jìn)行hplc分離，衍生化的結(jié)果不僅僅改善了被測(cè)物的檢測(cè)特性，有時(shí)對(duì)其色譜分離也有一定的幫助 ，常用 衍生化試劑有鄰苯二 甲醛、羥基琥珀酸亞胺一 吲哚乙酸(siia)、苯氨基硫代甲酰酯(ptc)。有科學(xué)家分別用亞硝酸和 n 芘基馬來(lái)酰亞胺作為衍生化試劑以紫外和熒光作檢測(cè)的反相高效液相法(r phplc) 定量測(cè)定人體內(nèi)乙酰半胱氨酸，獲得到滿意結(jié)果。1.2柱后衍生法柱后衍生法是將樣品先經(jīng)色譜柱分離， 柱后再進(jìn)行衍

4、生。nozal等將乙酰半胱氨酸經(jīng)rphplc分離后，用二硫硝基苯酸衍生處理再進(jìn)行檢測(cè)， 同時(shí)加入溴化十六烷基三 甲銨陽(yáng)離子以增強(qiáng)靈敏度，檢測(cè)限為0.6g 。得到了滿意的結(jié)果1.3其他衍生方式除了以上兩種經(jīng)典衍生方式外，最近有文獻(xiàn) “介紹了用于定量分析氨基酸的一種毛細(xì)管柱內(nèi)衍生方法，可在緩沖液中加入衍生劑(online法)， 也可在毛細(xì)管前端的衍生室進(jìn)行反應(yīng)(sandwich法)，這種方法與柱前衍生法檢測(cè)水平相當(dāng)( 微克級(jí)) 此外， 還可用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器直接檢測(cè)非衍生化的氨基酸，配合hplc的分離定量， 檢測(cè)限達(dá) 納克級(jí) ， 回收率為9 4%2 酶類分析 酶的種類極多， 目前研究發(fā)現(xiàn)的酶已達(dá)

5、1300多種，它們都是機(jī)體細(xì)胞中合成的蛋白質(zhì)，具有高度的催化作用及選擇性；雖為活體產(chǎn)生，但 自活體提出后 ，仍不失其催化活性個(gè)，因此某些酶經(jīng)提取后，可作 為藥用。 現(xiàn)有藥用酶制劑已達(dá)100種， 。 酶類藥物分析基本上還是應(yīng)用生化反應(yīng)方法，生化物質(zhì)為底物，輔以紫外分光光度法 (uv) ，反映酶解反應(yīng)的程度 ， 測(cè)定酶效價(jià)。映酶解反應(yīng)的程度 ， 近年來(lái)， 人們嘗試用一些新的生化反應(yīng)底物使反應(yīng)更加靈敏和準(zhǔn)確 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡(jiǎn)稱sod)是一種十分重要的生物體防止氧化損傷的酶類，是生物體內(nèi)超氧陰離子清除劑，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。sod廣泛存在于各類生

6、物體內(nèi)，所有好氧微生物細(xì)胞中都含有sod。自1969年mccord等人首次發(fā)現(xiàn)了sod生物活性后，醫(yī)學(xué)界對(duì)其醫(yī)療作用做了許多研究，證明它具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗缺血、提高人體免疫力等作用，被專家稱為21世紀(jì)最有前途的藥用酶。歐美國(guó)家已開(kāi)始將其應(yīng)用于醫(yī)療、食品、保健、化妝品等領(lǐng)域。【酶活測(cè)定】在25 4.5ml 50mmoll ph8.3的k2hpo4- kh2po4緩沖液中加入待測(cè)sod樣液，再加入10ul 50mmoll的連苯三酚，迅速搖勻，倒入光徑lcm 的比色杯，在325nm波長(zhǎng)下每隔30s測(cè)一次a值。同時(shí)測(cè)定sigma公司的sod標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)所測(cè)樣品sod活性進(jìn)行校正?！久富疃x】

7、在1ml反應(yīng)液中，每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達(dá)50時(shí)的酶量為一個(gè)酶活單位， 即325nm 0.035odmin為一個(gè)酶活單位。jones應(yīng)用硫代氨基甲酰-酪蛋白熒光底物使胰蛋白酶、胃蛋白酶的檢測(cè)靈敏度提高了幾十倍；張東裔等以對(duì)甲苯磺酰基精氨酸甲酯(tame ) 為底物，以 苯酚紅指示劑在特定波長(zhǎng)下光吸收值的變化作為測(cè)定胰蛋白酶效價(jià)的指標(biāo)， 相對(duì)于藥典中以消耗氫氧化鈉體積為指標(biāo)，這種方法更加簡(jiǎn)便靈敏；此外， 通 過(guò)選擇不同的底物和指示劑 ， 此法還 可用于測(cè)定其 它蛋白酶的活性 ， 從而建立一 系列以指示劑為基礎(chǔ)的酶活性測(cè)定方法。3 蛋白質(zhì)多肽類藥物分析 ，英文名：（western blott

8、ing ）一種分析和鑒定特定蛋白質(zhì)的技術(shù)。即將混雜的蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至固相膜上，再用標(biāo)記的抗體或二抗與之反應(yīng)，以顯示膜上特定的蛋白條帶 3.2，簡(jiǎn)稱elisa，簡(jiǎn)稱elisa。它的中心就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過(guò)顯色來(lái)檢測(cè)。 3.3。一般用制好的單克隆抗體試劑盒來(lái)檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確3.4，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化

9、學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。3.5熒光光譜法熒光光譜法靈敏度高，復(fù)雜組分辨識(shí)度好，作為一種常規(guī)的檢測(cè)手段在生物傳感方面發(fā)揮著其優(yōu)勢(shì)，是定量測(cè)定蛋白質(zhì)的常用方法。常用的幾種方法是內(nèi)源熒光法、熒光探針?lè)?、熒光偏振、時(shí)間分辨熒光法及激光誘導(dǎo)時(shí)間分辨免疫分析法。3.51內(nèi)源熒光法是基于蛋白質(zhì)中存在著酪氨酸和色氨酸，能夠吸收270-300nm的紫外光而發(fā)出紫外熒光發(fā)展起來(lái)的61, 62。當(dāng)測(cè)定體系中加入小分子配體(sm)時(shí)，sm與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)熒光的碎滅，利用sm對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的碎滅這一現(xiàn)象可以確定蛋白質(zhì)與sm的作用類型及其結(jié)合部位等。此法比紫外分光光度法靈敏，

10、且核酸的干擾較小，來(lái)自其他小分子化合物的干擾也比較小。3.523.53利用熒光體在轉(zhuǎn)動(dòng)擴(kuò)散速度上的差異而導(dǎo)致偏振熒光的差別，建立了熒光偏振測(cè)定法。利用熒光偏振我們可以研究:(1)酶與熒光底物的結(jié)合程度;(2)蛋白質(zhì)聚合與解離;(3)蛋白質(zhì)從螺旋到無(wú)規(guī)則卷曲的研究。另外還可得到一些通常由圓二色譜和紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)得不到的有關(guān)蛋白質(zhì)柔性微區(qū)的信息3.54時(shí)間分辨熒光光譜是依據(jù)待測(cè)組分熒光衰減特性的差異而進(jìn)行選擇性測(cè)定，可以消除瑞利和拉曼散射的干擾，又可以根據(jù)熒光壽命的差異對(duì)熒光光譜重疊組分進(jìn)行測(cè)定，為復(fù)雜體系的熒光測(cè)量提供了選擇性基礎(chǔ)。時(shí)間分辨一熒光免疫分析以具有較長(zhǎng)熒光壽命的熒光基團(tuán)作為免疫標(biāo)

11、記，利用時(shí)間分辨熒光測(cè)量技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。一方面可以在熒光分子定量中獲得高靈敏度，另一方面可以通過(guò)時(shí)間分辨技術(shù)使選擇性得到改善，這樣就可以定性和定量分析微量蛋白質(zhì)。3.55在稀土配合物時(shí)間分辨熒光光譜和免疫分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的激光誘導(dǎo)時(shí)間分辨免疫分析法在靈敏度、專一性、穩(wěn)定性等方面均可與放射免疫分析相媲美，是超微量蛋白質(zhì)免疫分析的有力手段，已用于人尿中免疫球蛋白g的測(cè)定。 4儀器分析由于科學(xué)的發(fā)展，各種物理化學(xué)手段的不斷提高，許多科學(xué)儀器被制作出來(lái)，大量復(fù)雜的、精確的操作都有科學(xué)儀器來(lái)完成4.1生化分析儀光電比色原理來(lái)測(cè)量體液中某種特定化學(xué)成分的儀器。由于其測(cè)量速度快、準(zhǔn)確性高、消耗試劑量小，現(xiàn)

12、已在各級(jí)醫(yī)院、防疫站、計(jì)劃生育服務(wù)站得到廣泛使用。配合使用可大大提高常規(guī)生化檢驗(yàn)的效率及收益。4.11 自動(dòng)是將生化分析中的取樣、加試劑、去干擾物、混合、保溫、比色、結(jié)果計(jì)算、書(shū)寫(xiě)報(bào)告和清理等步驟的部分或全部由模仿手工操作的儀器來(lái)完成。它可進(jìn)行定時(shí)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法等各種反應(yīng)類型的分析測(cè)定。除了一般的生化項(xiàng)目測(cè)定外，有的還可進(jìn)行激素、免疫球蛋白、血藥濃度等特殊化合物的測(cè)定以及酶免疫、熒光免疫等分析方法的應(yīng)用。它具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化、微量等特點(diǎn) 4.12幾種生化分析儀 4.13蛋白質(zhì)分析全自動(dòng)凱氏定氮儀（國(guó)家發(fā)明專利號(hào)zl200710054302.7） 使用世界上領(lǐng)先的顏色傳感器技術(shù)判定滴定終點(diǎn)技術(shù)，該技術(shù)與光電管檢測(cè)方式相比具有終點(diǎn)判斷精確、抗干擾能力強(qiáng)、壽命長(zhǎng)、無(wú)需將滴定系統(tǒng)置于暗室，操作與觀察方便等顯著的優(yōu)點(diǎn);與電位滴定檢測(cè)方式相比具有滴定終點(diǎn)無(wú)溫度漂移，無(wú)需預(yù)熱與校準(zhǔn)等明顯優(yōu)勢(shì)。 設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，選材嚴(yán)格，確保測(cè)試高精度與高回收率 pc化，網(wǎng)絡(luò)化優(yōu)勢(shì)，儀器具有rs232接口(標(biāo)配)與無(wú)線藍(lán)牙接口(選配)，連接電腦由配套的專用數(shù)據(jù)處理軟件自動(dòng)生成測(cè)試信息和全面的檢測(cè)報(bào)告,并有增強(qiáng)型的計(jì)算機(jī)控制軟件可供選購(gòu).k05a自動(dòng)定氮儀（專利申請(qǐng)?zhí)?00520000443.7） .采用國(guó)標(biāo)規(guī)定的檢驗(yàn)方法 .大屏幕lcd顯示屏，人性化操作界面，使用舒適方便 .自動(dòng)加吸收液、