含氮大環(huán)內(nèi)酯類抗生素生物合成及其研究進(jìn)展

1、含氮大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及其生物合成研究進(jìn)展雷帕霉素、他克莫司等一類含氮大環(huán)內(nèi)酯類微生物代謝產(chǎn)物是目前臨床重要的藥物， 它們具有特殊的結(jié)構(gòu)基團(tuán)， 即內(nèi)酯環(huán)上含有1 分子非蛋白質(zhì)組成氨基酸哌可酸，通過哌可酰基與細(xì)胞內(nèi)一類具有脯氨酰順反異構(gòu)酶活性的免疫親合蛋白 ( immunophilin )fkbps (fk506 bingding proteins)相互作用形成復(fù)合物，作用于細(xì)胞不同靶位，發(fā)揮多種不同的生物學(xué)功能1 。這類化合物具有廣泛的生物學(xué)活性，除抗真菌活性外，臨床已用作器官移植抗排斥藥物、血管擴(kuò)張支架涂層藥物2 、靶向抗腫瘤藥物3-4 、炎癥治療藥物 5 ， 同時(shí)， 這類化合物還具有潛在的治

2、療中風(fēng) 6 、 神經(jīng)退行性疾病7 、 帕金森綜合癥8 、老年癡呆9等作用，harrison等人2009年7月在nature雜志上報(bào)道雷帕霉素可以延長哺乳類動(dòng)物老齡小鼠壽命的研究成果10 ， 立即引起各國科學(xué)家的廣泛關(guān)注和高度興趣11,美國science雜志把此項(xiàng)研究成果評選為當(dāng)年十大科學(xué)進(jìn)展之一，預(yù)計(jì) 10年左右可望應(yīng)用于人體。含有哌可?；暮蟓h(huán)內(nèi)酯類微生物代謝產(chǎn)物具有相似的生物合成途徑， 它們都屬大環(huán)內(nèi)酯類化合物， 由典型的具有模塊結(jié)構(gòu)的 i 型聚酮合酶( polyketide synthase, pks)催化合成內(nèi)酯環(huán)碳鏈骨架，由單模塊的非核糖體肽合成酶( non-ribosomal

3、peptidesynthetase, nrps) 催化把哌可酸整合到內(nèi)酯環(huán)骨架， 并通過環(huán)化酶活性域使含哌可?；木弁渻?nèi)酯化從pks/nrps雜合酶上脫離，最后通過一些列氧化酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等進(jìn)行側(cè)鏈基團(tuán)的修飾形成最后的活性產(chǎn)物，由于這類化合物具有相似的結(jié)構(gòu)和合成機(jī)制，特別是它們的作用機(jī)制獨(dú)特帶來廣泛的生物學(xué)活性和臨床應(yīng)用前景， 已經(jīng)成為目前國內(nèi)外關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。一、微生物產(chǎn)生的含氮大環(huán)內(nèi)酯類化合物1、rapamycin (雷帕霉素,西羅莫司/sirolimus)1975,力口拿大ayerst試馬室vezina在篩選抗真菌抗生素中，從太平洋復(fù)活島土壤樣品中分離到一株具有抗白色念珠菌 ( ca

4、ndida albicans) 等酵母樣真菌和石膏樣小孢子菌(microsporum gypseum)等絲狀真菌活性的吸水鏈霉菌 ( streptomyces hygroscopicusnrrl5491） 12,并從其發(fā)酵液中分離得到一個(gè)新的含氮三烯 36元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌 化合物（圖1）,即雷帕霉素。1988年delin和hargrav我fk506獨(dú)特大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的啟發(fā), 根據(jù)fk506和雷帕霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性和均具有免疫抑制作用的特點(diǎn)，提出詳細(xì)比較 兩種化合物的生物學(xué)功能，重新對雷帕霉素的免疫抑制活性進(jìn)行研究。歷經(jīng)25年，1999年9月fda批準(zhǔn)美國家用產(chǎn)品公司（ahp）的雷帕霉素及其

5、口服液作為器官移植抗排斥 藥物投放市場13o200孫goodfellow等人采用形態(tài)學(xué)結(jié)合遺傳學(xué)分析方法對雷帕霉素產(chǎn)生菌重新進(jìn)行 分類學(xué)研究，正式把產(chǎn)生菌 streptomyces hygroscopicunrrl5491 定名為 streptomyces rapamycinicus 新種 14。2、tacrolimus （他克莫司，fk506）1983年美國fda批準(zhǔn)真菌產(chǎn)生的h一環(huán)肽抗生素環(huán)抱素（cyclosporin a）作為免 疫抑制劑用于器官移植抗排斥反應(yīng)，成功應(yīng)用于抑制骨髓移植受體的抗排斥和自身免疫 性疾病的治療，為器官移植治療帶來革命性的突破，免疫抑制劑的研究進(jìn)入一個(gè)新的發(fā) 展時(shí)

6、代。日本藤澤公司（fujisawa）建立混合淋巴細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞生長、白細(xì)胞介素 ii合成等模型，開展從微生物代謝產(chǎn)物中篩選具有免疫抑制活性的新型化合物，1987年從大阪筑波土壤中分離得到一株筑波鏈霉菌（streptomyces tsukubaensino. 9993） 15, 其代謝產(chǎn)物能夠抑制il-2的合成16,經(jīng)過發(fā)酵、分離、純化獲得另一個(gè)含哌可酰基23元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類化合物 tacrolimus （他克莫司，fk506）（圖2）。圖1 雷帕霉素結(jié)構(gòu)式圖2fk506結(jié)構(gòu)式生物學(xué)活性研究發(fā)現(xiàn)fk506具有很強(qiáng)的免疫抑制特性，其活性是環(huán)抱素的10-100倍，預(yù)防各種器官移植所出現(xiàn)的排斥反應(yīng)的效

7、果優(yōu)于環(huán)抱素。1989年，美國匹茲堡大學(xué)starzl器官移植中心將fk506首次在臨床試用，1993年在日本上市，商品名普樂可復(fù) （prograf）。1995年經(jīng)fda獲準(zhǔn)后在多個(gè)國家正式使用，1999年獲準(zhǔn)在中國上市。目 前，普樂可復(fù)已廣泛應(yīng)用于肝臟、胰腺、腎臟、心臟、肺等實(shí)體器官移植的抗排斥作用。3、ascomycin （子囊霉素，fk520,免疫霉素/immunomycin）繼fk506之后，1988年藤澤公司又報(bào)道從另一株鏈霉菌 streptomyces hygroscopicus subsp yakushimaensisno 72381代謝產(chǎn)物中獲得兩個(gè)新的與 fk506結(jié)構(gòu)類似的2

8、3元環(huán) 含哌可酰基大環(huán)內(nèi)酯類化合物 fr900520和fr900523 （圖3、4） 17。它們與fk506結(jié) 構(gòu)僅在內(nèi)酯環(huán)c-21位上側(cè)鏈不同，分別是乙基、甲基，而fk506該位置是烯丙基。體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示兩個(gè)化合物均有免疫抑制作用，ic50分別為0.55 nm和1.6nm,略高于fk506的0.23 nm。低于3200nm對淋巴瘤el-4體外沒有細(xì)胞毒作用。圖3fr900520結(jié)構(gòu)式圖4fr900523結(jié)構(gòu)式兩個(gè)化合物對細(xì)菌和酵母樣真菌均沒有抗菌活性，對絲狀真菌煙曲霉（aspergillusfumigatus ifo 5840）顯示較強(qiáng)抗菌活性，mic 分別為 0.03 仙 g

9、/ml and 0.3pg/ml。fr900520能夠明顯延長皮膚移植物存活時(shí)間，并顯現(xiàn)量效關(guān)系。1992年morisaki等人證實(shí)fr900520與arai等人1962年報(bào)道的從吸水鏈霉菌子囊 霉素變種（streptomyces hygroscopicuvar. ascomyceticusatcc14891）中發(fā)現(xiàn)的抗真菌抗 生素子囊霉素（ascomycin）同質(zhì)18。4、meridamycin （美立霉素）由于環(huán)抱素、fk506和雷帕霉素等微生物來源的免疫抑制劑的臨床成功應(yīng)用，引起各國科學(xué)家廣泛關(guān)注，試圖從微生物代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)選擇性更強(qiáng)、毒性更低的新型免疫調(diào)節(jié)劑。特別是把fk506和雷帕霉

10、素共同的結(jié)合靶標(biāo) fkbp12作為研究基礎(chǔ)開展廣泛的 化合物篩選，1994年和1995年，瑞士山道士公司fehj19和美國默克公司salituro20等 人先后報(bào)道從兩株鏈霉菌（streptomycessp. a 91-261 402 和 streptomyceshygroscopicusf-004081）代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的29元環(huán)含哌可?；蟓h(huán)內(nèi)酯類化合物，命名為meridamycin （美立霉素）（圖5）,內(nèi)酯環(huán)含有1分子哌可?；拖噙B的環(huán)半酮縮醇結(jié)構(gòu) （圖5藍(lán)色部分），這部分結(jié)構(gòu)可能是fkbp12結(jié)合的關(guān)鍵基團(tuán)，與雷帕霉素完全相同， 而與fk506僅相差一個(gè)氧甲基。meridamyc

11、in能夠競爭性抑制fk506與fkbp12結(jié)合， ic50為1.0 ng/ml,但其本身沒有免疫抑制活性，能夠拮抗fk506和雷帕霉素的免疫抑制活性，因此可能作為k506和雷帕霉素過量服用的解毒劑，另外還發(fā)現(xiàn)其可作為皮質(zhì) 激素的增效劑用于治療皮膚炎癥和增生。作為非糖皮質(zhì)激素vb療特應(yīng)性皮炎，fk506和fk520的半合成衍生物叱美莫司（pimecrolimus）（圖6）已獲準(zhǔn)上市，被譽(yù)為外用糖皮質(zhì)激素后皮膚科治療最重要的突破之一。圖5 meridamycin結(jié)構(gòu)式圖 6 pimecrolimus 結(jié)構(gòu)式研究發(fā)現(xiàn)meridamycin及其衍生物在治療神經(jīng)退行性疾病，如老年性癡呆（alzheime

12、r's）、帕金森綜合癥（parkinsons disease、創(chuàng)傷性和缺血性神經(jīng)損傷，促進(jìn)神經(jīng)再生和神經(jīng)保護(hù)等方面具有潛在的應(yīng)用前景，引起了廣泛的關(guān)注。美國惠氏公司已 就此申請了專利保護(hù)21o5、antascomicins瑞士山道士公司上世紀(jì)八十年代研發(fā)成功十一環(huán)肽抗生素環(huán)抱素用于器官移植抗排斥治療之后，他們又利用子囊霉素、fk506和雷帕霉素這類化合物通過與免疫親合蛋白(immunophilin)結(jié)合發(fā)揮免疫抑制活性的作用機(jī)制，廣泛篩選能夠與此類蛋白結(jié)合的微生物代謝產(chǎn)物，繼1994年報(bào)道發(fā)現(xiàn)meridamycin后，1996年又報(bào)道從12000株放線菌中發(fā)現(xiàn)一株從采自中國的土壤樣品中

13、分離得到的小單抱菌(micromonospora sp.a92-306401) 22,其發(fā)酵液中分離得到5個(gè)與fk506結(jié)構(gòu)類似新的23元環(huán)含哌可酰基大環(huán)內(nèi)酯類化合物 antascomicins (圖7)。rir2r3nantascomicin a二h=h=h2antascomicin b=oh=h=h2antascomicin c=oh=ch3=h2antascomicin d=h=h=h1antascomicin e=h=h=oh2圖 7 antascomicins 結(jié)構(gòu)式antascomicins具有很強(qiáng)的fkbp12結(jié)合能力，除了內(nèi)酯環(huán)上哌可?；桓；〈?的antascomicin

14、 d外，其余4個(gè)化合物與fkbp12結(jié)合能力與fk506和雷帕霉素相當(dāng)， antascomicin d結(jié)合力低5-10倍，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示 antascomicins沒有抑制 t淋巴細(xì)胞增殖活性，在 fk506相同劑量條件下無抑制白細(xì)胞介素ii合成的活性，也 沒有類似雷帕霉素抑制 細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的 增殖活性。同meridamycin 一樣, antascomicins能夠拮抗fk506和雷帕霉素的活性，特別是對雷帕霉素，等摩爾濃度的 antascomicin b或者c即可抵消雷帕霉素體外活性。6、nocardiopsins2010年澳大利亞昆士蘭大學(xué)capon等人23從55米深處海洋

15、沉積物中分離得到一株 擬諾卡氏菌(nocardiopsis sp. cmb-m0232),該菌種在不含海水的培養(yǎng)基中產(chǎn)生兩個(gè) 22 元環(huán)含哌可?；蟓h(huán)內(nèi)酯類化合物 nocardiopsin a和b (圖8)。一般認(rèn)為，含氮大環(huán)內(nèi) 酯類化合物通過哌可?；拖噙B的環(huán)半酮縮醇結(jié)構(gòu)與靶位蛋白fkbp相互結(jié)合形成復(fù)合物，再以復(fù)合物形式與不同細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑位點(diǎn)作用，發(fā)揮各種生物學(xué)活性。與上述 各化合物不同，nocardiopsins分子結(jié)構(gòu)中沒有環(huán)半酮縮醇結(jié)構(gòu)，即沒有完整的fkbp結(jié) 合基團(tuán)，但它們能保留中等強(qiáng)度的 fkbp12結(jié)合能力，體外無抗細(xì)菌、抗真菌和細(xì)胞毒 活性。能夠與fkbps結(jié)合，但沒有免

16、疫抑制活性的化合物很可能在神經(jīng)退行性疾病治 療、神經(jīng)再生和神經(jīng)營養(yǎng)方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值，這方面的研究工作還在進(jìn)行當(dāng)中。圖 8 nocardiopsins 結(jié)構(gòu)式二、含氮大環(huán)內(nèi)酯類化合物生物學(xué)活性及其作用機(jī)制隨著fk506、雷帕霉素等一些列含氮大環(huán)內(nèi)酯類化合物作為器官移植抗排斥藥物成 功開發(fā)，對它們的獨(dú)特作用機(jī)制和生物合成機(jī)制的研究也不斷取得重大突破。特別是這 類化合物共同的結(jié)合靶標(biāo)fkbps和哺乳動(dòng)物細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵調(diào)控靶標(biāo)mtor的發(fā)現(xiàn)24及其調(diào)控機(jī)制不斷被揭示，也帶來這類化合物在臨床上新的應(yīng)用領(lǐng)域。1991年hall等人分別在science和pnas雜志上發(fā)表報(bào)道，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素在酵母細(xì)

17、 胞信號傳導(dǎo)途徑中的作用靶點(diǎn) tor (target of rapamycin) 25和啤酒酵母中fk506的結(jié) 合靶標(biāo)fkbp (fk506 binding protein) 26,開始了此類化合物細(xì)胞內(nèi)分子作用機(jī)制的深 入研究。fkbp是一類免疫親合蛋白(immunophilins),具有肽?；滨ｍ樂串悩?gòu)酶活性(peptidylprolyl cis/trans isomerases, ppiases, fkbp 廣泛存在于從古菌到哺乳動(dòng)物的細(xì) 胞中，體外蛋白復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，xaa-pro鍵的順反異構(gòu)化是限速步驟，而ppiase可極大提高xaa-pro鍵順反構(gòu)型的轉(zhuǎn)化率，在新生肽鏈的折疊與生

18、物大分子自我組裝過程中發(fā)揮 重要作用，決定了此類蛋白質(zhì)的多功能性27-28o雷帕霉素、fk506等此類化合物含有與 ppiase底物脯氨?；Y(jié)構(gòu)相似的哌可?；?，推測可能與底物競爭性結(jié)合fkpb的ppiase 催化位點(diǎn)，抑制ppiase活性。人體基因組中含有20多個(gè)免疫親合蛋白基因，研究表明 28 它們與體內(nèi)一系列功能蛋白相關(guān)， 如鈣調(diào)磷酸酶29-30 、 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 (mtor)31 、鈣離子通道(ion channels) 32-33、類固醇受體復(fù)合物(steroid receptor complexes)34 、轉(zhuǎn)錄因子( transcription factors) 35 、

19、 bcl-2 條件激活上調(diào)( bcl-2 upon conditionalactivation) 36等，因此 fk506 、雷帕霉素等免疫親合蛋白配基化合物能夠干擾體內(nèi)正常存在的 fkbp復(fù)合物，或者通過形成三重復(fù)合物(如fkbp12fk506palcineurin、fkbp12tapamycinmtor),引起免疫細(xì)胞生長、內(nèi)皮細(xì)胞生長、月中瘤發(fā)生、神經(jīng)營養(yǎng)和再生甚至動(dòng)物壽命等相關(guān)的一系列的生物學(xué)活性37 。 ppiase 作用機(jī)制正在逐步被認(rèn)識，可能是與磷酸化信號傳導(dǎo)途徑類似的一種還尚未被深入了解的細(xì)胞調(diào)控機(jī)制 28 。由于雷帕霉素的研究，從啤酒酵母中發(fā)現(xiàn)了真核細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵靶位

20、tor ， tor 在調(diào)控細(xì)胞的生長、營養(yǎng)中發(fā)揮重要作用。隨后又從其它真菌、哺乳動(dòng)物、蒼蠅、蠕蟲和植物中發(fā)現(xiàn)tor 靶位，證明 tor 在各種真核生物細(xì)胞中高度保守。低等真核細(xì)胞一般都含有兩個(gè)tor基因，而高等真核生物細(xì)胞一般都只含有一個(gè) tor基因， 1994年sabatini24brown38幾乎同時(shí)報(bào)道從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)高等真核細(xì)胞 tor, 并分別在 cell 和 nature 雜志上報(bào)道。mtor (哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)是絲/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員，這類蛋白激酶又屬于磷酯酰肌醇激酶相關(guān)激酶( pikk ) 。k506 和雷帕霉素能夠與相同的靶蛋白 fkbp12 結(jié)合發(fā)揮其免

21、疫抑制作用，但它們的免疫抑制機(jī)制不同， fk506 與 fkbp12 結(jié)合形成的復(fù)合物作用于鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin) 39，而雷帕霉素與fkbp12 結(jié)合形成的復(fù)合物作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵靶酶 mtor (mammalian target of rapamycin)靶位。mtor靶位調(diào)控 不同細(xì)胞因子受體的信號傳導(dǎo)，阻斷 t淋巴細(xì)胞及其它細(xì)胞由g1期至s期的進(jìn)程，在 細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和存活中扮演重要角色，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，對白血病、卵巢癌、乳腺癌、中樞神經(jīng)和小細(xì)胞肺癌等有效，成為癌癥治療中的一個(gè)新靶點(diǎn)40。美國fda 分別于2007年、 2009年批

22、準(zhǔn)雷帕霉素半合成衍生物cci-779、everolimus用于晚期腎癌治療，另一個(gè)雷帕霉素衍生物 ap23573也于2010年fda批準(zhǔn)進(jìn)行軟組織和骨骼惡性腫瘤的臨床研究 41 ， 此類化合物對非小細(xì)胞肺癌42 、 肉瘤等的應(yīng)用已處在臨床試驗(yàn)階段43 。隨著含氮大環(huán)內(nèi)酯類化合物的深入研究， 發(fā)現(xiàn)它們在神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)方面具有潛在的作用，特別是 meridamycin、antascomicins等本身沒有免疫抑制活性的此類化合物，具有更大的優(yōu)勢，它們可能不是與fkbp12結(jié)合，而是與另一個(gè)具有ppiase活性的靶蛋白 fkbp52 結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)活性44，沒有 fkbp12 結(jié)合能力的 fk

23、506 衍生物能夠刺激 sh-sy5y 細(xì)胞神經(jīng)突觸延長和加快神經(jīng)再生45 。這類化合物的結(jié)合靶點(diǎn)及其復(fù)雜的作用機(jī)制目前仍然還有待更多的研究和探索。此外，fk506以及子囊霉素的半合成衍生物口比美莫司(pimecrolimus)對特應(yīng)性皮炎、銀屑病和禿斑等自身免疫性疾病有很好的療效，國外已開發(fā)成替代糖皮質(zhì)激素的新型治療皮炎藥物，被譽(yù)為皮膚科治療的重大突破5 。雷帕霉素及其衍生物還有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的作用，已經(jīng)有多個(gè)化合物獲準(zhǔn)用作血管擴(kuò)張支架的涂層藥物，抑制支架植入后的血管再狹窄。值得關(guān)注的是2009年7月nature雜志發(fā)表14位美國科學(xué)家共同署名的論文10 ， 報(bào)道雷帕霉素可延長老齡小鼠

24、壽命的研究結(jié)果， 他們分別在3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室對 2000 只 20 個(gè)月齡的白鼠進(jìn)行試驗(yàn)， 結(jié)果攝入雷帕霉素的雌雄白鼠的壽命分別平均增加了 14%和9%,最高達(dá)35%,這項(xiàng)成果被science雜志評選為2009年世界十大科學(xué)進(jìn)展之一。三、含氮大環(huán)內(nèi)酯類化合物的生物合成含氮大環(huán)內(nèi)酯類化合物重要的生物學(xué)功能和臨床應(yīng)用價(jià)值， 引起分子生物學(xué)家的極大興趣，深入開展對此類化合物的生物合成機(jī)制的研究，為通過遺傳改造、組合生物合成、酶工程等技術(shù)獲得高效、低毒、具有新生物學(xué)活性的衍生物奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1、內(nèi)酯環(huán)生物合成劍橋大學(xué)leadlay等人46成功克隆了紅霉素合成基因簇并推導(dǎo)出紅霉素內(nèi)酯環(huán)(6- 脫氧紅霉酯

25、b )合成途徑，開辟了聚酮類化合物特殊的合成機(jī)制研究。典型的i型聚酮合酶(polyketide synthases，pks)是一類具有模塊(module)結(jié)構(gòu)的巨型復(fù)合酶體，一般由多亞基蛋白組成，每個(gè)亞基含有不同數(shù)目的模塊，模塊之間呈線性排列 ， 每個(gè)模 塊含 有相似的催化活性域 (domain) ， 至少包括酮基合成酶 (ketosynthase ks)、?；D(zhuǎn)移酶(acyltransferasq at)和酰基載體蛋白(acyl carrier protein， acp) (圖 9) 3個(gè)活性域，共同負(fù)責(zé)聚酮鏈一個(gè)延伸循環(huán)，使聚酮鏈延長 2個(gè) 碳長度，同時(shí)在b位形成酮基，a位根據(jù)at識別的底

26、物不同，可能產(chǎn)生甲基、乙基、 氧甲基、 烯丙基等側(cè)鏈基團(tuán)。 在每個(gè)模塊內(nèi)部 at 與 acp 之間， 還可能存在酮基還原酶( keto reductase， kr ) 、脫水酶(dehydratase， dh )和烯酰基還原酶( enoyl reductase， 31er）等b位酮基修飾活性域，負(fù)責(zé)把本模塊延伸形成的b位酮基還原為羥基、烯鍵或飽和碳鏈。pks最后一個(gè)模塊一般含有1個(gè)硫酯酶（thioesterase te）活性域，負(fù)責(zé)把 合成完成的聚酮鏈內(nèi)酯化，進(jìn)而從最后一個(gè)模塊的acp上脫離下來，形成內(nèi)酯環(huán)化的代謝產(chǎn)物前體。最后通過其它相關(guān)氧化酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等修飾酶對前體物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾 形成終

27、產(chǎn)物。dhat acp ks at acpks at acp tein利用防m(xù)omo®leelong翩ommiqduiettermi麗mmoeuieks domain,ketosynthaseat domain,acyltransferaseacp domain, acyl carrier protein te domain, thioesterase kr domain, keto reductase dh domain, dehydratase er domain, enoyl reductase典型曄-聞9示i端ks結(jié)構(gòu)示意圖ks domain, ketosynthasekr

28、domain, keto reductaseat1<9ma 礪 aearaayerase 47 成功克 dhdoma獻(xiàn)dehydratases 簇,其聚酮鏈同樣也是由典型acp domain, acyl carrier protein er domain, enoyl reductase的teeaornsn/io幽eras成。雷帕霉素合成基因簇全長超過1。7世，含有26個(gè)編碼基因,其中3個(gè)超大型開放閱讀框（orfs）,分別命名為rapa、rapb和rapc基因，相應(yīng)的編 碼蛋白rapa、rapb和rapc分另1j達(dá)至i 900kda、1.07mda和660 kda,占整個(gè)合成基因簇的3/

29、4以上，是典型的i型pks編碼基因，分別含4個(gè)、6個(gè)和4個(gè)延伸模塊，第1 個(gè)亞基還同時(shí)含有1個(gè)起始模塊，三個(gè)pks亞基總共含有70個(gè)催化活性域，負(fù)責(zé)催化雷帕霉素內(nèi)酯環(huán)的脂肪鏈部分。每個(gè)模塊負(fù)責(zé)識別不同小分子酰基-coa底物，通過縮合反應(yīng)使聚酮鏈延伸兩個(gè)碳原子。同位素標(biāo)記的前體物添加實(shí)驗(yàn)證明雷帕霉素pks起始模塊識別的是莽草酸 衍生物（4r,5r）-4,5-dihydroxy-cyclohex-1-enecarboxylic acid （dhchc）48, 14個(gè)延伸模塊中有7個(gè)識別丙二酰-輔酶a底物（分別是第2、5、8、9、 11、12和14模塊）、7個(gè)識別的是甲基丙二酰-輔酶a （分別是第1

30、、3、4、6、7、10 和13模塊），后者使內(nèi)酯環(huán)相應(yīng)位置形成甲基側(cè)鏈。第8、9和10模塊均同時(shí)含有kr和dh兩個(gè)活性域，因此連續(xù)3個(gè)模塊延伸形成的b位酮基均被還原為不飽和烯鍵，形 成共腕三烯結(jié)構(gòu)49 o除 pks 編碼基因外，在 rapa 和 rapc 之間有一個(gè)典型的非核糖體肽合成酶( nonribosomal peptide synthetase nrps)基因rapp,序列分析是單模塊 nrps基因。雷帕 霉素 pks 最后一個(gè)模塊沒有te 活性域，因此推測聚酮鏈合成后并沒有馬上環(huán)化脫離pks,而是pks與nrps雜合50, nrps模塊的腺甘活化酶活性域(adenylation, a

31、) 特異性識別并活化哌可酸，以硫酯鍵形式與肽酰基載體蛋白( peptidyl carrier protein， pcp)活性域結(jié)合，并通過 pks/nrps雜合酶，哌可酰基上 n原子攻擊pks上合成的 聚酮鏈硫酯鍵，把哌可?；系骄弁溨?。rapp模塊含有兩個(gè)c (condensation)活性域， 第 2 個(gè) c 活性域被認(rèn)為起替代pks 的 te 硫酯酶活性域作用， 催化含哌可?；木弁渻?nèi)酯化從pks/nrps酶中水解脫離，形成前雷帕霉素(pre-rapamycin) 51,最后 經(jīng)過基因簇中編碼的氧化酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等修飾改造，形成雷帕霉素(圖10) 。2000 年 wu 等人 52從

32、產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌(streptomyces hygroscopicusatcc 14891)克隆了大約77kb 的 fk520 合成基因簇，基因簇結(jié)構(gòu)與雷帕霉素的非常相似，同樣含有3個(gè)pks編碼基因，但是分別只含有4、2、4個(gè)延伸模塊，第1個(gè)pks含有1個(gè)起始 模塊，第 2 個(gè) pks 相對雷帕霉素少4 個(gè)模塊，這與fk520 內(nèi)酯環(huán)比雷帕霉素少8 個(gè)碳相吻合。除了 fkbd 基因編碼蛋白催化 c-9 位的雙加氧形成酮基，在整個(gè)基因簇(包括上下游附近區(qū)域)沒有發(fā)現(xiàn)其它 p450氧化酶基因，證明fk520的c-13和c-15位甲氧 基不是pks后修飾形成的，而是相應(yīng)的pks第7、8模塊at活性域

33、識別a位含氧的底 物。根據(jù)基因簇中基因編碼序列同源性分析，相連的 5 個(gè)基因 fkbghijk 可能是編碼合成特殊聚酮鏈延伸底物氧甲基丙二酰-acp 的基因。 其中 fkbj 編碼 acp 載體蛋白， fkbh編碼蛋白催化糖酵解途徑中的 3 碳中間產(chǎn)物形成丙三基-acpj ，然后依次由 fkbjk、 i 和g 基因編碼蛋白催化氧化和甲基化， 形成特殊的 pks 合成底物氧甲基丙二?；?(圖 11) 。 基因簇中除催化 c-31 位羥基甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶基因 fkbm 外， 只發(fā)現(xiàn)一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶基因fkbg,因?yàn)榧谆甘且活惖孜锾禺愋院軓?qiáng)的蛋白質(zhì)，因此fkbg更有可能催化羥基丙二?；谆纬?/p>

34、模塊7 和模塊 8 共同的底物氧甲基-丙二酰 -acp ，而不是聚酮鏈合成后甲基化 c-13 和 c-15 兩個(gè)不同位點(diǎn)。 fkbghijk 基因遠(yuǎn)離 pks 一側(cè)還有多個(gè)與第 4 模塊識別底物乙基-丙二酰-coa 合成相關(guān)的基因。 33 raparapbrapcmodule 1 module 2 module 3 module 4module 5 module 6 module 7 module 8 module 9 module 10module 11 module 12 module 13 module 14dhkrdhkrcpacpatatacpatatacpktat aciacpho

35、dh krs atks aacp ksks at acp圖10雷帕霉素合成途徑34rapcrapprappmodule 11 module 12 module 13 module 14m odule nrps“er；_kr ：kr )dh> ：kr口燙p3 ：a節(jié)可切atjacp1 c|a fpcp/cc p支弋。'> oh s oh >osu ohi 1 finiho ory-<> ohmr q 3ll(i oft) (ito or圖10.m odule nrps廠、。hcia pcpl c4人/。3人產(chǎn)-t()ao ° q'<h

36、jc r oh ohh 2兒.ihahac*hpre-rapamycinf1l公“ r 5° hcy°h/o電s'。砌ho'h3c 丁人0 och3hu ukchsh3crapamycin雷帕霉素合成途徑(續(xù))36糖酵解途徑中間產(chǎn)物fkbhfkbk'fkbi'fkbgho_as.acpj hoaacp hoaacpjhjcoaacpjch2ohchocoohcooh圖11氧甲基丙二?；铣赏緩匠齠k520外目前為止，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)聚酮類微生物代謝產(chǎn)物含有 a位是氧甲基的側(cè)鏈 基團(tuán)53,如 ansamitocin p-354、geldanamycm

37、55、soraphen a leucomycin、concanamycins bafilomycin、aflastatin、oxazolomycin和tautomycin。它們的聚酮鏈合成過程都用到乙醇 酸延伸單元（glycolate unit）,產(chǎn)生含甲基化的羥基側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。與其它 at識別底物均為 ?；?coa不同，乙醇酸延伸單元是與 acp載體蛋白結(jié)合，被at位點(diǎn)識別56。實(shí)驗(yàn)表明標(biāo)記的丁?；軌蛘系?fk520的c-21乙基側(cè)鏈，說明模塊4特異性底 物是乙基-丙二酰-coa。推測鏈霉菌菌絲生長期累積的聚羥基丁酸酯（ phb）和聚羥基 脂肪酸酯（pha）可能在fk520合成過程提供丁酰基

38、-coa,序列同源性分析發(fā)現(xiàn)分布 于合成基因簇兩側(cè)的fkbs、fkbu、fkbe和一個(gè)未被發(fā)現(xiàn)的酰基-coa竣化酶基因以及產(chǎn) 生菌胞內(nèi)的輔酶a連接酶可能與催化phb合成乙基-丙二酰-coa相關(guān)（圖12）。3-羥基 -丁酰-coa也可以由初級代謝產(chǎn)物乙酰乙酰-coa還原而來，但在fk520產(chǎn)生菌中phb解聚途徑可能是主要來源。乙基丙二酰-coa?；?coa竣化酶scoa 42圖12 fk520模塊4延伸單元乙基丙二酰-coa合成途徑對fk506合成機(jī)制的了解更多的是基于 fk520的研究結(jié)果。1998年，motamedi 等人57報(bào)道從fk506產(chǎn)生菌streptomycessp. ma6548

39、中克隆部分合成基因簇，與fk520 相似，含有3個(gè)pks編碼基因fkba、fkbb和fkbc,三個(gè)基因編碼蛋白按照 bca順序 組成完整的fk506聚酮鏈合成酶，從n端到c端3個(gè)亞基分別包含4、2、4個(gè)pks模 塊，總共51個(gè)功能活性域，比雷帕霉素pks少4個(gè)模塊，因此其內(nèi)酯環(huán)相應(yīng)少8個(gè)碳 單位。其中第3、10模塊識別底物是丙二酰輔酶 a,第1、2、5、6和9模塊識別的是 甲基丙二酰輔酶a,相應(yīng)位點(diǎn)形成甲基側(cè)鏈，但第7、8模塊利用的是氧甲基丙二酰-acp 還是丙二酰-coa,并沒有合成基因的支持，內(nèi)酯環(huán)上 c-21位烯丙基是如何合成的也沒 有深入的研究，直到 2010年goranovic等人5

40、8報(bào)道克隆了 streptomyces tsukubaensis nrrl 18488菌株完整的fk506合成基因簇，發(fā)現(xiàn)在fk520乙基丙二酰-coa合成相關(guān) 基因的相應(yīng)位置，存在一個(gè)由9個(gè)編碼基因構(gòu)成的稱為“ all”的亞基因簇，基因敲除和 添加前體物實(shí)驗(yàn)證明該亞基因簇負(fù)責(zé)合成fk506第4模塊特殊的5碳延伸單元烯丙基-丙二酰-coa,序列分析發(fā)現(xiàn)它形成一個(gè)新的二酮合酶復(fù)合體，從合成基因水平解析了 fk506的c-21位側(cè)鏈的生物合成途徑，糾正了原來一直認(rèn)為第4模塊利用的是內(nèi)基-丙二酰coa延伸單元，聚酮鏈合成后再對側(cè)鏈內(nèi)基進(jìn)行氧化修飾為烯丙基的假設(shè)。2011年 noon 等人 59系統(tǒng)研

41、究了 3 株 fk506 產(chǎn)生菌 streptomycessp. atcc 55098 （ma6858）, streptomyceskanamyceticuskctc 9225和 streptomycessp. kctc 11604bp 的合成基因 簇，發(fā)現(xiàn)與 fk520 產(chǎn)生菌 s. hygroscopicusvar. ascomyceticusatcc14891 合成基因簇有 15個(gè)連續(xù)排列的基因完全相同，它們是 pks/nrps基因（fkbc、b、p和 a）、 methoxymalonyl-acp合成基因（fkbg、h、i、j、k）、哌可酸合成基因fkbl、起始模塊 底物 dhchc 合

42、成相關(guān)基因 fkbo、31-o-methyltransferase基因 fkbm、c-9 hydroxylase 基因fkbd、調(diào)控基因fkbn和1個(gè)ii型硫酯酶基因fkbq,它們在基因簇中是保守的。fk520 模塊4延伸單元乙基丙二酰-coa合成相關(guān)基因有3個(gè)（fkbe、s、u）,分別散落位于 fk520合成基因簇的兩側(cè)，在所有fk506產(chǎn)生菌基因簇中均沒有發(fā)現(xiàn)這些基因。上述3株fk506產(chǎn)生菌的合成基因簇中只有 4個(gè)連續(xù)排列的基因（tcsa、tcsb、tcsc和tcsd） 在所有基因簇中均存在，推測只有這 4個(gè)基因與模塊4延伸單元合成有關(guān)。進(jìn)一步研究 發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因編碼蛋白是一種新的聚酮合

43、酶，其中 tcsa基因編碼?；D(zhuǎn)移酶（at） 和酰基載體蛋白（acp）活性域，tcsb編碼2個(gè)不常見的代酮基合酶（ks）,這種結(jié)構(gòu)形式與ii型pks相似。tcsc與巴豆酰-coa竣化酶/還原酶同源性達(dá)60%,可能催化烯 ?；?coa的竣化還原，tcsd與?；?coa脫氫酶具有大約70%的序列相似性，但是在 基因簇附近沒有發(fā)現(xiàn)催化伊酮基還原的酶編碼基因（酮基還原酶和脫水酶），因此推測&烯鍵的形成可能與胞內(nèi)脂肪酸合成酶（fas）系統(tǒng)共享合成途徑（圖13）。streptomycessp. kctc 11604bp合成基因簇中還含有 5個(gè)未知基因（tcs1、tcs2、tcs3、tcs4和tcs

44、5）（goranovic等人報(bào)道的 streptomyces tsukubaensinrrl 18488 基因簇中 allm、n、p、。和s）,基因敲除證明這些基因與 fk506合成無關(guān)。36,37-二氫-fk506tcsc /fk506圖13 fk506模塊4延伸單元烯丙基-coa合成途徑綜上，fk506聚酮鏈合成使用了莽草酸衍生物 dhchc （起始模塊）、2個(gè)丙二酰-coa （模塊3、10）、5個(gè)甲基-丙二酰-coa （模塊1、2、5、6和9）、2個(gè)氧甲基-丙二酰-acp （模塊7、8）以及1個(gè)丙烯基-丙二酰-coa （模塊4）（圖14）。由于模塊4的?；D(zhuǎn)移 酶活性域（at）底物特異性

45、較低，除烯丙基丙二酰-coa外，還可識別甲基丙二酰-coa、 乙基丙二酰-coa和丙基丙二酰-coa等pks延伸底物，因此fk506產(chǎn)生菌一般還會產(chǎn) 生c-21位為甲基、乙基或者是丙基的 fk523、fk520和36, 37-二氫fk506等同系物， 給發(fā)酵下游提取純化帶來很多困難。fk520產(chǎn)生菌由于沒有合成5碳?；由靻卧暮?成基因，細(xì)胞內(nèi)只有甲基丙二酰-coa和乙基丙二酰-coa可被模塊4的at位點(diǎn)識別， 因此往往產(chǎn)生fk523副產(chǎn)物，而不會產(chǎn)生fk506或36, 37-二氫fk506等同系物。al)h( h(l-pipeuolic acidcoohallylmalonyl-coaco

46、scoa1hnm/ pcocoaushmalonvht'oa vi 1johh"coficoa(2s hmeth ylinalo ii vl -col v(jveolvtic*rpalhu ;ivfkbg, il l j and k44intermediate圖14 fk506合成途徑(根據(jù) yeo joon yoon, et al. j ind microbiol biotechnol, 2009, 36:1473 -1482 修正)2006年 he60和 sun 61等人先后從不同的 meridamycin 產(chǎn)生菌 streptomycessp. nrrl 30748 和

47、 streptomyces sp. dsm 4137 基因組中克隆了 meridamycin 合成基因簇。streptomycessp. nrrl 30748合成基因簇位于117kb dna序列中，其中75kb左右序列 編碼pks和nrps基因，與雷帕霉素、fk506和fk520基因簇不同，負(fù)責(zé)哌可酰基整 合到聚酮鏈的 nrps 基因位于 pks 上游，而不是在pks 不同亞基編碼基因中間，meridamycin的pks基因共有4個(gè)orf,第1個(gè)亞基含起始模塊和其它3個(gè)模塊，第2 亞基含完整的 4 個(gè)模塊， 第 3 亞基含完整的 5 個(gè)模塊和 13 模塊的 ks 活性域， 第 4 個(gè)亞 基含1

48、3模塊的at、dh、er、kr和acp5個(gè)活性域以及完整的14模塊。這種同一模 塊夸基因的編碼形式在天然產(chǎn)物編碼基因中尚不多見， 同時(shí)發(fā)現(xiàn)第 3 亞基 merc 的 c 端 和第 4 亞基 merd 的 n 端的多肽連接序列較長，可能是保證夸亞基組裝完整的 13模塊 所必須的。另外一個(gè)不同，在雷帕霉素、 fk506 和 fk520 基因簇的 pks 中均有發(fā)現(xiàn)沉 默活性域， 如雷帕霉素模塊 3 含有 dh/er/kr 活性域， 但卻沒有活性， 在終產(chǎn)物相應(yīng)位置酮基沒有發(fā)生還原反應(yīng)，而meridamycin 的 pks 則沒有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。 14 個(gè)模塊的at 識別底物分別是丙二酰輔酶a （模塊

49、3、 8、 9、 11 和 12） 、甲基丙二酰輔酶a （模塊1、 2、 5、 6、 7、 10 和 13）和乙基丙二酰輔酶a （模塊 4） 。 4 個(gè) pks 編碼基因轉(zhuǎn)錄方向相同，且排列順序與聚酮鏈合成順序一致，同上游nrps 基因及下游細(xì)胞色素 p450單氧化酶基因 mere 可能形成一個(gè)大約78kb 大小的大轉(zhuǎn)錄子。sun等人在研究1株能夠同時(shí)產(chǎn)生elaiophylin （洋橄欖葉素）、nigericin （尼日利亞 菌素） 、 abierixin 、 meridamycin 等多種聚酮類和多肽類次級代謝產(chǎn)物的多能鏈霉菌streptomycessp. dsm 4137時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌株至少

50、含有 11個(gè)具有模塊結(jié)構(gòu)的 pks和多個(gè)芳香類聚酮合酶以及非核糖體肽合成酶， 其中一個(gè)約 95kb 的基因簇結(jié)構(gòu)與meridamycin合成基因完全相似， dsm 4137合成基因簇僅含有5個(gè)與 meridamycin 合成相關(guān)基因，分別是哌可酰基整合酶基因 merp、3個(gè)連續(xù)的pks基因（mera、merb和merc）以及 1個(gè)細(xì)胞色素p450蛋白merd,其中merc編碼的pks含6個(gè)模塊，經(jīng)深入分析，認(rèn)為 上述 he 報(bào)道的 nrrl 30748 菌株 merc 和 merd 基因在測序和拼接時(shí)可能有誤， 應(yīng)該是連續(xù)編碼基因。 dsm 4137菌株的 meridamycin 基因簇組成簡

51、單，未發(fā)現(xiàn)如調(diào)控基因、哌可酸合成酶基因、乙基丙二?；铣上嚓P(guān)基因等，可能是因?yàn)樵摼甑亩喙δ苄裕谄渌x產(chǎn)物合成基因簇存在的相關(guān)基因能夠?qū)崿F(xiàn)共享。此類化合物的內(nèi)酯環(huán)聚酮鏈和哌可酰基骨架（圖15）都是通過pks/nrps雜合的模塊結(jié)構(gòu)硫模版合成機(jī)制催化合成的， 最后由nrps的縮合活性域催化內(nèi)酯化并從硫模 版上解離。目前已有至少8株不同鏈霉菌的此類化合物合成基因簇被克隆、 分析（圖16） c（從上到下依次為：雷帕霉素、fk506、fk520、meridamycin、antascomicins 和nocardiopsins聚酮鏈骨架。粉色為起始單元，藍(lán)色為延伸單元，紅色是哌可?；﹫D15微生物來

52、源的含氮大環(huán)內(nèi)酯類化合物硫模版機(jī)制合成的內(nèi)酯環(huán)骨架4740so607011o1o2030(peter f. leadlay 等,1995)krdmn posghijk lallylmalonyl-snac methoxymalonyl-acpextender unit related genes related genesfkbcfkbbfkbpfkbafkbo51(hrvoje petkovic 等，2010)a :雷帕霉素(s. hygroscopicus nrrl 5491 ); b: fk506 (s. tsukubaensisnrrl 18488 )圖16不同含氮大環(huán)內(nèi)酯類產(chǎn)生菌合成

53、基因簇結(jié)構(gòu)tcsatkbg fkb/ fkbk fkbj fkblfkbd 段bm fkbn fkbqfkbr2 tkbe fkbg fkbi fkbkfkbw fkbu fkbr1 fkbf tm)h承j&j fkbl pks fkbd fkbm fkbn tkbq thbsgenes responsibile for ailylrnalonybcca (9)bkjsynthestsother genesertesponsibleformettioxymalonylacp biosyrtliesisgenes encoding polykelide synthase (pks)gen

54、es responsible forregulatiora gene ericdding type ii thioesterasageres responsible for ethyl ma lonyl- coa txcsyrrfhesis(yeo joon yoon 等,2011)c: fk506 (streptomyces sp. kctc 11604bp); d： fk506 (streptomyces sp.atcc 55098 (ma6858), streptomyces kanamyceticus kctc 9225 );e: fk520 ( s. hygroscopicus va

55、r. ascomyceticus atcc14891)圖16不同含氮大環(huán)內(nèi)酯類產(chǎn)生菌合成基因簇結(jié)構(gòu)（續(xù)一）a gene respons ble for starter un tgenes responsible fcr post-pksbiosytthesistailorirrgklioi2d3d4050607080ii9010di11dmers中刖例鵬悴non ribosomal pfpfroe synthasepolyketide synthaseregulatory proi ehmembrane protein 'transporierffil methyl trwsferasjep45ui mohoomyg l h alsugar metabolisme?e proteins involved in pfumwry metabolism| utlkrioml function(min he 等，2006)個(gè)，叩甲，的，彳。809。 100kbpmerdat-richnon-codingregion(stephen f. haydock 等,2006)f: m