轉(zhuǎn)基因植物分子檢測(cè)技術(shù)

1、轉(zhuǎn)基因植物分子檢測(cè)技術(shù)姜桐桐,2，黃鳳蘭1,2*，陳曉鳳1,2，趙永1,2，李佳會(huì)1,2，周婷婷1，常旭豐1，劉佳琪1（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院.內(nèi)蒙古通遼 028000； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心.內(nèi)蒙古通遼 028000 3內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.內(nèi)蒙古 通遼 028000）摘要：分子生物學(xué)和植物基因工程技術(shù)不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因分子檢測(cè)技術(shù)也得到不斷發(fā)展，本文介紹了外源基因整合的檢測(cè)技術(shù)和外源基因表達(dá)的檢測(cè)技術(shù)，細(xì)致的描述了每種檢測(cè)技術(shù)的原理和優(yōu)缺點(diǎn)。關(guān)鍵詞：分子檢測(cè)技術(shù)；轉(zhuǎn)基因植物；原理Transgenic plant molecular detection

2、 technologyTongtong jiang1.2 Fenglang Huang1.2 * xiaofeng chen1.2 Yong Zhao1.2 Jiahui Li1.2Tingting Zhou1 Xufeng Chang1 Jiaqi Liu1(1. College of Life Science, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao city，028000；2.Inner Mongolia RegionIndustrial Engineering Research Center of Univer

3、sities for Castor, Tongliao city，028000；3 The Inner Mongolia autonomous region castor breeding, key laboratory of colleges and universities, Tongliao city，028000）Abstract:With the continuous development of molecular biology and plant gene engineering and transgenic molecular detection technology dev

4、elopment, this paper introduces the foreign gene integration testing technology and exogenous gene expression detection technology, detailed describes the principle and advantages and disadvantages for each testing technology.Keywords:molecular detection technology; The transgenic plants; The princi

5、ple of作者簡(jiǎn)介：姜桐桐（1991年2月），女，在讀碩士，E-mail通訊作者：黃鳳蘭(1973-)，女，山東菏澤，教授，博士，研究方向?yàn)楸吐榉肿佑N。E-mail：huangfenglan2008.項(xiàng)目基金：內(nèi)蒙古民族大學(xué)研究生科研資助項(xiàng)目（NMDSS1467）、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30760123； 31160290；31460353）、內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?！扒嗄昕萍加⒉胖С钟?jì)劃”（NJYT-14-A10）、內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導(dǎo)項(xiàng)目、內(nèi)蒙古自治區(qū)“草原英才” 計(jì)劃項(xiàng)目、市校合作項(xiàng)目（SXZD2012018；SXZD2012017；SXZD2012006）

6、 近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)技術(shù)日趨成熟，多角度的多方面的檢測(cè)方向分別從DNA、RNA、蛋白質(zhì)來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)論從外源基因整合的方向，還是外源基因表達(dá)的方向，都能檢測(cè)出正確的結(jié)果。（一）外源基因整合的檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)和功能鑒定尤為重要。對(duì)于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，我們主要是對(duì)是否為轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)的什么成分。檢測(cè)主要針對(duì)外源基因整合的檢測(cè)，常采用PCR檢測(cè)和Southern雜交。PCR由Mulhs等人于1985年發(fā)明1,1988年由于耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn),使PCR走向?qū)嵱秒A段,Mulhs因發(fā)明PCR獲1993年諾貝爾獎(jiǎng)。1 PCR檢測(cè)基本原理:PCR反應(yīng)的成分是模板DNA(待擴(kuò)增DNA)、引物、4種脫

7、氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩沖液等，過(guò)程分為四個(gè)連續(xù)的反應(yīng)，其目的是把能夠微量的遺傳物質(zhì)在數(shù)小時(shí)之內(nèi)擴(kuò)增達(dá)到檢測(cè)水平，進(jìn)而完成分析和檢測(cè)。PCR技術(shù)的基本原理是:第一個(gè)階段是在9394 高溫條件下將DNA 模板變性，即模板變性解鏈；第二個(gè)階段是退火2，即我們?nèi)斯ず铣傻纳?、下游引物與模板 DNA 鏈 3端經(jīng)降溫至 55 退火；第三個(gè)階段是延伸，即4種脫氧核苷酸(dNTPs)同時(shí)存在的情況下，借助Taq DNA 聚合酶的作用，引物鏈將沿著 5-3方向延伸與模板互補(bǔ)的新鏈。此次循環(huán)過(guò)后，合成新鏈可將其作為 DNA 模板繼續(xù)反應(yīng)，由此循環(huán)進(jìn)行。循環(huán)進(jìn)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物增加，我們所需要的D

8、NA產(chǎn)物可達(dá)到l00 萬(wàn)200 萬(wàn)倍3。PCR 反應(yīng)的原理簡(jiǎn)單，但是具體的操作是復(fù)雜的，各種條件對(duì)PCR反應(yīng)具有很大的影響，如退火溫度的確定、延伸時(shí)間的長(zhǎng)短以及循環(huán)數(shù)等。因此，不同的反應(yīng)體系應(yīng)該確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，以避免假陰性或假陽(yáng)性等情況的產(chǎn)生。1.2 優(yōu)缺點(diǎn)：常規(guī)PCR對(duì)技術(shù)和設(shè)備的要求不高，操作簡(jiǎn)便，成本低，不需要同位素比較，可以保持所檢測(cè)的目的基因的完整性，它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn),是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。但是，由于常規(guī)PCR因?yàn)楦鞣N條件的差異會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性，靶序列或擴(kuò)增序列的交叉污染的現(xiàn)象等，最終出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異，

9、因此，對(duì)待常規(guī)PCR結(jié)果，應(yīng)作為轉(zhuǎn)基因植物初選的依據(jù)。2 Southern雜交 DNA重組技術(shù)中Southern印跡雜交是采用特定的方法研究DNA圖譜的基本技術(shù),在醫(yī)學(xué)和PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。2.1 原理 Southern雜交目的是為了檢測(cè)DNA樣品中含有的特定DNA序列。用DNA限制酶將DNA分子狀態(tài)切割成小分子，利用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA分子，又稱凝膠電泳壓印雜交技術(shù),該方法利用硝酸纖維膜或?yàn)V紙或尼龍膜等具有吸附DNA的功能,先將DNA片段作凝膠電泳,并將電泳后的DNA區(qū)帶吸附到膜上,然后直接在膜上進(jìn)行同位素標(biāo)記探針與被測(cè)DNA之間的雜交,最后通過(guò)放射自顯影對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè),

10、以此探測(cè)一個(gè)DNA樣品中含有的特定DNA序列。 Southern雜交是分析基因結(jié)構(gòu)或檢測(cè)DNA中是否含有特定序列的有效技術(shù)之一,根據(jù)探針標(biāo)記的種類(lèi)不同，可分為同位素標(biāo)記和非同位素標(biāo)記兩大類(lèi)3。此種方法是在DNA水平上，對(duì)外源基因是否轉(zhuǎn)入并整合到植物染色體的經(jīng)典方法。因?yàn)橥庠椿蛟谵D(zhuǎn)基因植物基因組中的排布形式和載體骨架的整合方式與外源基因的遺傳穩(wěn)定性和生物安全性密切相關(guān),而Southern雜交能夠分析T-DNA和載體骨架的不同區(qū)段在轉(zhuǎn)基因生物基因組中的整合與排列方式,以及多拷貝外源基因在轉(zhuǎn)基因生物基因組的整合及遺傳行為。Southern 雜交獲得的信號(hào)強(qiáng)度取決于若干因素，包括固定的 DNA 與探

11、針互補(bǔ)的比例、探針的大小及特異活性以及轉(zhuǎn)移到膜上的基因組 DNA 的數(shù)量4。 Southern雜交又被稱作為凝膠電泳牙印雜交技術(shù)，基本原理是將DNA片段用特定的限制性內(nèi)切酶處理后進(jìn)行凝膠電泳，電泳后的DNA區(qū)段吸附在膜上，在膜上進(jìn)行探針與被測(cè)DNA之間的雜交，探針的制備可以是純化的DNA片段或寡核苷酸片段(短寡核苷酸可以用T4多聚核苷酸激酶行末端標(biāo)記)或放射性同位素標(biāo)記。放射性同位素標(biāo)記的探針靈敏度較高, 但存在半衰期限制,對(duì)操作者和環(huán)境會(huì)造成放射性輻射危害。因此，使用非同位素標(biāo)記探針可避免放射性危害。最后，通過(guò)自顯影對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，由此能夠判斷出DNA序列。進(jìn)而探測(cè)出一個(gè)DNA樣品中含有

12、的特定DNA序列。2.2 優(yōu)缺點(diǎn):Southern 雜交技術(shù)特異性強(qiáng)，靈敏性高，可應(yīng)用于檢測(cè)樣品中 DNA 及其含量，了解基因的狀態(tài)，如是否存在點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等,可清除操作過(guò)程中的污染以及假陽(yáng)性信號(hào)，準(zhǔn)確度高。缺點(diǎn)是雜交程序復(fù)雜，成本高，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)條件要求較高，試劑盒在6000元以上。（二）外源基因表達(dá)的檢測(cè) 這種檢測(cè)分為兩大類(lèi)，一類(lèi)數(shù)用探針檢測(cè)mRNA;第二類(lèi)是用抗體檢測(cè)出表達(dá)的蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)特異mRNA的檢測(cè)和翻譯水平上對(duì)特異蛋白質(zhì)的檢測(cè)）1 Northern印跡雜交 1.1 原理：1977 年，Alwine 5等首次運(yùn)用印跡技術(shù)檢測(cè) RNA，這種與 DNA 印跡技術(shù)相對(duì)應(yīng)的 RN

13、A 印跡技術(shù)被稱為 Northern 印跡雜( Northernblot) 。Northern 雜交只需要利用一段單鏈 cDNA 分子探針便可以檢測(cè)和測(cè)量不同長(zhǎng)度的 RNA 分子，所以很快就得到了廣泛運(yùn)用6。RNA印跡雜交正好與DNA相對(duì)應(yīng)，是將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法，此檢測(cè)方法，進(jìn)樣前用的是甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不是用NaOH，因?yàn)闀?huì)水解RNA的2'-羥基基團(tuán)，變性后的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，膠中不能添加EB，會(huì)影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合吸印轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，轉(zhuǎn)印后用低鹽緩沖液洗脫,否則RNA會(huì)被洗脫，然后進(jìn)行雜交。若需要測(cè)定片段的

14、大小，可在同一塊膠上加分子量標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物切下、上色、照相,樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印。最后結(jié)果的判定，可以是按Sambrook等7的方法進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、洗膜及放射自顯影,放射自顯影底片通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析儀掃描得到結(jié)果。1.2 優(yōu)缺點(diǎn)：Northern雜交靈敏度極高，更接近性狀表現(xiàn)，更有現(xiàn)實(shí)意義，應(yīng)用廣泛。但是對(duì)RNA提取條件嚴(yán)格，在材料內(nèi)含量不如DNA高，不適合于大批量樣品的檢測(cè)，并且其所需藥品具有毒害作用，對(duì)研究人員有很大傷害。 2 熒光定量PCR技術(shù)2.1 原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。運(yùn)用該技術(shù)，可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行定量和定性分析

15、8。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法9。熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)了PCR反應(yīng)從定性到定量的過(guò)程，是在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中添加熒光基團(tuán)，熒光基團(tuán)中受體發(fā)色團(tuán)之間偶極相互作用，能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán)，通過(guò)熒光定量的傳遞，檢測(cè)熒光信號(hào)就可以得靶序列初始濃度，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，從而達(dá)到定量分析的目的。 2.2 優(yōu)缺點(diǎn):熒光定量PCR的定量分析，使樣品初始模板濃度實(shí)現(xiàn)了定量分析，靈敏的熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，使PCR反應(yīng)能夠進(jìn)行調(diào)節(jié)和控制，特異性好，引物或和探

16、針的特異性雜交對(duì)模板進(jìn)行鑒別，具有很高的準(zhǔn)確性，假陽(yáng)性低;靈敏度高，誤差小;操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，整個(gè)擴(kuò)增和檢測(cè)都是在閉管的情況下進(jìn)行，不需要開(kāi)蓋，交叉污染和污染環(huán)境機(jī)會(huì)少。3 Western雜交3.1 原理:Western雜交(westernblotting)是一種檢測(cè)固定在基質(zhì)上的蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)方法,也稱為蛋白印跡或免疫印跡(Immuno一blotting)。它根據(jù)蛋白質(zhì)分子量進(jìn)行電泳分離,可以有效地用來(lái)鑒定某一蛋白質(zhì)的性質(zhì)、定量分析小分子抗原、篩選及純化抗體、分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域、檢測(cè)(轉(zhuǎn))基因表達(dá)結(jié)果等10。這種檢測(cè)是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定融為一體的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。基本原理是將

17、檢測(cè)的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，再把目的蛋白原位固定在固相膜上，同時(shí)將膜放入高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，封閉非特異性位點(diǎn)，再轉(zhuǎn)移到濾膜上，最后在印跡上用特定抗體(一抗)與目的蛋白(抗原)雜交，再加入能與一抗專(zhuān)一結(jié)合的標(biāo)記二抗，最后通過(guò)二抗上的標(biāo)記化合物的性質(zhì)進(jìn)行檢出。最后我們可以根據(jù)檢測(cè)的結(jié)果，推斷出蛋白是否表達(dá)，濃度以及大致的分子量。3.2 優(yōu)缺點(diǎn)：通常的檢測(cè)是在基因水平上，而此檢測(cè)方法是在翻譯水平上檢測(cè)目的基因的表達(dá)結(jié)果，能夠直接表達(dá)出目的基因的導(dǎo)入對(duì)所轉(zhuǎn)植物的影響，這就在一定程度上反映了轉(zhuǎn)基因的成敗，所以具有非常重要的意義。但是，此類(lèi)方法的缺點(diǎn)是操作煩瑣，費(fèi)用較高，不適合實(shí)際應(yīng)用

18、和批量檢測(cè)。（三）展望轉(zhuǎn)基因植物越來(lái)越多的進(jìn)入我們生活。因而轉(zhuǎn)基因植物對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康的安全性也隨之受到關(guān)注。隨著時(shí)代與科技的進(jìn)步，其發(fā)展前景是廣闊的，進(jìn)而轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)技術(shù)也會(huì)相應(yīng)的發(fā)展，雖然目前，轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)技術(shù)各有其優(yōu)點(diǎn)，針對(duì)某一種的檢測(cè)樣品有相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)，但是，每一種檢測(cè)技術(shù)也都有其不可避免的缺點(diǎn)，這就需要我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中探索與前進(jìn)，才能使轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)完善，標(biāo)準(zhǔn)化、高靈敏度、高通量、自動(dòng)化、低成本。參考文獻(xiàn)1MullisKB.Theunusualoriginofthepolymearseehainerae-tion.SeientifieAmeriean,1990,4:562 謝

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20、inhibition ofPCR at low concentrations of templateand its implications for quantitative RT-PCR J. ApplEnvironMicrobio,1998, 64(2): 6693Höltke HJ, Ankenbauer W, Mühlegger K, et al. The digoxigenin（DIG）system for non-radioactive labelling and detection of nucleic acidsJ. Cellular and Molecular Biology（Noisy-le-Grand, France）, 1995, 41（7）：883-905. 4 薩姆布魯克 J, 拉塞爾 D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南M. 3 版, 黃培堂譯.北京:北方科學(xué)出版社,2002: 492-509.5 Alwine J C，Ke