基因編輯技術(shù)的概念和原理[共41頁(yè)]

1、什什么么是是基基基基因因編編輯輯種源的限制，其程需要耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，經(jīng)歷漫長(zhǎng)的培育過(guò)程。而且不同種間的雜交很困難，育種成果很難取得突破性進(jìn)展。基基因因編編輯輯基基因因編編輯輯基基因因編編輯輯更具操作性的人工核酸酶的出現(xiàn)和技術(shù)體系的完善，基因組編輯技術(shù)獲得了飛速發(fā)展，并將靶向基因操作推向高潮，使得定點(diǎn)基因敲除、敲入變得更為簡(jiǎn)單且高效。基基因因編編胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)技術(shù)為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯新技術(shù)保留了可定點(diǎn)修飾的特點(diǎn)，可應(yīng)用到更多的物種上，效率更高，構(gòu)建時(shí)間更短，成本更低?；蛞蚓幘幓蛞蚓幘嶦J ）是一種低保真度的修復(fù)過(guò)程，斷

2、裂的DNA 修復(fù)重連的過(guò)程中會(huì)發(fā)生堿基隨機(jī)的插入或丟失，造成移碼突變使基因失活,實(shí)現(xiàn)目的基因敲除。如果一個(gè)外源性供體基因序列存在，NHEJ 機(jī)制會(huì)將其連入雙鏈斷裂DSB 位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的基因敲入。基基因因編編相對(duì)高保真度的修復(fù)過(guò)程，在一個(gè)帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會(huì)通過(guò)同源重組過(guò)程完整的整合到靶位點(diǎn)，不會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)的堿基插入或丟失。如果在一個(gè)基因兩側(cè)同時(shí)產(chǎn)生DSB，在一個(gè)同源供體存在的情況下，可以進(jìn)行原基因的替換。基基因因編編基基因因編編輯輯ZFN 由鋅指蛋白(ZFP)和 Fok核酸內(nèi)切酶組成。其中，由 ZFP 構(gòu)成的 DNA 識(shí)別域能識(shí)別特異位點(diǎn)并與之結(jié)合，而由

3、Fok構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點(diǎn)的雙鏈DNA 斷裂(DSB)。于是， 細(xì)胞可以通過(guò)同源重組(HR)修復(fù)機(jī)制和非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)機(jī)制來(lái)修復(fù) DNA。HR 修復(fù)有可能會(huì)對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修飾，而 NHEJ 修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達(dá)到基因敲除的目的。術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基因位點(diǎn)，具有較好的發(fā)展?jié)摿?。但是目前? 個(gè)方面的缺陷制約了該技術(shù)的推廣:(1)以現(xiàn)有的策略設(shè)計(jì)高親和性的ZFN，需要投入大量的工作和時(shí)間;(2)在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)ZFN 對(duì)細(xì)胞有毒性;(3)雖然三聯(lián)體設(shè)計(jì)具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應(yīng)。2.

4、 TALEN TALENs 包含兩個(gè) TALEN 蛋白, 每個(gè) TALEN 都是由 TALE array 與 Fok融合而成. 其中一個(gè) TALEN 靶向正義鏈上靶標(biāo)位點(diǎn), 另一個(gè)則靶向反義鏈上的靶標(biāo)位點(diǎn). 然后 Fok形成二聚體, 在靶向序列中間的 spacer 處切割 DNA, 造成雙鏈 DNA 斷裂, 隨后細(xì)胞啟動(dòng) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制. 針對(duì)不同的TALEN 骨架, 其最適宜的spacer長(zhǎng)度不同, 其長(zhǎng)度范圍一般為1220 bp. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, TALENs在靶向DNA時(shí), 第一個(gè)堿基為 T 時(shí)其結(jié)合效果更佳。功應(yīng)用于酵母、哺乳動(dòng)物和植物的位點(diǎn)特異性基因打靶，與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有

5、較大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，但仍然有些問(wèn)題需要解決，例如:脫靶效應(yīng)、TALEN 與基因組進(jìn)行特異結(jié)合與染色體位置及鄰近序列有關(guān)等。3. CRISPR /C等在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復(fù)序列與細(xì)菌獲得性免疫的關(guān)系。3. CRISPR /Cas9 基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)由 Cas9 核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成. 轉(zhuǎn)錄的 sgRNA 折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與 Cas9 蛋白形成復(fù)合體, 指導(dǎo) Cas9 核酸內(nèi)切酶識(shí)別特定靶標(biāo)位點(diǎn), 在 PAM 序列上游處切割 D

6、NA 造成雙鏈 DNA 斷裂, 并啟動(dòng) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制. 從不同菌種中分離的 CRISPR/Cas 系統(tǒng), 其 CrRNA(或者是人工構(gòu)建的sgRNA)靶向序列的長(zhǎng)度不同, PAM 序列也可能不同。三三種種不不同同基基因因編編輯輯新新療n構(gòu)建模式動(dòng)物n改造和培育新品種1. 基基因因上驗(yàn)證基因功能必不可少的邏輯環(huán)節(jié)，但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過(guò)復(fù)雜的打靶載體構(gòu)建、ES 細(xì)胞篩選、嵌合體動(dòng)物模型選育等一系列步驟，成功率受到多方面因素的限制。1. 基基因因的實(shí)驗(yàn)室，利用傳統(tǒng)技術(shù)敲除大鼠或小鼠身上的某個(gè)基因一般也需要1 年以上?；蚓庉嬓录夹g(shù)則不然，敲除基因高效快速，是研究基因功能的有力工具。

7、1. 基基因因1. 基基因因?qū)W院、Sangamo Biosciences、Sigma- Aldrich 等多家機(jī)構(gòu)使用ZFN 技術(shù)，成功培育出首只靶基因敲除的大鼠，而且?guī)в性撏蛔兊拇笫笏暮蟠瑯訋в性摶蛲蛔儭?. 基基常的基因片段引入細(xì)胞中替代有缺陷的基因，但這種方法難以精準(zhǔn)控制，可能產(chǎn)生很大的毒副作用?；蚓庉嬓录夹g(shù)可以精確定位，在靶位點(diǎn)進(jìn)行修正或進(jìn)行基因切除，達(dá)到基因治療的目的。2. 基基TALEN 技術(shù)清除了來(lái)自于病人線粒體內(nèi)的有病DNA。這是TALEN 首次應(yīng)用于線粒體基因的編輯，這項(xiàng)研究有望用于治療母系遺傳的線粒體病。2. 基基術(shù)能在染色體上精確定位的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)“剪切”和“粘

8、貼”基因，在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了血友病治療，避免了傳統(tǒng)基因療法帶來(lái)的插入誘變風(fēng)險(xiǎn)，首次取得了基因組編輯在基因療法上的突破。3. 構(gòu)構(gòu)建建動(dòng)物模型，對(duì)研究這些疾病的發(fā)生及其治療有著重要意義?；虼虬屑夹g(shù)是在ES 和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，模型構(gòu)建耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，且模式動(dòng)物的選擇受到ES 細(xì)胞的限制。3. 構(gòu)建模式動(dòng)物4. 改改造造和和的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源DNA 片段插入受體的基因組中，改造基因功能，使其表達(dá)優(yōu)良的性狀，獲得人類需要的品種。基因編輯技術(shù)則可以進(jìn)行定點(diǎn)修飾，達(dá)到高效定向?；蛞蚓幘幓蛞蚓幘庉嬢嫿M測(cè)序的完成，基因功能的研究成為后基因時(shí)代的重點(diǎn)。基因編輯技術(shù)既可以用正?；蛱娲蛔兓蜻M(jìn)行性狀改良和基因治療，也可以用突變基因代替正?；蜻M(jìn)行基因功能的研究?；蛞蚓幘庉嬢嬒啾龋蚓庉嫾夹g(shù)擺脫了對(duì)ES 細(xì)胞的限制，可以應(yīng)用于更多的物種，且定向修飾更加精確，效率更高，所需時(shí)間更短,得到的突變可以通過(guò)種系遺傳.其中，CRISPR系統(tǒng)可以同時(shí)進(jìn)行多靶點(diǎn)的切割，易于得到純合子突變體。基基因因編編輯輯位