本科生實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)指導(dǎo)老師：習(xí)欠云指導(dǎo)老師：習(xí)欠云實(shí)驗(yàn)十一實(shí)驗(yàn)十一外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?了解了解iptgiptg（異丙基（異丙基-d-d-硫代吡喃半乳糖）誘導(dǎo)硫代吡喃半乳糖）誘導(dǎo)的外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)的原理，掌握外源的外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)的原理，掌握外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其檢測(cè)技術(shù)?；蛟诖竽c桿菌中的表達(dá)及其檢測(cè)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 將外源基因克隆在含有將外源基因克隆在含有l(wèi)aclac啟動(dòng)子的表達(dá)載體中，讓其在大啟動(dòng)子的表達(dá)載體中，讓其在大腸桿菌中表達(dá)。腸桿菌中表達(dá)。 沒(méi)有加入沒(méi)有加入iptgiptg誘導(dǎo)劑的時(shí)候，誘導(dǎo)劑的時(shí)候，

2、laclac產(chǎn)生的阻遏蛋白與產(chǎn)生的阻遏蛋白與laclac操縱子結(jié)合，從而不能進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而只有表操縱子結(jié)合，從而不能進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而只有表達(dá)載體隨大腸桿菌的增殖和復(fù)制：當(dāng)加入達(dá)載體隨大腸桿菌的增殖和復(fù)制：當(dāng)加入iptgiptg后，阻遏蛋白不后，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，則能與操縱基因結(jié)合，則dnadna外源基因大量轉(zhuǎn)錄并高效表達(dá)。表外源基因大量轉(zhuǎn)錄并高效表達(dá)。表達(dá)的蛋白可以通過(guò)達(dá)的蛋白可以通過(guò)sds-pagesds-page（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）進(jìn)行初步鑒定。電泳）進(jìn)行初步鑒定。 laclac啟動(dòng)子：它來(lái)自大腸桿菌的乳糖操

3、縱子，是啟動(dòng)子：它來(lái)自大腸桿菌的乳糖操縱子，是dnadna分分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因( (lacilaci) )、啟動(dòng)基因啟動(dòng)基因(p)(p)、操縱基因、操縱基因(o)(o)和編碼和編碼3 3個(gè)與乳糖利用有關(guān)的個(gè)與乳糖利用有關(guān)的酶的基因結(jié)構(gòu)所組成。酶的基因結(jié)構(gòu)所組成。laclac啟動(dòng)子受分解代謝系統(tǒng)的正調(diào)啟動(dòng)子受分解代謝系統(tǒng)的正調(diào)控和阻遏物的負(fù)調(diào)控。正調(diào)控通過(guò)控和阻遏物的負(fù)調(diào)控。正調(diào)控通過(guò)cap(catabolitecap(catabolite gene gene activation protein)activation prot

4、ein)因子和因子和campcamp來(lái)激活啟動(dòng)子，促使轉(zhuǎn)來(lái)激活啟動(dòng)子，促使轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。負(fù)調(diào)控則是由調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生錄進(jìn)行。負(fù)調(diào)控則是由調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生laczlacz阻遏蛋白，該阻阻遏蛋白，該阻遏蛋白能與操縱基因結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄。乳糖及某些類(lèi)似物如遏蛋白能與操縱基因結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄。乳糖及某些類(lèi)似物如iptgiptg可與阻遏蛋白形成復(fù)合物，使其構(gòu)型改變，不能與可與阻遏蛋白形成復(fù)合物，使其構(gòu)型改變，不能與o o基因結(jié)合，從而解除這種阻遏，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄發(fā)生?；蚪Y(jié)合，從而解除這種阻遏，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄發(fā)生。 乳糖啟動(dòng)子乳糖啟動(dòng)子實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容材料：材料：大腸桿菌菌株大腸桿菌菌株dh5和和bl21以及表達(dá)載體以及表達(dá)載體pet

5、-32pet-32（+ +）主要試劑：主要試劑： lb lb平板（含平板（含5050g/mlg/ml的卡那霉素），的卡那霉素），100mmiptg,10mg/ml100mmiptg,10mg/ml的溶菌酶（的溶菌酶（10mm tris-10mm tris-hcl,ph8.0hcl,ph8.0配制）。配制）。 amp amp（氨芐青霉素）貯存液：用三蒸水配成（氨芐青霉素）貯存液：用三蒸水配成100mg/ml,100mg/ml,用用0.22m0.22m濾膜過(guò)濾除菌，分裝濾膜過(guò)濾除菌，分裝后后-20-20保存。保存。 lb lb液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：10g trptone,5g yest extr

6、act,10g nacl,10g trptone,5g yest extract,10g nacl,加去離子水定容至加去離子水定容至1000ml,1000ml,高壓滅菌，冷卻后高壓滅菌，冷卻后44保存。保存。 la la液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：10g trptone,5g yest extract,10g nacl,10g trptone,5g yest extract,10g nacl,加去離子水定容至加去離子水定容至1000ml,1000ml,高壓滅菌，待滅菌好的培養(yǎng)基溫的度降至高壓滅菌，待滅菌好的培養(yǎng)基溫的度降至6060左右時(shí)，加入左右時(shí)，加入ampamp至濃度至濃度100g/ml100

7、g/ml，44保存。保存。 lb lb固體培養(yǎng)基：在固體培養(yǎng)基：在lblb液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉至終濃度液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉至終濃度1.5%1.5%（w wv)v)，高壓滅菌，冷卻至約，高壓滅菌，冷卻至約5050后分裝如滅菌平皿中，后分裝如滅菌平皿中，凝固后凝固后44保存。保存。 la la固體培養(yǎng)基：待滅菌好的固體培養(yǎng)基：待滅菌好的lblb固體培養(yǎng)基的溫度降至固體培養(yǎng)基的溫度降至6060左右時(shí)，加入左右時(shí)，加入ampamp至終濃度至終濃度100g/ml100g/ml，搖勻后分裝入滅菌平，搖勻后分裝入滅菌平皿中，凝固后皿中，凝固后44保存。保存。 50 50tae:750mltae:750m

8、l去離子水中加入去離子水中加入242gtris,57.1ml 242gtris,57.1ml 乙酸，乙酸，nana2 2edta 37.2g,edta 37.2g,用去離子水定容至用去離子水定容至1000ml1000ml。 iptg iptg（1mol1moll):8mll):8ml去離子水溶解去離子水溶解2.3831giptg2.3831giptg后定容至后定容至10ml10ml，再用，再用0.220.22mm濾膜過(guò)濾除菌分裝入濾膜過(guò)濾除菌分裝入1.5ml eppendenf1.5ml eppendenf滅滅菌離心管中，菌離心管中，-20-20保存。保存。實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 空氣搖

9、床，生化生化陪養(yǎng)箱空氣搖床，生化生化陪養(yǎng)箱 eppendenf 5804r eppendenf 5804r 低溫高速離心機(jī)低溫高速離心機(jī) eppendenf gentrifuge 5410d eppendenf gentrifuge 5410d 臺(tái)式高速離心機(jī)臺(tái)式高速離心機(jī) eppendenf biophotometer eppendenf biophotometer mettler toledo ab204-e mettler toledo ab204-e分析天平分析天平 ts-1 ts-1脫色搖床脫色搖床 超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái) 水浴搖床水浴搖床 垂直電泳槽垂直電泳槽 凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像系

10、統(tǒng) 操作步驟操作步驟1 1 大腸桿菌大腸桿菌bl-21bl-21感受態(tài)細(xì)胞的制備。感受態(tài)細(xì)胞的制備。2 2 重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒pet-32pet-32（+ +）- -actrbactrb轉(zhuǎn)化到大腸桿菌轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl-21bl-21細(xì)細(xì)胞。胞。3 3 將含有重組表達(dá)載體將含有重組表達(dá)載體pet-pet-3232（+ +）- -actrbactrb和空表達(dá)載和空表達(dá)載體體pet-32(+)pet-32(+)的大腸桿菌的大腸桿菌bl21bl21劃線(xiàn)接種在劃線(xiàn)接種在lblb平板上，平板上，3737培養(yǎng)過(guò)夜，直至平板上生出菌落。培養(yǎng)過(guò)夜，直至平板上生出菌落。4 4 挑取單菌落至挑取單菌落至5mllb5

11、mllb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600=0.6od600=0.6左右，左右，44放置過(guò)夜。放置過(guò)夜。5 5 將將lb-pet-lb-pet-3232（+ +）- -actrbactrb菌液接種到菌液接種到3mlla3mlla液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，基中，3737，200rpm200rpm振搖培養(yǎng)過(guò)夜。振搖培養(yǎng)過(guò)夜。6 6 取取100l100l培養(yǎng)過(guò)夜的菌液接種到培養(yǎng)過(guò)夜的菌液接種到3mlla3mlla液體培養(yǎng)液中，液體培養(yǎng)液中，3737，200rpm200rpm振搖培養(yǎng)至振搖培養(yǎng)至od600od600至至0.6-0.80.6-0.8時(shí)，加入時(shí)，加入1m1m的的iptg,ipt

12、g,使使iptgiptg終濃度分別為終濃度分別為1mm,1mm,置置3737搖床繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)搖床繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6h6h，收集菌體置，收集菌體置-20-20保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩? 7 另取不含目的基因片段的質(zhì)粒另取不含目的基因片段的質(zhì)粒pet-32pet-32（+ +）轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化bl21bl21感感受態(tài)細(xì)胞做相同處理，加受態(tài)細(xì)胞做相同處理，加iptgiptg誘導(dǎo)誘導(dǎo)6h6h作對(duì)照。作對(duì)照。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1 1 大腸桿菌的表達(dá)水平與大腸桿菌的表達(dá)水平與iptgiptg濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、溫度以及宿濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、溫度以及宿主菌的生長(zhǎng)狀體有關(guān)。當(dāng)表達(dá)量不高時(shí)，可以調(diào)節(jié)主菌的生長(zhǎng)狀體有關(guān)。當(dāng)表達(dá)量不高時(shí)，可

13、以調(diào)節(jié)iptgiptg的的濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和溫度，甚至重新轉(zhuǎn)化。濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和溫度，甚至重新轉(zhuǎn)化。2 2 菌液的菌液的odod值要搖到值要搖到0.6-0.80.6-0.8，否則會(huì)直接影響到蛋白的表，否則會(huì)直接影響到蛋白的表達(dá)量。達(dá)量。思考題思考題1 1、哪些因素會(huì)影響大腸桿菌的表達(dá)？、哪些因素會(huì)影響大腸桿菌的表達(dá)？2 2、iptgiptg誘導(dǎo)蛋白表達(dá)原理？誘導(dǎo)蛋白表達(dá)原理？實(shí)驗(yàn)十二實(shí)驗(yàn)十二目標(biāo)蛋白的目標(biāo)蛋白的page檢測(cè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?了解蛋白質(zhì)分離純化及檢測(cè)方法了解蛋白質(zhì)分離純化及檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 不同的蛋白質(zhì)分子具有不同的電荷和分子量。蛋白質(zhì)在強(qiáng)陰不同的蛋白質(zhì)分子具有不同的電

14、荷和分子量。蛋白質(zhì)在強(qiáng)陰離子去污劑離子去污劑sdssds與某一還原劑（如二巰基乙醇）共同作用下并加熱與某一還原劑（如二巰基乙醇）共同作用下并加熱使蛋白質(zhì)解離后，變性的蛋白質(zhì)與使蛋白質(zhì)解離后，變性的蛋白質(zhì)與sdssds結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷，不結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷，不同的蛋白質(zhì)結(jié)合同的蛋白質(zhì)結(jié)合sdssds的量?jī)H與分子量成正比而與氨基酸的序列無(wú)關(guān)，的量?jī)H與分子量成正比而與氨基酸的序列無(wú)關(guān)，在在sds-pagesds-page電泳時(shí)，蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺中的遷移率僅僅取決于電泳時(shí)，蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺中的遷移率僅僅取決于蛋白質(zhì)的分子量。蛋白質(zhì)的分子量。 聚丙烯酰胺凝膠電泳由丙烯酰胺單體和交聯(lián)體聚丙烯酰胺

15、凝膠電泳由丙烯酰胺單體和交聯(lián)體n,nn,n-亞甲基亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑作用下，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠電泳不僅雙丙烯酰胺在催化劑作用下，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠電泳不僅具有分辨不同分子量蛋白質(zhì)的作用，還具有濃縮作用。由于不連具有分辨不同分子量蛋白質(zhì)的作用，還具有濃縮作用。由于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的sds-sds-多肽復(fù)合物全部濃縮于極小體積多肽復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力，從而提高了分辨率。采用考馬斯亮藍(lán)快速染色，可以及的能力，從而提高了分辨率。采用考馬斯亮藍(lán)快速染色，可以及時(shí)觀(guān)察電泳分離的效果。時(shí)觀(guān)察電泳分離的效果。實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑 30%30%（w w/v/

16、v）凝膠貯存液：丙烯酰胺）凝膠貯存液：丙烯酰胺29g29g，亞甲基雙丙烯，亞甲基雙丙烯酰胺酰胺1g1g，加，加ddhddh2 2o o溶至溶至100ml100ml，用新華，用新華3 3號(hào)濾紙過(guò)濾，棕色瓶號(hào)濾紙過(guò)濾，棕色瓶中中44保存，（丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套和保存，（丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套和口罩）。口罩）。 1.5mol/l ph8.8 tris-hcl 1.5mol/l ph8.8 tris-hcl、0.5mol/l ph6.8 tris-hcl0.5mol/l ph6.8 tris-hcl、10%sds10%sds、10%10%過(guò)硫酸銨、過(guò)硫酸銨、temedte

17、med。 tris-tris-甘氨酸電泳緩沖液，甘氨酸電泳緩沖液，ph8.3ph8.3，可配成，可配成5 5貯存液備用，貯存液備用，臨用前稀釋。臨用前稀釋。 工作液工作液 5 5貯存液貯存液 tris tris堿堿 25mmol 25mmol/l tris/l tris堿堿 15.1g 15.1g 甘氨酸甘氨酸 250 250mmolmmol/l/l（ph8.3ph8.3） 甘氨酸甘氨酸 94g 94g sds 0.1% 10%sds 50ml sds 0.1% 10%sds 50ml 加加ddhddh2 2o o定容至定容至1000ml1000ml 樣品處理液樣品處理液 deionized

18、water 3.8ml 0.5mol/l tris-hcl ph6.8 1.0ml0.5mol/l tris-hcl ph6.8 1.0ml gglycerol 0.8ml gglycerol 0.8ml 10% 10%（w w/v/v）sds 1.6mlsds 1.6ml 2-mercaptoethanol 0.4ml 2-mercaptoethanol 0.4ml 1% 1%（w w/v/v）bromophenol blue 0.4mlbromophenol blue 0.4ml染色液染色液 0.4% 0.4%考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)-r250-r250染色液染色液 甲醇甲醇 400ml 40

19、0ml 冰乙酸冰乙酸 100ml 100ml 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)r250 1g r250 1g 加加ddhddh2 2o o定容至定容至1000ml1000ml脫色液脫色液 甲醇甲醇 400ml 400ml 冰乙酸冰乙酸 100ml 100ml ddh ddh2 2o 500mlo 500mlsds-聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液配方聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液配方（1 1）30%30%凝膠貯備液：凝膠貯備液：29%29%丙烯酰胺，丙烯酰胺，1%1%亞甲基雙丙烯酰胺，亞甲基雙丙烯酰胺，用去離子水配制后用去離子水配制后0.450.45mm的硝酸纖維素膜過(guò)濾，的硝酸纖維素膜過(guò)濾，44避光避光保存。每隔幾個(gè)

20、與須重新配制。保存。每隔幾個(gè)與須重新配制。（2 2）10%sds10%sds：用：用200ml200ml水溶解水溶解25g25g電泳級(jí)電泳級(jí)sdssds，加熱到，加熱到6868并并用磁力攪拌器攪拌至溶解，加入濃用磁力攪拌器攪拌至溶解，加入濃hclhcl調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)phph值至值至7.27.2，再，再定容至定容至250ml250ml，室溫保存。，室溫保存。（3 3）10%10%過(guò)硫酸銨：在過(guò)硫酸銨：在5ml5ml水中溶解水中溶解0.5g0.5g過(guò)硫酸銨。（過(guò)硫酸銨。（apap，新鮮配制）。新鮮配制）。（4 4）tris-tris-甘氨酸電泳緩沖液（甘氨酸電泳緩沖液（5 5）：在）：在900ml900

21、ml去離子水中去離子水中溶解溶解15.1gtris15.1gtris堿和堿和94g94g甘氨酸，然后加入甘氨酸，然后加入50ml 10%50ml 10%電泳級(jí)電泳級(jí)sdssds貯存液，用去離子水定容至貯存液，用去離子水定容至1000ml1000ml后常溫保存。后常溫保存。（5) 25) 2sdssds凝膠上樣緩沖液：在凝膠上樣緩沖液：在40ml40ml去離子水中溶解去離子水中溶解1.211g tris1.211g tris堿、堿、20ml20ml甘油、甘油、4gsds4gsds、3.1gdtt3.1gdtt與與10mg10mg溴酚藍(lán)，溴酚藍(lán)，用用1mol/l hcl1mol/l hcl調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)

22、phph值至值至6.86.8后加入去離子水定容至后加入去離子水定容至100ml100ml，-80-80保存。保存。（6 6）考馬斯亮藍(lán)染色液：）考馬斯亮藍(lán)染色液：200ml200ml甲醇，甲醇，50ml50ml冰乙酸，冰乙酸，0.5g0.5g考考馬斯亮藍(lán)馬斯亮藍(lán)r250,250mlr250,250ml去離子水。用去離子水。用whatman1whatman1號(hào)濾紙過(guò)濾后室號(hào)濾紙過(guò)濾后室溫?zé)o限保存。溫?zé)o限保存。（7 7）脫色液）脫色液:250ml:250ml甲醇，甲醇，80ml80ml冰乙酸，冰乙酸，680ml680ml去離子水。去離子水。（8 8）1.5mol/l tris-hcl1.5mol/

23、l tris-hcl（ph8.8ph8.8）分離膠緩沖液：）分離膠緩沖液：18.165g 18.165g tristris堿，溶解于堿，溶解于40ml40ml水后用水后用1mol/l hcl1mol/l hcl調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)phph值至值至8.88.8，加，加水定容至水定容至100ml100ml后用后用0.45m0.45m濾膜過(guò)濾濾膜過(guò)濾44保存。保存。（9 9）1mol/l tris-hcl1mol/l tris-hcl（ph6.8ph6.8）積層膠緩沖液：）積層膠緩沖液：12.11g 12.11g tristris，溶解于，溶解于40ml40ml水后用水后用1mol/l hcl1mol/l hc

24、l調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)phph值至值至6.86.8，加水，加水定容至定容至100ml100ml后用后用0.45m0.45m濾膜過(guò)濾濾膜過(guò)濾44保存。保存。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作（1 1）樣品處理）樣品處理 取取1ml1ml菌液，菌液，10000rpm10000rpm離心離心1min1min，棄上清，重懸于，棄上清，重懸于5050ll去離子水，加入去離子水，加入5050ll 2 2sdssds凝膠上樣緩沖液，渦凝膠上樣緩沖液，渦旋混勻，旋混勻，100100加熱加熱10min10min，10000rpm10000rpm離心離心3min3min備用。備用。（2 2）sds-pagesds-page凝膠的制備凝膠的制備

25、 按下列配方組成配制按下列配方組成配制4ml 12%4ml 12%分離膠分離膠 12% 12%的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)sds-sds-聚丙烯酰胺凝膠分離層配方聚丙烯酰胺凝膠分離層配方 成分成分 體積體積/ml/ml 水水 1.6 1.6 30% 30%丙烯酰胺混合液丙烯酰胺混合液 1.32 1.32 1.5mol/l tris 1.5mol/l tris（ph8.8ph8.8） 1 1 10%sds 0.04 10%sds 0.04 10% 10%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨 0.04 0.04 temed 0.002 temed 0.002 一旦加入一旦加入temed,temed,混勻后立即小心將分離膠注入準(zhǔn)備

26、好的玻璃間混勻后立即小心將分離膠注入準(zhǔn)備好的玻璃間隙中，注意為濃縮膠留有足夠的空間（約隙中，注意為濃縮膠留有足夠的空間（約1 1/3/3空隙體積）。輕輕在空隙體積）。輕輕在其頂層加入其頂層加入1ml1ml去離子水，阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制作去離子水，阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制作用并磨平膠平面。用并磨平膠平面。 聚合完成之后，倒掉覆蓋在凝膠上層的水，用濾紙吸干凝膠頂聚合完成之后，倒掉覆蓋在凝膠上層的水，用濾紙吸干凝膠頂層的殘存液體。層的殘存液體。 按下列配方組成配制按下列配方組成配制1ml 5%1ml 5%濃縮膠濃縮膠 5% 5%的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)sds-sds-聚丙烯酰胺凝膠濃縮層

27、配方聚丙烯酰胺凝膠濃縮層配方 成分成分 體積體積/ml/ml 水水 0.675 0.675 30% 30%丙烯酰胺混合液丙烯酰胺混合液 0.1675 0.1675 1.0mol/l tris 1.0mol/l tris（ph6.8ph6.8） 0.125 0.125 10%sds 0.01 10%sds 0.01 10% 10%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨 0.01 0.01 temed 0.001 temed 0.001 將濃縮膠灌入分離膠上面，插入梳子，垂直放置于室溫下將濃縮膠灌入分離膠上面，插入梳子，垂直放置于室溫下 濃縮膠聚合完成后，用去離子水沖洗梳子。將凝膠放入濃縮膠聚合完成后，用去離子水沖洗梳

28、子。將凝膠放入電泳槽上，加入電泳緩沖液，小心拔出梳子。電泳槽上，加入電泳緩沖液，小心拔出梳子。（3 3）電泳）電泳 安裝好電泳槽，把電泳槽置于冰盒內(nèi)，將電極插頭與適安裝好電泳槽，把電泳槽置于冰盒內(nèi)，將電極插頭與適當(dāng)?shù)碾姌O相連。當(dāng)?shù)碾姌O相連。 開(kāi)始時(shí)電壓為開(kāi)始時(shí)電壓為60v60v，染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增加到，染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增加到90v90v，繼續(xù)電泳直到染料到達(dá)分離膠底部，斷開(kāi)電源。，繼續(xù)電泳直到染料到達(dá)分離膠底部，斷開(kāi)電源。 取下凝膠，將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)染色液中放搖床上緩取下凝膠，將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)染色液中放搖床上緩慢旋轉(zhuǎn)慢旋轉(zhuǎn)3-4h3-4h或過(guò)夜?；蜻^(guò)夜。 換掉并回收染色

29、液。用脫色液浸泡凝膠，緩慢搖動(dòng)換掉并回收染色液。用脫色液浸泡凝膠，緩慢搖動(dòng)4-8h4-8h，其間換液其間換液3-43-4次。繼續(xù)脫色，直到滿(mǎn)意為止。次。繼續(xù)脫色，直到滿(mǎn)意為止。 用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行照相和分析。用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行照相和分析。注意問(wèn)題注意問(wèn)題 （1）膠脫色不能脫的太久，雖然越脫越清楚，但脫的太久了，）膠脫色不能脫的太久，雖然越脫越清楚，但脫的太久了，弱帶就看不見(jiàn)了，膠也會(huì)變的失真，這樣的膠照出的照片是弱帶就看不見(jiàn)了，膠也會(huì)變的失真，這樣的膠照出的照片是很難被接受的。如果樣品條帶或點(diǎn)不是很濃，就不可以脫太很難被接受的。如果樣品條帶或點(diǎn)不是很濃，就不可以脫太久。但如果要拍照，最起碼要保證底色脫完全，要不然照片久。但如果要拍照，最起碼要保證底色脫完全，要不然照片效果也不會(huì)好的。效果也不會(huì)好的。 （2）如果需要長(zhǎng)時(shí)間脫色，注意要換脫色液）如果需要長(zhǎng)時(shí)間脫色，注意要換脫色液,且量要足夠且量要足夠,否否則甲醇揮發(fā)很快則甲醇揮發(fā)很快,膠容易干卷膠容易干卷.把本底脫干凈后可以把膠放水中把本底脫干凈后可以把膠放水中保存保存.半個(gè)月應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題；半個(gè)月應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題；分子克隆分子克?。洪L(zhǎng)期保存可以在水：長(zhǎng)期保存可以在水中加中加20%的甘油。也有站友