植物體細胞雜交

1、植植物物體體細細胞胞雜雜交交周周有有文文主要內容主要內容體細胞雜交研究歷程及一般概念體細胞雜交研究歷程及一般概念體細胞雜交的一般流程體細胞雜交的一般流程雜交細胞的鑒定及相關應用領域雜交細胞的鑒定及相關應用領域 細胞雜交的相關文獻細胞雜交的相關文獻4123我們從以下幾方面來探討植物體細胞雜交技術。我們從以下幾方面來探討植物體細胞雜交技術。發(fā)展歷程發(fā)展歷程v70年代，技術建立和完善優(yōu)化年代，技術建立和完善優(yōu)化 1972年獲得煙草種間體細胞雜種年獲得煙草種間體細胞雜種 1975年高年高ca高高ph加加peg融合方法，電融合法融合方法，電融合法 大量成功報道，不少為異想天開的實驗大量成功報道，不少為異

2、想天開的實驗v80年代初，由模式植物轉向農(nóng)作物年代初，由模式植物轉向農(nóng)作物/經(jīng)濟作物，經(jīng)濟作物，對稱融合到非對稱融合，創(chuàng)造新種質的技術手段對稱融合到非對稱融合，創(chuàng)造新種質的技術手段v80年代末，大量木本植物細胞融合成功的報道年代末，大量木本植物細胞融合成功的報道v90年代至今，成為一種育種手段年代至今，成為一種育種手段植物體細胞雜交的幾個重要進展植物體細胞雜交的幾個重要進展v 1960年，年，kocking用酶法制備高等植物原生質體首次獲得用酶法制備高等植物原生質體首次獲得成功；成功；v 1971年，年，takebe首次從離體煙草原生質體培養(yǎng)中獲得再首次從離體煙草原生質體培養(yǎng)中獲得再生完整植株

3、；生完整植株；v 1972年，年，carlson首次獲得粉藍煙草和郎氏煙草的細胞雜首次獲得粉藍煙草和郎氏煙草的細胞雜種，這是第一個植物體細胞雜種；種，這是第一個植物體細胞雜種；v 1974年，年，kao將聚乙二醇（將聚乙二醇（peg）誘導融合法應用于植物誘導融合法應用于植物細胞融合并建立了相應的融合技術；細胞融合并建立了相應的融合技術；v 1978年，年，melchers獲得第一個屬間體細胞雜種（番茄獲得第一個屬間體細胞雜種（番茄馬鈴薯）；馬鈴薯）；v 1981年，年，zimmerman發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電融合概念；融合概念；v 1987年，年，schw

4、eiger建立了單對原生質體電融合技術程序。建立了單對原生質體電融合技術程序。體細胞雜交的一般概念體細胞雜交的一般概念v 體細胞雜交，即原生質體融合，將兩個體細胞雜交，即原生質體融合，將兩個不同親本的原生質體，經(jīng)人工誘導融合并不同親本的原生質體，經(jīng)人工誘導融合并培養(yǎng)再生成株的過程，統(tǒng)稱為體細胞雜交培養(yǎng)再生成株的過程，統(tǒng)稱為體細胞雜交（a a + + b b）。 根據(jù)概念，在理論上任何細胞都可能通過體細根據(jù)概念，在理論上任何細胞都可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質資源的胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。開發(fā)和利用具有深遠的意義。v融合過程不存在有性

5、雜交過程中的種性隔離機制融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質交換提供了有的限制，為遠緣物種間的遺傳物質交換提供了有效途徑。效途徑。v體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞含有來自雙親的核外體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體綠體、線粒體dna亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。核外遺傳系統(tǒng)。體細胞雜交與有性雜交的異同體細胞雜交與有性雜交的異同比較內容比較內容體細胞雜交體細胞雜交有性雜交有性雜交時間時間無季節(jié)限制無季節(jié)限制花期限制，特別是母本花

6、期限制，特別是母本的花期的花期親緣關系親緣關系一定程度上可以克服有一定程度上可以克服有性性/嫁接不親和性嫁接不親和性受親和性影響受親和性影響結果結果細胞核、細胞質均可以細胞核、細胞質均可以重組、倍性增加重組、倍性增加雙受精，一般無細胞質雙受精，一般無細胞質重組，倍性不改變重組，倍性不改變幾種不同的表述：幾種不同的表述： 體細胞雜交：體細胞雜交：somatic hybridization 細胞融合：細胞融合：cell fusion 原生質體融合：原生質體融合：protoplast fusion 無性雜交：無性雜交：asexual hybridization 超性雜交：超性雜交：parasexua

7、l hybridization 超性融合：超性融合：parasexual fusion 細胞操作：細胞操作：cell manipulation 細胞工程（細胞工程（cell engineering）體細胞雜交步驟：體細胞雜交步驟：1 原生質體的制備原生質體的制備2 原生質體的融合原生質體的融合3 雜種細胞選擇雜種細胞選擇4 雜種細胞培養(yǎng)雜種細胞培養(yǎng)5 由愈傷組織再生植株由愈傷組織再生植株6 雜種植株的鑒定雜種植株的鑒定植物體細胞雜交技術的過程：植物體細胞雜交技術的過程：雜交的兩個細胞雜交的兩個細胞用纖維素酶、果膠酶處用纖維素酶、果膠酶處理細胞壁理細胞壁原生質體、原生質體、經(jīng)離心、振經(jīng)離心、振動

8、、電刺激動、電刺激用聚二乙醇用聚二乙醇（）（）誘導誘導融合后的原生質體融合后的原生質體再生細胞壁再生細胞壁雜種細胞雜種細胞脫分化脫分化細胞分裂細胞分裂愈傷組織愈傷組織雜種植株雜種植株再分化再分化（植物體細胞（植物體細胞融合完成的標融合完成的標志）志）植植物物細細胞胞融融合合植物植物組織組織培養(yǎng)培養(yǎng)植物細胞植物細胞a植物細胞植物細胞b去壁去壁去壁去壁原生質體原生質體a原生質體原生質體b融合融合融合的原生質體融合的原生質體ab再生細胞壁再生細胞壁雜種細胞雜種細胞ab脫分化脫分化愈傷組織愈傷組織雜種植株雜種植株再分化再分化 植植物物細細胞胞融融合合植植物物組組織織培培養(yǎng)養(yǎng)植物體細胞雜交植物體細胞雜交

9、怎樣才能去除細胞怎樣才能去除細胞壁但又不破壞細胞壁但又不破壞細胞的生命活性呢？的生命活性呢？酶解法酶解法融合的原理及常用融合的原理及常用的融合方法？的融合方法？物理方法：離心、振蕩、物理方法：離心、振蕩、電刺激電刺激化學方法：聚乙二醇（化學方法：聚乙二醇（peg）融合可能的類型？融合可能的類型？怎樣篩選雜種細胞？怎樣篩選雜種細胞？植物體細胞雜交成功的植物體細胞雜交成功的標志是什么？標志是什么？利用雜種細胞獲得雜種利用雜種細胞獲得雜種植株所依據(jù)的原理？植株所依據(jù)的原理？植物植物細胞細胞具全具全能性能性酶的酶的 專一性專一性生物膜的生物膜的 流動性流動性獲得的雜種植株是否能表獲得的雜種植株是否能表

10、現(xiàn)出人們所期望的性狀？現(xiàn)出人們所期望的性狀？雜種植株的鑒定雜種植株的鑒定雜交細胞的篩選雜交細胞的篩選細胞融合的方法及步驟細胞融合的方法及步驟聚乙二醇聚乙二醇 peg）化學方法化學方法電脈沖電脈沖物理方法物理方法生物方法生物方法細胞融合流程細胞融合流程仙臺病毒仙臺病毒(sendai virus)nano3處理高高ph-高濃度高濃度ga2+飛秒激光誘導融合飛秒激光誘導融合電融合芯片電融合芯片空間細胞融合空間細胞融合原生質體融合的有關名詞原生質體融合的有關名詞v 對稱雜種（雙親給雜種貢獻的遺傳物質均為對稱雜種（雙親給雜種貢獻的遺傳物質均為100%）v 非對稱雜種（雙親給雜種貢獻的遺傳物質不等（相對值

11、）非對稱雜種（雙親給雜種貢獻的遺傳物質不等（相對值） 胞質雜種（胞質雜種（cytoplasmic hybrid, cybrid）：）：細胞質重細胞質重組，細胞核未重組組，細胞核未重組v 對稱融合（對稱融合（symmetric fusion）v 也稱標準融合（也稱標準融合（standard fusion）v 非對稱融合（非對稱融合（asymmetric fusion）：）：融合前對一方進融合前對一方進行處理，使其染色體丟失一部分行處理，使其染色體丟失一部分原生質體融合的有關名詞原生質體融合的有關名詞-iiv供供-受體融合：受體融合：donor-recipient fusionv體配融合（體配融合

12、（gameto-somatic fusion）（）（性細性細胞與體細胞融合）胞與體細胞融合）v亞原生質體亞原生質體-原生質體融合：原生質體融合： subprotoplast-protoplast fusionv 小原生質體：小原生質體：miniprotoplastv 微原生質體微原生質體：microprotoplastv 胞質體：胞質體：cytoplastv胞質體胞質體-原生質體融合原生質體融合: cytoplast-protoplast fusion微原生質體融合微原生質體融合v 植物微原生質體融合是在此基礎上發(fā)展起來的將一種植物的一條或植物微原生質體融合是在此基礎上發(fā)展起來的將一種植物的一

13、條或幾條染色體轉移到另一種植物中的新的非對稱原生質體融合的方法。幾條染色體轉移到另一種植物中的新的非對稱原生質體融合的方法。 其原理是采用適當濃度的微核誘導劑，包含其原理是采用適當濃度的微核誘導劑，包含dna合成抑制劑和紡錘體合成抑制劑和紡錘體毒素兩大類，常用的如秋水仙素毒素兩大類，常用的如秋水仙素(col)、安磺靈、安磺靈(oryzalin)、草胺、草胺磷除草劑磷除草劑(eremart)、甲基氨草磷、甲基氨草磷(apm)、甲氨喋吟、甲氨喋吟(mtx)、氯苯、氯苯胺靈胺靈(cipc)等。等。v 這些藥劑可使正在分裂的植物細胞停留在有絲分裂中期，數(shù)小時后，這些藥劑可使正在分裂的植物細胞停留在有絲

14、分裂中期，數(shù)小時后，染色體解開螺旋，形成內含多個微原生質體的微核化細胞，每個微原染色體解開螺旋，形成內含多個微原生質體的微核化細胞，每個微原生質體內含有一條或幾條染色體，由于有絲分裂停留在中期，每條染生質體內含有一條或幾條染色體，由于有絲分裂停留在中期，每條染色體的兩個姐妹染色單體仍在一起，著絲點不分開。通過酶解去掉微色體的兩個姐妹染色單體仍在一起，著絲點不分開。通過酶解去掉微核化細胞的細胞壁獲得微核化原生質體，再用離心等技術分離出帶有核化細胞的細胞壁獲得微核化原生質體，再用離心等技術分離出帶有一條或幾條染色體的微原生質體，誘導其與完整的受體原生質體融合，一條或幾條染色體的微原生質體，誘導其與

15、完整的受體原生質體融合，從而實現(xiàn)部分基因組的轉移。從而實現(xiàn)部分基因組的轉移。v 微原生質體融合主要包括微原生質體融合主要包括3個步驟個步驟:微原生質體誘導、分離以及富集、微原生質體誘導、分離以及富集、微原生質體融合和植株再生。微原生質體融合和植株再生。 微核是細胞的染色微核是細胞的染色體發(fā)生斷裂后體發(fā)生斷裂后,細胞進細胞進入下一次分裂時入下一次分裂時,染色染色體片段不能隨有絲分裂體片段不能隨有絲分裂進入子細胞進入子細胞,而在細胞而在細胞漿中形成直徑小于主核漿中形成直徑小于主核的的,嗜色與主核一致嗜色與主核一致,完完全與主核分開的圓形或全與主核分開的圓形或橢圓形微小核橢圓形微小核 ，位于，位于細

16、胞漿中獨立于主核的細胞漿中獨立于主核的核小體，核小體，其染色同主核，其染色同主核，但比主核淡，其直徑小但比主核淡，其直徑小于主核于主核1/3，主要由外主要由外界損害因素界損害因素(生物、物生物、物理、化學理、化學)作用細胞后，作用細胞后，導致細胞染色體丟失或導致細胞染色體丟失或斷裂，從而在胞漿中形斷裂，從而在胞漿中形成成1個或數(shù)個小核個或數(shù)個小核。根據(jù)融合時細胞的完整程度，原生質體融合根據(jù)融合時細胞的完整程度，原生質體融合可分為兩大方式：可分為兩大方式：v對稱融合（對稱融合（symmetric fusion）即兩個完整即兩個完整的細胞原生質體融合。的細胞原生質體融合。v非對稱融合（非對稱融合（

17、asymmetric fusion）利用物理利用物理或化學方法使某親本的核或細胞質失活后再進行融或化學方法使某親本的核或細胞質失活后再進行融合合。 1.peg誘導融合法誘導融合法 【polyethylene glycol （peg）】 peg誘導融合的特點：優(yōu)點是融合成本低，誘導融合的特點：優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合勿需特殊設備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點是融合過程繁瑣，過程不受物種限制。缺點是融合過程繁瑣，peg可能對細胞有毒害?？赡軐毎卸竞Α?peg作用機理：作用機理： kao等認為，由于等認為，由于peg分分子具有輕微的負極性

18、，故可以與具有正極性基團子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成的水、蛋白質和碳水化合物等形成h鍵，從而在鍵，從而在原生質體之間形成分子橋，其結果使原生質體發(fā)原生質體之間形成分子橋，其結果使原生質體發(fā)生粘連進而促進原生質體融合；另外，生粘連進而促進原生質體融合；另外，peg能增能增加類脂膜的流動性，也使原生質體的核、細胞器加類脂膜的流動性，也使原生質體的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。發(fā)生融合成為可能。 在細胞工程中普遍認為聚乙二醇（peg)分子能改變各類細胞的生物膜結構，使兩細胞接觸點處質膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細胞接口處雙分子層質膜的相互親和以及彼此的

19、表面張力作用，從而使細胞發(fā)生融合，從而形成雜種細胞，培養(yǎng)該雜種細胞（細胞質雜種）可以獲得一些特殊的雜種植株。 peg融合所需試劑融合所需試劑v融合液：融合液：ph 5.6vcacl2 2h2o 810mmolvkh2po4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇甘露醇或山梨醇 0.51.0molv誘導液：融合液誘導液：融合液peg 2045v稀釋液：稀釋液：v a液（液（g/100ml）ph6.0 b液液 (g/100ml) ph10.5 葡萄糖葡萄糖 7.21 甘氨酸甘氨酸 0.375 cacl2 2h2o 0.79 naoh 0.169p1p2p1 p2混合靜止混合靜止1 min.融融 合合融合液

20、融合液加入加入peg稀稀 釋釋洗洗 滌滌加入稀釋液加入稀釋液加入培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基培培 養(yǎng)養(yǎng)選選 擇擇一般一般peg融合細胞流程融合細胞流程p1p2p1 p2混合靜止混合靜止1 min.融融 合合融合液融合液加入加入peg稀稀 釋釋洗洗 滌滌加入稀釋液加入稀釋液加入培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基培培 養(yǎng)養(yǎng)選選 擇擇nano3處理處理 1909年，年，kuster在一個發(fā)生了質壁分離的表在一個發(fā)生了質壁分離的表皮細胞中，低滲皮細胞中，低滲nano3溶液可以引起溶液可以引起2個亞原生個亞原生質體的融合。質體的融合。 缺點：異核體缺點：異核體(heterokaryon)形成頻率不形成頻率不高。高。高高ph-高濃度鈣

21、離子處理高濃度鈣離子處理 1973年，年，keller和和melchers，用強堿性，用強堿性(ph10.5)的高濃度鈣離子（的高濃度鈣離子（50mmol.l-1)溶液溶液在在37下處理約下處理約30min，兩個品系的煙草葉肉原，兩個品系的煙草葉肉原生質體很容易融合。生質體很容易融合。 但對于有些原生質體系統(tǒng)，這樣高的但對于有些原生質體系統(tǒng)，這樣高的ph值是值是有毒的。有毒的。v電融合儀的結構特點：v交變電場部分v高頻直流電擊部分電融合的基本過程：電融合的基本過程： 細胞膜的接觸：當原生質體置于電導率很低的溶細胞膜的接觸：當原生質體置于電導率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質體而不液

22、中時，電場通電后，電流即通過原生質體而不是通過溶液，其結果是原生質體在電場作用下極是通過溶液，其結果是原生質體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列成串；成串； 膜的擊穿：原生質體成串排列后，立即給予高膜的擊穿：原生質體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質膜擊穿，從而導致兩頻直流脈沖就可以使原生質膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起并圓球化。個緊密接觸的細胞融合在一起并圓球化。 關于融合參數(shù)：交流電壓交變電場的振幅頻率交變電場的處理時間直流高頻電壓脈沖寬度脈沖次數(shù) 細胞電融合過程中細胞電融合過程中,細細胞排隊、電穿孔

23、和電融合胞排隊、電穿孔和電融合過程都是在一定的電壓條過程都是在一定的電壓條件下完成的。因此件下完成的。因此,選擇合選擇合適的電壓信號成為了細胞適的電壓信號成為了細胞電融合過程的關鍵所在。電融合過程的關鍵所在。與電壓信號相關的參數(shù)有與電壓信號相關的參數(shù)有:電壓波形、電壓幅值、電電壓波形、電壓幅值、電壓頻率和電壓持續(xù)時間。壓頻率和電壓持續(xù)時間。飛秒激光誘導細胞融合技術飛秒激光誘導細胞融合技術v 在實驗中在實驗中,飛秒激光的中心波長為飛秒激光的中心波長為810 nm,脈沖重復頻脈沖重復頻率率100 mhz,脈沖寬度為脈沖寬度為40 fs,作用在被融合細胞上的平作用在被融合細胞上的平均功率為均功率為5

24、5 mw。v 首先使用葡聚糖酶去掉酵母細胞壁首先使用葡聚糖酶去掉酵母細胞壁,制成原生質體。在制成原生質體。在細胞融合之前加入體積分數(shù)為細胞融合之前加入體積分數(shù)為10%的聚乙二醇的聚乙二醇(peg)和和0.02 mol/l的的cacl2溶液溶液,促使原生質體細胞聚集并緊密促使原生質體細胞聚集并緊密接觸。選定緊密接觸的原生質體細胞對接觸。選定緊密接觸的原生質體細胞對,調整載物臺調整載物臺,使飛使飛秒激光聚焦在質膜緊密接觸的區(qū)域秒激光聚焦在質膜緊密接觸的區(qū)域,通過光快門控制融合細通過光快門控制融合細胞被輻照時間。實驗采用胞被輻照時間。實驗采用0.25 s的輻照時間的輻照時間,以以ccd錄像錄像系統(tǒng)監(jiān)

25、測靶細胞的融合過程。實驗表明系統(tǒng)監(jiān)測靶細胞的融合過程。實驗表明,靶細胞被曝光后靶細胞被曝光后160 min便可融合成一個細胞。便可融合成一個細胞。激光誘導細胞融合技術具有顯著的優(yōu)點，如：激光誘導細胞融合技術具有顯著的優(yōu)點，如：v 1）高度的選擇性，可以選擇任意的兩個細胞之間進行融合，）高度的選擇性，可以選擇任意的兩個細胞之間進行融合，易于實現(xiàn)特定細胞融合。易于實現(xiàn)特定細胞融合。v 2）激光作用于細胞所產(chǎn)生的應力小、定時和定位性強、損傷）激光作用于細胞所產(chǎn)生的應力小、定時和定位性強、損傷小，從而提高了融合細胞的生存能力。而且，激光參數(shù)易于控小，從而提高了融合細胞的生存能力。而且，激光參數(shù)易于控制

26、、操作方便、融合過程利于觀察，實驗重復性好。制、操作方便、融合過程利于觀察，實驗重復性好。v 3）激光操控時無菌、無毒性。激光誘導細胞融合技術也有自）激光操控時無菌、無毒性。激光誘導細胞融合技術也有自身的缺點，如：身的缺點，如： a.技術不夠成熟，需要進一步完善。技術不夠成熟，需要進一步完善。 b.設備非常昂貴。設備非常昂貴。 c.它是一種微操作技術，對實驗人員和操作技術要求高，通它是一種微操作技術，對實驗人員和操作技術要求高，通常需要專門培訓。常需要專門培訓。 同時，該技術每次只能靠人工操作一對細胞，過程繁瑣，同時，該技術每次只能靠人工操作一對細胞，過程繁瑣，工作效率極差，產(chǎn)量也很低。工作效

27、率極差，產(chǎn)量也很低。細胞電融合芯片細胞電融合芯片 在細胞電融合研究向微芯片技術領域發(fā)展過程中，微電在細胞電融合研究向微芯片技術領域發(fā)展過程中，微電極間距縮小到幾十微米，而電融合中細胞排隊（約極間距縮小到幾十微米，而電融合中細胞排隊（約100700 v/cm）與電穿孔（約）與電穿孔（約18 kv/cm）所需電場條）所需電場條件基本不變。根據(jù)電場強度與加載電壓的關系式件基本不變。根據(jù)電場強度與加載電壓的關系式e=v/d（e為電場強度，為電場強度，v為微電極兩側施加的電壓，為微電極兩側施加的電壓，d為微電極為微電極間距），如果電極間距間距），如果電極間距d=1 mm，則排隊電壓需要，則排隊電壓需要1

28、070 v，擊穿電壓則高達，擊穿電壓則高達100800 v。如果電極間距縮。如果電極間距縮小到小到d=50m，則排隊電壓需要，則排隊電壓需要0.52.5 v，擊穿電壓，擊穿電壓只需要只需要540 v。因此，當通過微加工工藝使微電極間距。因此，當通過微加工工藝使微電極間距縮小后，所需電壓信號就會大大降低，使細胞電融合系統(tǒng)縮小后，所需電壓信號就會大大降低，使細胞電融合系統(tǒng)成為可用電池供電的便攜式系統(tǒng)。由此可見，融合芯片的成為可用電池供電的便攜式系統(tǒng)。由此可見，融合芯片的研究對細胞電融合微系統(tǒng)整體的實現(xiàn)有極其重要的意義，研究對細胞電融合微系統(tǒng)整體的實現(xiàn)有極其重要的意義，將是該研究的一個重要內容，也是

29、該系統(tǒng)發(fā)展成微全分析將是該研究的一個重要內容，也是該系統(tǒng)發(fā)展成微全分析系統(tǒng)（系統(tǒng)（micro total analysis system,-tas）的基）的基礎。礎。電融合芯片缺點電融合芯片缺點v 常規(guī)電融合系統(tǒng)中異源細胞的準確配型難以實現(xiàn)與生物和化學融合方法相常規(guī)電融合系統(tǒng)中異源細胞的準確配型難以實現(xiàn)與生物和化學融合方法相比，電融合方法由于效率較高、操作簡便、對細胞無毒害、便于觀察、適于比，電融合方法由于效率較高、操作簡便、對細胞無毒害、便于觀察、適于儀器應用和規(guī)范操作，成為了主要的手段。不過，常規(guī)融合系統(tǒng)中融合配型儀器應用和規(guī)范操作，成為了主要的手段。不過，常規(guī)融合系統(tǒng)中融合配型難以控制，

30、目標配型的產(chǎn)率仍然很低。因此，細胞電融合技術的研究進入微難以控制，目標配型的產(chǎn)率仍然很低。因此，細胞電融合技術的研究進入微觀層次，希望通過微操作方法來實現(xiàn)精確的細胞操作，從而解決融合配對特觀層次，希望通過微操作方法來實現(xiàn)精確的細胞操作，從而解決融合配對特異性差的缺陷，同時提高自動化程度和融合效率。目前，顯微操作的應用雖異性差的缺陷，同時提高自動化程度和融合效率。目前，顯微操作的應用雖可以提高配型的準確度，但自動化程度和效率都很低?？梢蕴岣吲湫偷臏蚀_度，但自動化程度和效率都很低。v 現(xiàn)有電融合系統(tǒng)中微電極數(shù)目偏少，難以提高細胞融合效率現(xiàn)有的電融合現(xiàn)有電融合系統(tǒng)中微電極數(shù)目偏少，難以提高細胞融合效

31、率現(xiàn)有的電融合系統(tǒng)中融合電極一般只有少數(shù)幾對，可以同時控制和融合的細胞有限，造成系統(tǒng)中融合電極一般只有少數(shù)幾對，可以同時控制和融合的細胞有限，造成融合效率不高。融合效率不高。v 常規(guī)融合儀器中融合電壓很高，有潛在安全隱患，也不利于設備微型化現(xiàn)常規(guī)融合儀器中融合電壓很高，有潛在安全隱患，也不利于設備微型化現(xiàn)有細胞電融合儀器中電極間距一般為有細胞電融合儀器中電極間距一般為2001000m，細胞電穿孔所需電壓，細胞電穿孔所需電壓在幾百伏特以上。過高的電壓對實驗者造成不安全因素，同時，對融合后的在幾百伏特以上。過高的電壓對實驗者造成不安全因素，同時，對融合后的細胞存活率也帶來不利的影響。另外，所需電壓

32、越高，細胞融合儀設備制造細胞存活率也帶來不利的影響。另外，所需電壓越高，細胞融合儀設備制造難度也相應提高。設備研制成本很高，體積較大，難以實現(xiàn)便攜化，限制了難度也相應提高。設備研制成本很高，體積較大，難以實現(xiàn)便攜化，限制了該技術的廣泛應用。該技術的廣泛應用。v 多核融合細胞比例過高現(xiàn)有細胞電融合方法中，多細胞排列成細胞串的比多核融合細胞比例過高現(xiàn)有細胞電融合方法中，多細胞排列成細胞串的比例很高，由此帶來的一個嚴重問題是融合細胞中多核細胞（多個細胞融合而例很高，由此帶來的一個嚴重問題是融合細胞中多核細胞（多個細胞融合而成）的比例也相當高。這種細胞難以存活和分化，也大大降低了實際融合效成）的比例也

33、相當高。這種細胞難以存活和分化，也大大降低了實際融合效率。率。v 電融合芯片技術不甚完善現(xiàn)有電融合芯片技術還處于相當初級的階段，電電融合芯片技術不甚完善現(xiàn)有電融合芯片技術還處于相當初級的階段，電極數(shù)量少、細胞控制困難、融合配對準確性和融合效率難以同時得到保障，極數(shù)量少、細胞控制困難、融合配對準確性和融合效率難以同時得到保障，與其它微流控細胞研究技術的集成度也很低。與其它微流控細胞研究技術的集成度也很低。空間細胞融合技術空間細胞融合技術v 植物細胞融合過程中由于地球重力的存在植物細胞融合過程中由于地球重力的存在,有無液泡的有無液泡的原生質體密度差很大原生質體密度差很大,異源細胞融合率低。異源細胞

34、融合率低。v 20世紀世紀80年代以來年代以來,在空間材料科學的啟發(fā)下在空間材料科學的啟發(fā)下,試圖利試圖利用空間微重力條件改進細胞融合技術。用空間微重力條件改進細胞融合技術。v 空間細胞融合技術是直接為生物加工服務的空間細胞融合技術是直接為生物加工服務的,例如將抗例如將抗藥性或胞質雄性不育等細胞質基因導入另一個體細胞藥性或胞質雄性不育等細胞質基因導入另一個體細胞,有可有可能形成新的核質雜種能形成新的核質雜種;通過誘導不同種間、科屬間原生質體通過誘導不同種間、科屬間原生質體融合融合,可以打破遠源雜交不親和性可以打破遠源雜交不親和性,廣泛組合各種基因型廣泛組合各種基因型,形形成正常重力下無法獲得的

35、新型雜種植株。成正常重力下無法獲得的新型雜種植株。生物誘導融合法生物誘導融合法仙臺病毒法仙臺病毒法 仙臺病毒是一類被膜病毒，屬于附黏液病毒族，它是多仙臺病毒是一類被膜病毒，屬于附黏液病毒族，它是多形性顆粒，直徑為形性顆粒，直徑為5060 nm，由兩層磷脂組成的外膜包，由兩層磷脂組成的外膜包裹著裹著rna和蛋白質復合體，外膜上有兩種糖蛋白，一種是和蛋白質復合體，外膜上有兩種糖蛋白，一種是hana蛋白質，一種是蛋白質，一種是f蛋白質，前者具有神經(jīng)氨酸酶和血蛋白質，前者具有神經(jīng)氨酸酶和血凝活性（分子量較大），后者具有融合和溶血作用（分子量凝活性（分子量較大），后者具有融合和溶血作用（分子量較?。?。較

36、?。?。 仙臺病毒誘導細胞融合的機理是：病毒被膜上的兩種糖仙臺病毒誘導細胞融合的機理是：病毒被膜上的兩種糖蛋白可和細胞膜表面的糖蛋白發(fā)生相互作用，從而使兩個細蛋白可和細胞膜表面的糖蛋白發(fā)生相互作用，從而使兩個細胞可以互相接觸，在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細胞表面胞可以互相接觸，在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細胞表面之間將產(chǎn)生一些微小的細胞質橋。隨著時間的推移，細胞質之間將產(chǎn)生一些微小的細胞質橋。隨著時間的推移，細胞質橋數(shù)量和橋的體積也在增加，最后相鄰細胞的細胞質就結合橋數(shù)量和橋的體積也在增加，最后相鄰細胞的細胞質就結合在一起了，形成細胞凝集塊再通過膜上蛋白質分子的重新排在一起了，形成細胞凝集塊再通

37、過膜上蛋白質分子的重新排列，使膜中脂類分子重排而打開質膜，最后導致細胞融合。列，使膜中脂類分子重排而打開質膜，最后導致細胞融合。v 在利用仙臺病毒誘導細胞融合實驗中主要包括以在利用仙臺病毒誘導細胞融合實驗中主要包括以下四個步驟：（下四個步驟：（1）先將親本細胞（待融合的細胞）先將親本細胞（待融合的細胞）分別制成懸浮液、混合離心；（分別制成懸浮液、混合離心；（2）將沉積細胞懸于）將沉積細胞懸于滅活的仙臺病毒懸液里，在滅活的仙臺病毒懸液里，在4oc低溫下?lián)u動低溫下?lián)u動20分鐘，分鐘，使細胞形成凝集塊；（使細胞形成凝集塊；（3）再將溫度升至）再將溫度升至37oc，間，間歇搖動歇搖動30分鐘，使其融合

38、；（分鐘，使其融合；（4）洗去病毒，將融）洗去病毒，將融合細胞浮于選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。由于合細胞浮于選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。由于4oc低溫低溫利于細胞聚集，在融合時需要提高溫度，否則融合利于細胞聚集，在融合時需要提高溫度，否則融合不會發(fā)生。不會發(fā)生。體細胞雜種的鑒定及應用領域體細胞雜種的鑒定及應用領域 細胞融合產(chǎn)生的雜種及后代需經(jīng)過雜種性質的鑒細胞融合產(chǎn)生的雜種及后代需經(jīng)過雜種性質的鑒定，而體細胞雜種用于育種實踐時，則應進行再定，而體細胞雜種用于育種實踐時，則應進行再生植株及后代的遺傳分析，一般包括生植株及后代的遺傳分析，一般包括形態(tài)學標記形態(tài)學標記、細胞學標記細胞學標記、原位雜交原位雜交分析

39、以及各種生化及分子分析以及各種生化及分子標記分析。標記分析。形態(tài)標記形態(tài)標記v 形態(tài)標記即植物的外部特征，如花的形形態(tài)標記即植物的外部特征，如花的形狀及顏色、果實狀及顏色、果實(種子種子)的形狀及顏色、葉的形狀及顏色、葉型、表皮毛、株型、穗型、千粒重、耐逆型、表皮毛、株型、穗型、千粒重、耐逆性以及對疾病的抗性等。形態(tài)標記簡單直性以及對疾病的抗性等。形態(tài)標記簡單直觀，但是標記少、多態(tài)性差、易受環(huán)境條觀，但是標記少、多態(tài)性差、易受環(huán)境條件和其它修飾基因的影響，并且許多性狀件和其它修飾基因的影響，并且許多性狀為數(shù)量性狀，由幾個位點控制，表現(xiàn)為一為數(shù)量性狀，由幾個位點控制，表現(xiàn)為一個范圍，而不是簡單的

40、性狀差異。個范圍，而不是簡單的性狀差異。細胞學標記細胞學標記v 細胞標記主要包括染色體核型細胞標記主要包括染色體核型(染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲點位置等點位置等)和帶型和帶型(c帶、帶、n帶、帶、g帶等帶等)。細胞學標記位點較少，而。細胞學標記位點較少，而且對于親緣關系較近的物種，由且對于親緣關系較近的物種，由于細胞學標記差別不明顯，所以于細胞學標記差別不明顯，所以很難根據(jù)細胞學特征來區(qū)分。很難根據(jù)細胞學特征來區(qū)分。同工酶標記同工酶標記v同工酶為共顯性，父本和母本的同工酶為共顯性，父本和母本的基因可以同時在后代中表達，不基因可以同時在后代中表達，不受環(huán)境因素影響，

41、中僅有相對穩(wěn)受環(huán)境因素影響，中僅有相對穩(wěn)定定;分析操作簡便，所需材料較分析操作簡便，所需材料較少少;不足之處是位點數(shù)較少，植不足之處是位點數(shù)較少，植物物1020種同工酶表現(xiàn)出位點種同工酶表現(xiàn)出位點的多態(tài)性，覆蓋的基因組范圍有的多態(tài)性，覆蓋的基因組范圍有限。限。染色體原位雜交染色體原位雜交 染色體原位雜交（染色體原位雜交（genomic in situ hybridization，gish）是一項利用標記的）是一項利用標記的dna探針與染色體上的探針與染色體上的dna雜交，在染色體雜交，在染色體上直接進行檢測的分子標記技術。通常用同上直接進行檢測的分子標記技術。通常用同位素或生物素、地高辛標記的

42、位素或生物素、地高辛標記的dna探針與染探針與染色體色體dna雜交，通過放射自顯影或通過抗原雜交，通過放射自顯影或通過抗原抗體反應，在熒光顯微鏡下觀察抗體反應，在熒光顯微鏡下觀察dna探針與探針與其互補的其互補的dna序列結合的位置。最大優(yōu)點是序列結合的位置。最大優(yōu)點是可以顯示在體細胞雜種中哪條染色體來源于可以顯示在體細胞雜種中哪條染色體來源于這個親本，哪條染色體來源于另一個親本，這個親本，哪條染色體來源于另一個親本，因而更準確、直觀。因而更準確、直觀。分子生物學標記分子生物學標記v植物的分子標記主要有植物的分子標記主要有rapd、盯、盯lp、aflp、ssr、issr、est等。等。下面是研究得出的新品種下面是研究得出的新品種v 植物體細胞雜交方式有植物體細胞雜交方式有對稱體細胞雜交對稱體細胞雜交、不對稱體細胞雜交不對稱體細胞雜交。v 對稱體細胞雜交是指雙方原生質體直接進行融合，雙親完整原生質對稱體細胞雜交是指雙方原生質體直接進行融合，雙親完整原生質體融合使所有遺傳物質均勻混合和重組形成對稱雜種。利用體細胞體