DNS氨基酸的雙向聚酰胺薄膜析

1、dns-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析薄層層析薄層層析（thin-layer chromatography,tlc)o 薄層層析薄層層析 -是吸附劑在平滑的玻璃板或聚脂薄膜是吸附劑在平滑的玻璃板或聚脂薄膜上鋪成薄層作為固定相，以溶劑作為流上鋪成薄層作為固定相，以溶劑作為流動相，將樣品中各組分分離的方法。動相，將樣品中各組分分離的方法。 分離原理：分離原理：吸附層析吸附層析吸附層析的概念及原理吸附層析的概念及原理o 吸附吸附 -一種物質(zhì)被聚集在另一種物質(zhì)表面的一種物質(zhì)被聚集在另一種物質(zhì)表面的現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 吸附劑：吸附劑： -凡是能夠?qū)⑵渌镔|(zhì)聚集到本身分子表凡是能夠?qū)⑵渌?/p>

2、質(zhì)聚集到本身分子表面的物質(zhì)稱為吸附劑，如氧化鋁、硅膠等。面的物質(zhì)稱為吸附劑，如氧化鋁、硅膠等。 被吸附物被吸附物 -聚集在吸附劑表面的分子就稱為被吸附聚集在吸附劑表面的分子就稱為被吸附物。物。吸附層析吸附層析（absorption chromatography)o 各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心活性中心, ,利用吸附劑對不同組分的吸利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離附能力差異而實現(xiàn)分離. .主要是利用吸附劑對不同物質(zhì)吸附力主要是利用吸附劑對不同物質(zhì)吸附力的不同而達到分離的目的。的不同而達到分離的目的。薄層層析中薄層層析中吸附劑選擇吸附劑選擇是

3、關(guān)鍵。是關(guān)鍵。吸附劑吸附劑吸附劑的選擇吸附劑的選擇（1）應(yīng)不溶于所使用的溶劑）應(yīng)不溶于所使用的溶劑;與所使用的與所使用的溶劑和樣品中各組分不起化學反應(yīng)；溶劑和樣品中各組分不起化學反應(yīng)；（2）應(yīng)具有較大的吸附表面（吸附容量）應(yīng)具有較大的吸附表面（吸附容量）和一定的吸附力和一定的吸附力;對被分離個組分有不同對被分離個組分有不同的吸附力的吸附力,有足夠的分辨力；有足夠的分辨力；（3）吸附劑顆粒大小要均勻，保持良好的）吸附劑顆粒大小要均勻，保持良好的重復性。重復性。吸附劑的吸附能力吸附劑的吸附能力o 常稱為活度，用羅馬字母常稱為活度，用羅馬字母、表示。表示。 活度活度 強強 弱弱 含水量含水量 多多

4、少少常用吸附劑常用吸附劑p極性：極性：硅膠硅膠:為首選吸附劑。本身具微酸性，適用于分離酸為首選吸附劑。本身具微酸性，適用于分離酸性及中性物質(zhì)。性及中性物質(zhì)。氧化鋁氧化鋁:氧化鋁具有分離能力強、活性可以控制等優(yōu)點氧化鋁具有分離能力強、活性可以控制等優(yōu)點堿性堿性/ /中性中性/ /酸性酸性氧化鋁氧化鋁p非極性：非極性：纖維素纖維素聚酰胺：聚酰胺：合成：己二酸、己二胺合成：己二酸、己二胺特點：氫鍵吸附劑特點：氫鍵吸附劑是是類化學纖維原料，即錦綸類化學纖維原料，即錦綸(又稱尼龍又稱尼龍)。由己二酸與己二胺聚合而成。由己二酸與己二胺聚合而成。因為在這類物質(zhì)分子中都含有大量酰胺基團，因為在這類物質(zhì)分子中都

5、含有大量酰胺基團，故統(tǒng)稱聚酰胺。故統(tǒng)稱聚酰胺。聚酰胺聚酰胺是由于聚酰胺的是由于聚酰胺的-co(羰基羰基)及及nh(氨基氨基)能與被分離物能與被分離物質(zhì)之間形成氫鍵。質(zhì)之間形成氫鍵。如酚類如酚類(包括黃酮類、鞣質(zhì)等包括黃酮類、鞣質(zhì)等)和酸類（如核苷酸、氨和酸類（如核苷酸、氨基酸等基酸等)是以其羥基與酰胺鍵的羰基形成氫鍵是以其羥基與酰胺鍵的羰基形成氫鍵如硝基化合物和醌類等物質(zhì)如硝基化合物和醌類等物質(zhì)與酰胺鍵的氨基形成氫鍵與酰胺鍵的氨基形成氫鍵被分離物質(zhì)形成氫鍵能力的強弱，確定吸附能力的差異。被分離物質(zhì)形成氫鍵能力的強弱，確定吸附能力的差異。在層析過程中，展層溶劑與被分離物質(zhì)在聚酰胺表面競相在層析過

6、程中，展層溶劑與被分離物質(zhì)在聚酰胺表面競相形成氫鍵。因此選擇適當?shù)恼箤尤軇?，使被分離物質(zhì)在溶形成氫鍵。因此選擇適當?shù)恼箤尤軇?，使被分離物質(zhì)在溶劑與聚酰胺表面之間的分配系數(shù)能有較大差異，經(jīng)過吸附劑與聚酰胺表面之間的分配系數(shù)能有較大差異，經(jīng)過吸附與解吸的展層過程，可以一一分離與解吸的展層過程，可以一一分離. 聚酰胺對極性物質(zhì)的吸附作用聚酰胺對極性物質(zhì)的吸附作用溶劑溶劑p不同溶劑具有不同的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，依極性不同溶劑具有不同的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，依極性大小各種溶劑的洗脫能力各不相同。大小各種溶劑的洗脫能力各不相同。一般所選溶劑要求：一般所選溶劑要求：a.純度合格純度合格b.黏度要小黏度要小易與樣品中各組分相分離易

7、與樣品中各組分相分離c.與所欲分離樣品和吸附劑不起化學反應(yīng)與所欲分離樣品和吸附劑不起化學反應(yīng)溶劑選擇考慮因素溶劑選擇考慮因素1、溶劑與吸附劑之間的相互作用力、溶劑與吸附劑之間的相互作用力2、溶劑與樣品之間的作用因素、溶劑與樣品之間的作用因素 溶劑的選擇可通過實驗來確定。溶劑的選擇可通過實驗來確定。薄層層析的操作薄層層析的操作1、點樣、點樣樣品最好溶解在揮發(fā)性的溶劑中，如氯仿、樣品最好溶解在揮發(fā)性的溶劑中，如氯仿、丙酮等，避免用水每次點少量樣品，可在溶丙酮等，避免用水每次點少量樣品，可在溶劑揮發(fā)后反復進行至點完為止。劑揮發(fā)后反復進行至點完為止。樣品原點直徑樣品原點直徑3mm2.平衡平衡3.展開展

8、開方法：方法：上行層析法上行層析法下行層析法下行層析法雙向展開法雙向展開法顯色顯色1）有色物質(zhì)（如黃體酮）展開后即可顯）有色物質(zhì)（如黃體酮）展開后即可顯出斑點出斑點2）紫外燈下顯出熒光斑點，如核苷酸和）紫外燈下顯出熒光斑點，如核苷酸和某些生物堿某些生物堿3）顯色劑顯色）顯色劑顯色p熒光試劑熒光試劑 dns-cl二甲氨基萘磺酰氯二甲氨基萘磺酰氯p蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸可與其游離氨基蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸可與其游離氨基結(jié)合結(jié)合pdns-aa發(fā)出黃綠色熒光發(fā)出黃綠色熒光dns-cl在在ph過高時，水解產(chǎn)生副產(chǎn)物過高時，水解產(chǎn)生副產(chǎn)物dns-oh，即：，即：在在dns-cl過量時，會過量時，會產(chǎn)生產(chǎn)生dn

9、s-nh2，即：，即：dns-氨基酸在紫外光照射下呈現(xiàn)氨基酸在紫外光照射下呈現(xiàn)黃色黃色熒光熒光dns-oh和和dns-nh2產(chǎn)生產(chǎn)生藍色藍色熒光熒光可彼此區(qū)分?？杀舜藚^(qū)分。 三、薄層層析的應(yīng)用三、薄層層析的應(yīng)用（一）定性分析：將已知化合物作為標準品與（一）定性分析：將已知化合物作為標準品與樣品一起進行層析后對照，可初步確定未知樣品一起進行層析后對照，可初步確定未知化合物的組成?；衔锏慕M成。（二）定量分析：可直接在薄板上測定，無須（二）定量分析：可直接在薄板上測定，無須破壞薄層；破壞薄層； 用工具將斑點從薄層上取下，用溶劑洗脫，用工具將斑點從薄層上取下，用溶劑洗脫，再用其他方法測定。再用其他方

10、法測定。臨床生化上的應(yīng)用臨床生化上的應(yīng)用1.氨基酸的分離氨基酸的分離2.核苷、核苷酸和核酸的分析核苷、核苷酸和核酸的分析dns-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析 p二甲氨基萘磺酰氯二甲氨基萘磺酰氯(1-dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl chloride，dns-cl)可與氨基酸的游離氨基結(jié)合成可與氨基酸的游離氨基結(jié)合成dns-氨氨基酸。基酸。p形成的形成的dns-氨基酸在紫外線（氨基酸在紫外線（260nm或或365nm）照射下發(fā)出強烈的黃色熒光，因此可）照射下發(fā)出強烈的黃色熒光，因此可用熒光檢測用熒光檢測dns-氨基酸的存在。氨基酸的存在

11、。ph9.840,30min本實驗中，聚酰胺上胺基與氨基本實驗中，聚酰胺上胺基與氨基酸的羰基形成氫鍵，酰胺基團上酸的羰基形成氫鍵，酰胺基團上羰基與羰基與aaaa中羥基或酚基形成氫鍵。中羥基或酚基形成氫鍵。由于有些由于有些aaaa結(jié)構(gòu)相似，如只采用結(jié)構(gòu)相似，如只采用一種溶劑系統(tǒng)進行單向?qū)游?，難一種溶劑系統(tǒng)進行單向?qū)游?，難達到完全分離的目的。因此可選達到完全分離的目的。因此可選擇另一溶劑系統(tǒng)進行第二向?qū)游?。擇另一溶劑系統(tǒng)進行第二向?qū)游觥?第一向第一向苯冰醋酸苯冰醋酸 第二向第二向甲酸水甲酸水二甲氨基萘磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯（dns-cl）可與氨基酸的游可與氨基酸的游離氨基結(jié)合成離氨基結(jié)合成dns

12、-氨基酸。形成的氨基酸。形成的dns-氨基氨基酸在紫外光下呈黃綠色熒光。酸在紫外光下呈黃綠色熒光。 dns-cl + aa dns-aa + hcl 反應(yīng)的副產(chǎn)物：反應(yīng)的副產(chǎn)物：dns-nh2黃色熒光和黃色熒光和dns-oh藍色熒光藍色熒光顯色顯色dns-氨基酸的雙向?qū)游鰣D譜氨基酸的雙向?qū)游鰣D譜頡頡亮亮苯苯丙丙賴賴甘甘絲絲天天脯脯谷谷1、dns氨基酸的制備氨基酸的制備2、混合、混合dns氨基酸的雙向?qū)游霭被岬碾p向?qū)游觯?）點樣。距）點樣。距右右下角距兩邊各下角距兩邊各0.5cm，直徑控制在直徑控制在23mm之間，點在無光澤面之間，點在無光澤面,可重復幾次點樣?？芍貜蛶状吸c樣。（2）苯冰醋酸層

13、析：展層劑前緣距薄膜頂端）苯冰醋酸層析：展層劑前緣距薄膜頂端3mm處處即可停止即可停止,冷冷風吹干，紫外觀察。風吹干，紫外觀察。（3）甲酸水層析：調(diào)轉(zhuǎn)）甲酸水層析：調(diào)轉(zhuǎn)90度與第一相垂直，度與第一相垂直，熱熱風吹風吹干，紫外燈下觀察，用鉛筆干，紫外燈下觀察，用鉛筆輕輕輕輕標記。標記。操作以及注意事項操作以及注意事項（1 1）嚴格控制點樣位置以及點樣直徑。）嚴格控制點樣位置以及點樣直徑。（2 2）展層時勿將點樣浸入溶劑系統(tǒng)。）展層時勿將點樣浸入溶劑系統(tǒng)。（3 3）展層后必須經(jīng)電吹風將膜吹干。）展層后必須經(jīng)電吹風將膜吹干。（4 4）使用紫外照射時要注意使用時間短）使用紫外照射時要注意使用時間短.

14、.注意注意procedure for tlc1. prepare the developing container.the developing container for tlc can be a specially designed chamber, a jar with a lid, or a beaker with a watch glass on the top: pour solvent into the beaker to a depth of just less than 0.5 cm. to aid in the saturation of the tlc chamber w

15、ith solvent vapors, line part of the inside of the beaker with filter paper cover the beaker with a watch glass, swirl it gently, and allow it to stand while you prepare your tlc plate. tlc plates used in the organic chem teaching labs are purchased as 5 cm x 20 cm sheets. each large sheet is cut ho

16、rizontally into plates which are 5 cm tall by various widths; the more samples you plan to run on a plate, the wider it needs to be.prepare the tlc plate.shown in the photo to the left is a box of tlc plates, a large un-cut tlc sheet, and a small tlc plate which has been cut to a convenient size. pl

17、ates will usually be cut and ready for you when you come to lab.handle the plates carefully so that you do not disturb the coating of adsorbent or get them dirty.measure 0.5 cm from the bottom of the plate. take care not to press so hard with the pencil that you disturb the adsorbent. using a pencil

18、, draw a line across the plate at the 0.5 cm mark. this is the origin: the line on which you will spot the plate. its kind of hard to see the pencil line in the above photos, so here is a close-up of how the plate looks after the line has been drawn. under the line, mark lightly the name of the samp

19、les you will spot on the plate, or mark numbers for time points. leave enough space between the samples so that they do not run together, about 4 samples on a 5 cm wide plate is advised. use a pencil and do not press down so hard that you disturb the surface of the plate. a close-up of a plate label

20、ed 1 2 3 is shown to the right. spot the tlc plate . . . swirl until dissolvedadd a few drops of solvent . . . dip the microcap into solution - the arrow points to the microcap, it is tiny and hard to see make sure it is filled - hold it up to the light if necessary touch the filled microcap to tlc

21、plate to spot it - make sure you watch to see that all the liquid has drained from the microcap rinse the microcap with clean solvent by first filling it . . . . . . and then draining it by touching it to a paper towel heres the tlc plate, spotted and ready to be developed develop the plate.place th

22、e tlc plate in the developing container - make sure the solvent is not too deepthe solvent will rise up the tlc plate by capillary action. in this photo, it is not quite halfway up the plate.in this photo, it is about 3/4 of the way up the plate.remove the plate from the beaker.quickly mark a line a

23、cross the plate at the solvent front with a pencilallow the solvent to evaporate completely from the plate. if the spots are colored, simply mark them with a pencil.visualize the spots most samples are not colored and need to be visualized with a uv lamp. hold a uv lamp over the plate and mark any spots which you see lightly with a pencil.this is a uv lamp he