實驗13大學瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法

1、瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法原理和方法 1 一、電泳方法的分類一、電泳方法的分類 按支持物的物理性狀不同，區(qū)帶電泳可為：按支持物的物理性狀不同，區(qū)帶電泳可為：濾紙及其他纖維（如醋酸纖維、玻璃纖維、濾紙及其他纖維（如醋酸纖維、玻璃纖維、聚氯乙烯纖維）聚氯乙烯纖維）薄膜薄膜電位；電位；粉末粉末電泳，如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電電泳，如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳；泳；凝膠凝膠電泳，如瓊脂、電泳，如瓊脂、瓊脂糖瓊脂糖、硅膠、淀粉、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠等；膠、聚丙烯酰胺凝膠等；絲線絲線電泳，如尼龍絲、人造絲電泳。電泳，如尼龍絲、人造絲電泳。2 按支持物的裝置形式不同，區(qū)帶電泳可為：按

2、支持物的裝置形式不同，區(qū)帶電泳可為：平板式平板式電泳，支持物水平放置，是最常用電泳，支持物水平放置，是最常用的電泳方式的電泳方式；垂直板式垂直板式電泳，聚丙烯酰胺凝膠常做成垂電泳，聚丙烯酰胺凝膠常做成垂直板式電泳直板式電泳；垂直柱式垂直柱式電泳，聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳電泳，聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳即屬于此類即屬于此類；連續(xù)液動連續(xù)液動電泳，首先應用于紙電泳，將濾電泳，首先應用于紙電泳，將濾紙垂直豎立，兩邊各放一電極，溶液自頂端紙垂直豎立，兩邊各放一電極，溶液自頂端向下流，與電泳方向垂直向下流，與電泳方向垂直。3 概念：概念：以以瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠作支持體的電泳方式。作支持體的電泳方式。二、瓊脂

3、糖凝膠電泳二、瓊脂糖凝膠電泳天然瓊脂（天然瓊脂（agaragar）: :又名瓊膠、菜燕、凍粉，從石花菜及又名瓊膠、菜燕、凍粉，從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。瓊脂糖（瓊脂糖（agaroseagarose）瓊脂膠（瓊脂膠（agaropectinagaropectin） 4 天然瓊脂天然瓊脂(agar)(agar)是一種多聚糖，主要由是一種多聚糖，主要由瓊脂糖瓊脂糖( (約占約占80%)80%)及及瓊脂膠瓊脂膠組成。瓊脂糖是組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的由半乳糖及其衍生物構成的中性物質中性物質，不帶，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根

4、和羧基的電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強強酸性多糖酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的作用下能產生較強的電滲電滲現(xiàn)象，加之硫酸根現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。效果。5 瓊脂糖鏈依分子內和分子間氫鍵及其它力的作瓊脂糖鏈依分子內和分子間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網(wǎng)孔型用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網(wǎng)孔型凝膠。凝膠。6 7 8 瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優(yōu)點優(yōu)點如下：如下： ( (1)1)瓊脂糖凝膠電

5、泳操作簡單，電泳速度快，樣品瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進行電泳。不需事先處理就可進行電泳。 (2)(2)瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大( (約占約占98-99%)98-99%)，近似自由電泳，樣品擴散度較自由電泳近似自由電泳，樣品擴散度較自由電泳 小，對樣品吸小，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。 (3)(3)瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光燈監(jiān)測及定量測定。接用紫外光燈監(jiān)測及定量測定。 (4)(4)電泳后區(qū)帶易染色

6、，樣品易洗脫，便于定量測電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。定。制成干膜可長期保存。 9 瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳的缺點缺點：(1) (1) 機械強度差，易破碎，濃度不能太低。機械強度差，易破碎，濃度不能太低。(2) (2) 易被細菌污染，不易保存，臨用前配制。易被細菌污染，不易保存，臨用前配制。(3) (3) 瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴散，電泳后必瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴散，電泳后必須立即固定染色。須立即固定染色。(4) (4) 與與pagepage相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。10 目前，瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定核目前，瓊

7、脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定核酸，如酸，如dnadna鑒定，鑒定，dnadna限制性內切酶圖譜制作等。限制性內切酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設備簡單，需樣品量少，由于這種方法操作方便，設備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。法之一。 瓊脂糖也可用作為電泳支持物，分離蛋白質瓊脂糖也可用作為電泳支持物，分離蛋白質和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學相結合，發(fā)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學相結合，發(fā)展成免疫電泳技術，能鑒別其他方法不能鑒別的展成免疫電泳技術，能鑒別其他方法不能鑒別的復雜體系，由于建立了超微量技術，復雜體系

8、，由于建立了超微量技術，0.1g0.1g蛋白蛋白質就可檢出。質就可檢出。 11 瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要依據(jù)它們的相對分子質量及分子構型，同依據(jù)它們的相對分子質量及分子構型，同時與凝膠的濃度也有密切關系。時與凝膠的濃度也有密切關系。 三、三、dnadna的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳12 1.1.核酸分子大小及瓊脂糖的濃度的關系核酸分子大小及瓊脂糖的濃度的關系(1)dna(1)dna分子的大?。悍肿拥拇笮。?dna dna分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。和分子篩效應。dnadna分子在高于等電點的分

9、子在高于等電點的phph溶液溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。在一定的中帶負電荷，在電場中向正極移動。在一定的電場強度下，電場強度下，dnadna分子的遷移速度取決于分子篩分子的遷移速度取決于分子篩效應，即效應，即dnadna分子本身的大小和構型。分子本身的大小和構型。13 14 在凝膠中，在凝膠中，dnadna片段遷移距離片段遷移距離( (遷移率遷移率) )與堿與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標準基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離進行比較，物移動的距離與未知片段的移動距離進行比較，便可測出未知片段的大小。便可測出未知片段的大小。 但是當?shù)钱攄

10、nadna分子大小超過分子大小超過20kb20kb時，普通瓊脂時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，應用瓊脂糖凝膠不再依賴于分子大小，因此，應用瓊脂糖凝膠電泳分離電泳分離dnadna時，分子大小不宜超過此值。時，分子大小不宜超過此值。15 (2)(2)瓊脂糖的濃度：瓊脂糖的濃度： 不同大小的不同大小的dnadna需要用不同濃度的瓊脂糖凝需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離膠進行電泳分離, ,如下表所示如下表所示: : 16 2. 2. 核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系 不同構型

11、不同構型dnadna的移動速度次序為：的移動速度次序為：共價閉環(huán)共價閉環(huán)dnadna(covalently(covalently closed circular closed circular，簡稱，簡稱cccdnacccdna) )直直線線dnadna開環(huán)的雙鏈環(huán)狀開環(huán)的雙鏈環(huán)狀dnadna。當瓊脂糖濃度太高時，環(huán)。當瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀狀dna(dna(一般為球形一般為球形) )不能進入膠中，相對遷移率為不能進入膠中，相對遷移率為0(rm=o)0(rm=o)，而同等大小的直線雙鏈，而同等大小的直線雙鏈dna(dna(剛性棒狀剛性棒狀) )則可以則可以 長軸方向前進長軸方向前進( (rmr

12、mo)o)，由此可見，這，由此可見，這3 3種構型的相對遷種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。緩沖液離子強度等的影響。 17 3 3. . 電泳方法電泳方法 (1)(1)凝膠類型凝膠類型 用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型及水平型( (平板型平板型) )。水平型電泳時，凝膠板完全浸。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下泡在電極緩沖液下1-2mm1-2mm，故又稱為潛水式。目前，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便，

13、電更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)泳槽簡單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而受到人們的歡迎。格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而受到人們的歡迎。 18 (2)(2)緩沖液系統(tǒng)緩沖液系統(tǒng) 缺少離子時，電流太小，缺少離子時，電流太小，dnadna遷移慢；相反，遷移慢；相反，高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產熱高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產熱 ，嚴重時，會造成膠熔化和嚴重時，會造成膠熔化和dnadna的變性。的變性。 常用的電泳緩沖液有常用的電泳緩沖液有edta(ph8.0)edta(ph8.0)和和tristri

14、s- -乙乙酸酸(tae)(tae)，tristris- -硼酸硼酸(tbe)(tbe)或或tristris- -磷酸磷酸(tpe)(tpe)等等 ，濃度約為，濃度約為50mmol/l(ph7.5-7.8)50mmol/l(ph7.5-7.8) 。電泳緩沖液。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍一般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數(shù)。數(shù)。 taetae緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。力，因此更常用。tbetbe濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉 淀，為避免此缺點，室溫下貯存淀，為避免此缺點，室溫下貯存5 5

15、溶液，用時稀溶液，用時稀釋釋1010倍。倍。0.50.5工作液也可提供足夠的緩沖能力。工作液也可提供足夠的緩沖能力。19 (3)(3)凝膠的制備凝膠的制備 以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，冷卻至微波爐配制一定濃度的溶膠，冷卻至45-5045-50時時灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。卻。(4)(4)樣品配制與加樣樣品配制與加樣 dnadna樣品用適量樣品用適量tristris-edta-edta緩沖液溶解，緩緩沖液溶解，緩沖溶解液內含有沖溶解液內含有0.25%0.25%溴酚藍或其

16、他指示染料，溴酚藍或其他指示染料， 含有含有10%-15%10%-15%蔗糖或蔗糖或5%-10%5%-10%甘油，以增加其比重甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結果產生結果產生u u形條帶，可改用形條帶，可改用2.5% 2.5% ficollficoll( (聚蔗糖聚蔗糖) )代替蔗糖或甘油。代替蔗糖或甘油。20 (5)(5)電泳電泳 瓊脂糖凝膠分離大分子瓊脂糖凝膠分離大分子dnadna實驗條件的研究結果表實驗條件的研究結果表明：在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓明：在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性條

17、件下，線性dnadna分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，較大的比。但是，在電場強度增加時，較大的dnadna片段遷移率片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離反而下降，為了獲得電泳分離dnadna片段的最大分辨率，片段的最大分辨率，電場強度不宜高于電場強度不宜高于5v/cm5v/cm。 電泳系統(tǒng)的溫度對于電泳系統(tǒng)的溫度對于dnadna在瓊脂糖凝膠中的電泳行在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳，只有當為沒有顯著的影響。通常在室溫

18、下進行電泳，只有當凝膠濃度低于凝膠濃度低于0.5%0.5%時，為增加凝膠硬度，可在時，為增加凝膠硬度，可在44，進，進行電泳。行電泳。(6)(6)染色和拍照染色和拍照 常用熒光染料溴乙錠常用熒光染料溴乙錠(eb)(eb)染色，在紫外光下觀察染色，在紫外光下觀察d dnana條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進行有關的數(shù)據(jù)分析。照片，并進行有關的數(shù)據(jù)分析。 21 注意注意! ! 溴溴化乙化乙錠錠（ebeb）為為強致癌強致癌劑劑，操作，操作時應時應戴手戴手套，套，盡盡量量減減少臺面少臺面污污染。染。 目前目前實驗實驗室一般用相室一般用相

19、對對安全的安全的goldenviewgoldenview等等核酸核酸熒熒光染料代替。光染料代替。22 四、印跡轉移電泳四、印跡轉移電泳 生物化學與分子生物學的研究工作經(jīng)常需要對電泳分離生物化學與分子生物學的研究工作經(jīng)常需要對電泳分離后的后的dnadna進行分子雜交，但瓊脂糖不適合于進行雜交操作，進行分子雜交，但瓊脂糖不適合于進行雜交操作，19751975年，年，southernsouthern創(chuàng)造了將創(chuàng)造了將dnadna區(qū)帶原位轉移到硝酸基纖維區(qū)帶原位轉移到硝酸基纖維素膜素膜(nc(nc膜膜) )上，再進行雜交的方法，被稱為上，再進行雜交的方法，被稱為southernsouthern印跡法印跡

20、法。隨后，隨后，alwinealwine等將類似方法用于等將類似方法用于rnarna印跡，被戲稱為印跡，被戲稱為northernnorthern印跡印跡，19791979年年towbintowbin等設計了將蛋白質從凝膠轉移等設計了將蛋白質從凝膠轉移到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質轉移到膜上，再與相應的到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質轉移到膜上，再與相應的抗體等配體反應，被戲稱為抗體等配體反應，被戲稱為westernwestern印跡印跡，這種裝置將膜和，這種裝置將膜和凝膠、濾紙等制成夾心餅干狀，用低電壓高電流電泳完成轉凝膠、濾紙等制成夾心餅干狀，用低電壓高電流電泳完成轉移。移。19821982年

21、年reinhartreinhart等用電轉移法將等電聚焦后的蛋白質區(qū)等用電轉移法將等電聚焦后的蛋白質區(qū)帶從凝膠轉移到特定膜上帶從凝膠轉移到特定膜上 ，稱稱easterneastern印跡印跡。23 目前國內外有多種核酸、蛋白質印跡轉移的電泳裝置出目前國內外有多種核酸、蛋白質印跡轉移的電泳裝置出售，使印跡轉移速度快、效率高、重復性好，應用更加廣泛，售，使印跡轉移速度快、效率高、重復性好，應用更加廣泛，儀器的使用方法可參照廠家說明書。聚丙烯酰胺凝膠也可用于儀器的使用方法可參照廠家說明書。聚丙烯酰胺凝膠也可用于印跡轉移電泳，但轉移蛋白質時，凝膠中不可含有印跡轉移電泳，但轉移蛋白質時，凝膠中不可含有s

22、dssds、尿素、尿素等變性劑。用于轉移電泳的支持膜亦有多種選擇，近些年用尼等變性劑。用于轉移電泳的支持膜亦有多種選擇，近些年用尼龍膜較多，因為尼龍膜機械性能好，烘烤不變脆，使用時比硝龍膜較多，因為尼龍膜機械性能好，烘烤不變脆，使用時比硝酸纖維素膜更方便。酸纖維素膜更方便。 進行印跡轉移電泳時，要注意緩沖液的離子強度要低，進行印跡轉移電泳時，要注意緩沖液的離子強度要低，phph要遠離要遠離pipi，使蛋白質帶有較多電荷，一般用穩(wěn)定性較好的，使蛋白質帶有較多電荷，一般用穩(wěn)定性較好的tristris- -緩沖體系。還要注意凝膠與支持膜之間不能有氣泡。適緩沖體系。還要注意凝膠與支持膜之間不能有氣泡。

23、適當提高電壓或電流可以提高轉移速度，但亦會增加熱效應，故當提高電壓或電流可以提高轉移速度，但亦會增加熱效應，故電壓或電流不可過高。電壓或電流不可過高。 24 25 26 一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb20kb的的dnadna。這是因為在瓊脂糖凝膠中，這是因為在瓊脂糖凝膠中，dnadna分子的有效直徑超分子的有效直徑超過凝膠孔徑時，在電場作用下，迫使過凝膠孔徑時，在電場作用下，迫使dnadna變形擠過變形擠過篩孔篩孔，而沿著泳動方向，而沿著泳動方向伸直伸直，因而分子大小對遷移，因而分子大小對遷移率影響不大。如此時率影響不大。如此時改變電場方向改變電場方向，則

24、，則dnadna分子必分子必須改變其構象，須改變其構象，沿新的泳動方向伸直沿新的泳動方向伸直，而轉向時間，而轉向時間與與dnadna分子大小關系極為密切。分子大小關系極為密切。五、交變脈沖電場凝膠電泳五、交變脈沖電場凝膠電泳27 19831983年，年，schwartzschwartz等人根據(jù)等人根據(jù)dnadna分子彈性弛豫分子彈性弛豫時間時間( (外推為零的滯留時間外推為零的滯留時間) )與與dnadna分子大小有關的分子大小有關的特性，設計了脈沖電場梯度凝膠，交替采用兩個垂特性，設計了脈沖電場梯度凝膠，交替采用兩個垂直方向的不均勻電場，使直方向的不均勻電場，使dnadna分子在凝膠中不斷改分子在凝膠中不斷改變方向，從而使變方向，從而使dnadna按分子大小分開。后來，按分子大小分開。后來，carlecarle等改進了電泳技術，并發(fā)現(xiàn)周期性的反轉換電場等改進了電泳技術，并發(fā)現(xiàn)周期性的反轉換電場(periodic inversion of the electric field)(periodic inversion of the electric field)亦能使大亦能使大分子分子dnadna通過電泳分開。電泳系統(tǒng)是由一個水平式通過電泳分開。電泳系統(tǒng)是由一個水平式電泳槽和兩組獨立，彼此垂直的電極組成，一