Westernblot詳解及問題分析

1、張紹進(jìn)張紹進(jìn) western blot western blotwestern blot 簡(jiǎn)介：p印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。p1975年，southern建立了將dna轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（nc膜）上，并利用dnarna雜交檢測(cè)特定的dna片段的方法，稱為southern印跡法。p而后人們用類似的方法，對(duì)rna和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)rna的印跡分析稱為northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為eastern印跡法。 western blot we

2、stern blotp 高分辨率的電泳技術(shù)高分辨率的電泳技術(shù)p 特異敏感的抗原特異敏感的抗原- -抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)p 1-5ng1-5ng中等大小的靶蛋白中等大小的靶蛋白 western blotq目的蛋白的表達(dá)特性分析q目的蛋白與其它蛋白的互作q目的蛋白的組織定位q目的蛋白的表達(dá)量分析 western blotl蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備sds-pagesds-page轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜封閉封閉一抗雜交一抗雜交二抗雜交二抗雜交底物顯色底物顯色 western blot western blot western blotp2sds-page上樣緩沖液：上樣緩沖液：pdtt可臨用前以可臨用前以1：4比例

3、混合加入，亦可全部配好分裝，比例混合加入，亦可全部配好分裝，-20凍存。凍存。p按按1:1比例與蛋白質(zhì)樣品混合，比例與蛋白質(zhì)樣品混合，95100加熱加熱515min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為20-25l，總蛋白量，總蛋白量2050g。1m tris-hcl(ph6.8)10 ml1m dtt20 mlsds4 g甘油甘油20 ml溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)0.2 g總體積總體積100ml 100mm tris-hcl(ph6.8) 200mm dtt 4%sds 0.2%溴酚蘭溴酚蘭 20%甘油甘油 ddh2o western blotsds：p陰離子去污劑陰離子去污劑

4、變性劑變性劑p氨基酸側(cè)鏈與氨基酸側(cè)鏈與sds充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-sds膠束。膠束。p蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-sds膠束所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷膠束所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不量，消除了不 同分子之間原有的電荷差異。同分子之間原有的電荷差異。p與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。性化。 western blot蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-sds-sds膠束的特點(diǎn)：膠束的特點(diǎn)：（1 1）具有相同的形狀，形狀）具有相同的形狀，形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒（2

5、 2）平均）平均1g 1g 蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g sds1.4g sds（3 3）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基基-sds-sds膠束基本上是相同的膠束基本上是相同的（4 4）長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分）長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比子量的大小成正比 western blotq不連續(xù)的電泳緩沖體系。qsds蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。 sdssds聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 western blotsds-pagesds-page 是在蛋白質(zhì)樣品中加入是在蛋白質(zhì)樣品中加入sdssds和含有巰基乙醇的和含有

6、巰基乙醇的樣品處理液，樣品處理液，是一種很強(qiáng)的是一種很強(qiáng)的，它可，它可以以，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。和三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，dttdtt）可以可以斷開二硫斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與sdssds充分結(jié)合形成帶負(fù)電充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)荷的蛋白質(zhì)-sds-sds復(fù)合物。復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合蛋白質(zhì)分子結(jié)合sdssds陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超 過

7、了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所 帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基 的相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)。的相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)。 western blot凝膠成分凝膠成分m丙烯酰胺和n,n-亞甲雙丙烯酰胺 msdsm配膠的tris緩沖液mtemedm過硫酸銨mtris-甘氨酸電泳緩沖液 western blotpagepage：聚丙烯酰胺凝膠：聚丙烯酰胺凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide(polyacrylamide

8、 gel) gel)是由單體丙烯酰是由單體丙烯酰胺胺(acrylamide(acrylamide，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱acracr) )和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑(crosslinker(crosslinker) )n,nn,n- -亞甲基雙丙烯酰胺亞甲基雙丙烯酰胺(n,n(n,n-methylenebisacylamide-methylenebisacylamide，簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱bisbis) )在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠?；瘜W(xué)惰性強(qiáng)，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和透明狀結(jié)構(gòu)的凝膠?；瘜W(xué)惰性強(qiáng)，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。度。是良好的電泳

9、介質(zhì)。 western blot聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式： 單體：丙烯酰胺（單體：丙烯酰胺（acracr）；）； 交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（bisbis）；）； 催化劑：過硫酸胺或核黃素（催化劑：過硫酸胺或核黃素（apap）；）； 加速劑：四甲基乙二胺（加速劑：四甲基乙二胺（temedtemed）；）； 產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過提供氧游離基聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過提供氧游離基(free radicals)(free radicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(

10、catalyst-redox(catalyst-redox systems) systems)來來完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（apaptemedtemed）和光化學(xué)催化）和光化學(xué)催化（核黃素（核黃素tmtedtmted）體系。）體系。 western blot凝膠濃度（）線性分離范圍（kd)1512-431016-687.536-945.057-212sds-page濃縮膠濃縮膠(5% acrylamide)及分離膠配方及分離膠配方表：表：http:/ western blot不連續(xù)電泳：不連續(xù)電泳： 作用作用緩沖液緩沖液phph凝膠濃度凝膠濃度濃縮膠濃縮膠

11、使蛋白樣品濃縮ph6.8tris-cl低，2-5%分離膠分離膠使蛋白樣品分離ph8.8tris-cl高，根據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：電泳緩沖液：ph8.3 trisph8.3 tris- -甘氨酸系統(tǒng)甘氨酸系統(tǒng)。 western blot灌制分離膠灌制分離膠 隔絕空氣隔絕空氣ddh2o0.1%sds:8% western blot灌制積層膠灌制積層膠 插入梳子插入梳子 western blotstaking gelseparating gel western blot轉(zhuǎn)膜p要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如nc膜）上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法

12、。p常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場(chǎng)的機(jī)械裝置不同。 western blotp最常用于最常用于western blot的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素（纖維素（nitrocellulose，nc）膜和聚偏二氟）膜和聚偏二氟乙烯乙烯 （polyvinylidene fluoride, pvdf）膜，）膜，此外也有用尼龍膜、此外也有用尼龍膜、deae纖維素膜做蛋白纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和印跡。尼龍膜和nc膜的特點(diǎn)相似膜的特點(diǎn)相似,主要用于主要用于核酸雜交。核酸雜交。p各種膜的詳細(xì)特點(diǎn)介紹：各種膜的詳細(xì)特點(diǎn)介紹：pht

13、tp:/ western blot濕轉(zhuǎn)系統(tǒng) western blot半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng) western blot 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖 維素濾膜，換水幾次。只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記a蛋白探 針的western印跡過程。 western blot western blot一抗、二抗孵育p把nc膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以0.1ml/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4過夜。p回收一抗溶液，用tbst漂洗膜3次，每次10min。p加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4過夜。 p回收一抗溶液，用tbst漂洗膜3

14、次，每次10min。p最后用tbs漂洗膜2次，每次10min。 western blot辣根過氧化物酶法（hrp）堿性磷酸酶法（ap）化學(xué)發(fā)光顯色法(hrp) western blot膜解吸方法（膜的重復(fù)利用）膜解吸方法（膜的重復(fù)利用） p通過加熱和去污劑進(jìn)行解吸通過加熱和去污劑進(jìn)行解吸 原理：原理：組合使用去污劑和加熱使抗體解離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。p酸解吸酸解吸 原理：原理：使用低ph改變抗體結(jié)構(gòu)從而使結(jié)合位點(diǎn)失活，從而將抗體與抗原分離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。 western blotwestern blot結(jié)果分析p目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某

15、樣品的目的蛋白相對(duì)含量。pwestern blot結(jié)果分析軟件結(jié)果分析軟件gel-pro analyzer 4 綠色版（附動(dòng)畫演示教程）綠色版（附動(dòng)畫演示教程）http:/ western blot western blot western blot western blot？ western blot轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白很少1.1.蛋白分子量蛋白分子量 10kd10kd2.2.蛋白的等電點(diǎn)蛋白的等電點(diǎn) 93.3.sdssds濃度不合適濃度不合適4.4.凝膠太厚凝膠太厚 原原因因?qū)?duì)策策1.1.蛋白分子量蛋白分子量110kd0kd時(shí)，減時(shí)，減少轉(zhuǎn)膜時(shí)間；使用小孔徑少轉(zhuǎn)膜時(shí)間；使用小孔徑的膜的膜2.

16、2.更換高更換高phph值值bufferbuffer3.3.在陰極在陰極bufferbuffer中加入中加入0.005 - 0.01% sds 0.005 - 0.01% sds 可提可提高轉(zhuǎn)膜效率高轉(zhuǎn)膜效率4.4.延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間 western blot1.1.膜沒有均勻浸濕膜沒有均勻浸濕2.2.膜或者緩沖液污染膜或者緩沖液污染3.3.封閉不充分封閉不充分4.4.抗體與封閉劑出現(xiàn)交抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)叉反應(yīng)5.5.抗體濃度過高抗體濃度過高 原原因因?qū)?duì)策策1.1.轉(zhuǎn)膜前用轉(zhuǎn)膜前用100%100%甲醇將膜完甲醇將膜完全浸濕全浸濕2.2.拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手

17、套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液3.3.檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)是否有交叉反應(yīng)4.4.雜交前檢測(cè)一抗、二抗的雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度工作濃度背景太高 western blot雜交信號(hào)很弱1.1.抗體保存不當(dāng)抗體保存不當(dāng)2.2.抗原不充足抗原不充足3.3.膜的漂洗過度膜的漂洗過度 原原因因?qū)?duì)策策1.1.抗體長(zhǎng)期保存應(yīng)在抗體長(zhǎng)期保存應(yīng)在7070，使用前做效價(jià)檢測(cè)，使用前做效價(jià)檢測(cè)2.2.增加蛋白上樣量，做已知增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對(duì)照3.3.減少漂洗的時(shí)間和次數(shù)減少漂洗的時(shí)間和次數(shù) western blot1.1.一抗不是唯一特一抗不是唯一特異的異的2.2.二抗出現(xiàn)非特異二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合結(jié)合 原因原因?qū)?duì)策策1.1.制備單克隆抗體或者重新