豬血清白蛋白的分

1、 血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占總量的總量的60。 它是一種水溶性很強(qiáng)的蛋白，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能結(jié)合它是一種水溶性很強(qiáng)的蛋白，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能結(jié)合多種小分子，如脂肪酸，膽紅素，血紅素等，起多種小分子，如脂肪酸，膽紅素，血紅素等，起維持血液的正常滲透壓作用。維持血液的正常滲透壓作用。 此外白蛋白還有解毒、參與脂類代謝及血漿中微此外白蛋白還有解毒、參與脂類代謝及血漿中微溶物質(zhì)的運(yùn)輸、維持血液酸堿平衡等作用，在醫(yī)溶物質(zhì)的運(yùn)輸、維持血液酸堿平衡等作用，在醫(yī)學(xué)臨床及生物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛學(xué)臨床及生物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛 。血清的制備血清的制備 白蛋白的分離白蛋白的分離 白蛋

2、白的純化白蛋白的純化 蛋白質(zhì)含量的蛋白質(zhì)含量的測定測定白蛋白純度的白蛋白純度的檢測檢測 白蛋白的相對分白蛋白的相對分子質(zhì)量的測定子質(zhì)量的測定留樣：留樣：2，3留樣：留樣：4,留樣：留樣：1留留0.1ml0.1ml（樣（樣1 1）至至1.5 1.5 mlml離心管，用于測定蛋白質(zhì)含量和電泳離心管，用于測定蛋白質(zhì)含量和電泳. .分級鹽析分級鹽析實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離純化。實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離純化。在血清中加入硫酸銨，當(dāng)飽和度為在血清中加入硫酸銨，當(dāng)飽和度為50%50%時(shí)，血時(shí)，血清白蛋白不沉淀，球蛋白析出，飽和度達(dá)清白蛋白不沉淀，球蛋白析出，飽和度達(dá)55%55%，白蛋白析出白蛋白析出。量筒量取量筒量取9 m

3、l9 ml底液（底液（50 %50 %的飽和硫酸銨溶的飽和硫酸銨溶液），液），用移液管逐滴加入，不斷搖晃。用移液管逐滴加入，不斷搖晃。4 4 靜置靜置2 h2 h；4 4 ，13,000 rpm13,000 rpm離心離心20 min20 min，收集上清，收集上清，留留0.5 ml0.5 ml（樣（樣2 2）至至1.5 ml1.5 ml離心管，用于測離心管，用于測定蛋白質(zhì)含量和電泳；定蛋白質(zhì)含量和電泳；用用5%的檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)的檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)ph至至4.5，用量筒確定上清液，用量筒確定上清液的體積，計(jì)算加入飽和硫酸銨（的體積，計(jì)算加入飽和硫酸銨（ph4.5）的體積）的體積（0.11v）；

4、）；逐滴加入飽和硫酸銨（逐滴加入飽和硫酸銨（ph4.5），振蕩，），振蕩，4 靜置靜置2 h；4 ，3,000 rpm離心離心20 min，棄上清，沉淀用，棄上清，沉淀用0.5 ml ph7.4的檸檬酸緩沖液溶解，置透析袋中，放入的檸檬酸緩沖液溶解，置透析袋中，放入ph 7.4的檸檬酸緩沖液中，攪拌透析過夜至蛋白質(zhì)溶液中無的檸檬酸緩沖液中，攪拌透析過夜至蛋白質(zhì)溶液中無nh4存在；留存在；留0.1 ml（樣（樣3）至至1.5 ml離心管，用于測離心管，用于測定蛋白質(zhì)含量和電泳；定蛋白質(zhì)含量和電泳；nh4的檢測：奈氏試劑的檢測：奈氏試劑磚紅色的溶液或沉淀磚紅色的溶液或沉淀 在離子交換層析中，蛋白質(zhì)

5、對離子交換劑的結(jié)在離子交換層析中，蛋白質(zhì)對離子交換劑的結(jié)合力取決于彼此之間的靜電吸引。合力取決于彼此之間的靜電吸引。蛋白質(zhì)混合物的分離可以由改變?nèi)芤褐宣}離子蛋白質(zhì)混合物的分離可以由改變?nèi)芤褐宣}離子濃度或濃度或phph來完成來完成，對離子交換劑結(jié)合力最小的，對離子交換劑結(jié)合力最小的蛋白質(zhì)首先從層析柱中洗脫出來。蛋白質(zhì)首先從層析柱中洗脫出來。層析洗脫，可以采用保持洗脫液成分一直層析洗脫，可以采用保持洗脫液成分一直不變的方式洗脫，也可采用改變洗脫的鹽不變的方式洗脫，也可采用改變洗脫的鹽濃度和（或）濃度和（或）phph的方式洗脫，后一種方式的方式洗脫，后一種方式又可以分為兩種：一種是跳躍式的分段改又可

6、以分為兩種：一種是跳躍式的分段改變（梯度洗脫），另一種是變（梯度洗脫），另一種是漸進(jìn)式的連續(xù)漸進(jìn)式的連續(xù)改變（連續(xù)洗脫）改變（連續(xù)洗脫）。deae-deae-纖維素離子交換層析：纖維素離子交換層析：1.1.裝柱：將層析柱垂直固定。將裝柱：將層析柱垂直固定。將deae-deae-纖維素裝入柱纖維素裝入柱內(nèi)，至內(nèi)，至8-10cm8-10cm高度，平衡過夜；高度，平衡過夜；2.2.洗脫液流速調(diào)節(jié)為洗脫液流速調(diào)節(jié)為 1ml/min1ml/min；3.3.上樣：將透析袋剪開，用移液管轉(zhuǎn)至層析柱內(nèi)，待上樣：將透析袋剪開，用移液管轉(zhuǎn)至層析柱內(nèi)，待樣品進(jìn)入凝膠后再加入少量緩沖液，使樣品完全進(jìn)樣品進(jìn)入凝膠后再加

7、入少量緩沖液，使樣品完全進(jìn)入膠內(nèi)；入膠內(nèi)；4.4.洗脫：采用連續(xù)梯度洗脫，用洗脫：采用連續(xù)梯度洗脫，用0.020.021.0mol1.0moll l醋醋酸醋酸銨緩沖液（酸醋酸銨緩沖液（ph7.4ph7.4）進(jìn)行洗脫，收集；）進(jìn)行洗脫，收集；5.5.記錄出現(xiàn)峰值的管號記錄出現(xiàn)峰值的管號( (樣品樣品4,4,) )洗脫速度慢，可直接換洗脫速度慢，可直接換b b液（液（ 1.0mol1.0moll l醋酸醋酸銨緩沖液）醋酸醋酸銨緩沖液） 電泳遷移率與顆粒的電荷、形狀、大小電泳遷移率與顆粒的電荷、形狀、大小（分子量）有關(guān)，如電荷、形狀都一樣，（分子量）有關(guān)，如電荷、形狀都一樣，則電泳遷移率只與分子量有

8、關(guān)。則電泳遷移率只與分子量有關(guān)。sdssds的作用：的作用：1.1.能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑（巰基乙醇）能白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑（巰基乙醇）能使二硫鍵斷裂，使蛋白質(zhì)完全變性；使二硫鍵斷裂，使蛋白質(zhì)完全變性；2.2.能與變性的能與變性的蛋白質(zhì)按比例結(jié)合，形成蛋白質(zhì)按比例結(jié)合，形成sds-sds-蛋白質(zhì)復(fù)合物。蛋白質(zhì)復(fù)合物。sds-sds-蛋白質(zhì)復(fù)合物的特點(diǎn)：蛋白質(zhì)復(fù)合物的特點(diǎn)：1. 1. 由于結(jié)合大量的由于結(jié)合大量的sdssds，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)；使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)；2.2.復(fù)合物都是橢復(fù)合物都是

9、橢圓棒狀。圓棒狀。因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子量分子量大小。大小。測定各條帶的相對遷移測定各條帶的相對遷移率，根據(jù)已知蛋白質(zhì)分率，根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對遷移子量和它們的相對遷移率，以相對遷移率為橫率，以相對遷移率為橫坐標(biāo)，坐標(biāo)，lgmw為縱坐標(biāo)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)未知作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對遷移率從蛋白質(zhì)的相對遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它們的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它們的lgmw，再換算成蛋白，再換算成蛋白質(zhì)分子量質(zhì)分子量測定各條帶的相對遷移率，根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對遷移率，以相對遷移率為橫坐標(biāo)為測定各條帶的相對

10、遷移率，根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對遷移率，以相對遷移率為橫坐標(biāo)為lgmw為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它們的為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它們的lgmw，再換算成蛋白質(zhì)分子量，再換算成蛋白質(zhì)分子量在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：線性關(guān)系，符合下式：logmw=k-bx（mw為分子為分子量，量，x為遷移率，為遷移率，k、b均為常數(shù)）均為常數(shù)）若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲

11、線，未知蛋白質(zhì)在相同數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。曲線上求得分子量。向標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或待測樣品中按比例加入上樣向標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或待測樣品中按比例加入上樣緩沖液，充分溶解后，加蓋（不要密閉），緩沖液，充分溶解后，加蓋（不要密閉），置沸水浴置沸水浴3 min，取出冷至室溫。，取出冷至室溫。上樣順序：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；樣品上樣順序：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；樣品1；樣品；樣品2；樣品樣品3；柱層析高峰管號的蛋白質(zhì)樣品柱層析高峰管號的蛋白質(zhì)樣品4,；加樣量：加樣量：20l.電泳：點(diǎn)樣端負(fù)極，恒壓：開始電泳：點(diǎn)樣端負(fù)

12、極，恒壓：開始80v，待樣品進(jìn)，待樣品進(jìn)入分離膠后入分離膠后120v。電極緩沖液：電極緩沖液：ph 8.3 tris gly染色：脫色考馬斯亮蘭染色：脫色考馬斯亮蘭r-250，過夜。，過夜。脫色：先用蒸餾水沖洗凝膠，再用脫色液（冰醋脫色：先用蒸餾水沖洗凝膠，再用脫色液（冰醋酸：蒸餾水：甲醇酸：蒸餾水：甲醇=75：875：50）脫色）脫色1-3h?？捡R斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)g250g250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在峰在465nm465nm。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)呈藍(lán)。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)呈藍(lán)色，其最大吸收峰改變?yōu)樯?，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm595nm

13、，考馬斯亮藍(lán)，考馬斯亮藍(lán)g250 g250 - -蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測定的高敏感度定的高敏感度. .在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍(lán)在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍(lán)g250-g250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈蛋白質(zhì)復(fù)合物呈色后，在色后，在595nm 595nm 下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)濃度的測定關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)濃度的測定 標(biāo)準(zhǔn)蛋白液：標(biāo)準(zhǔn)蛋白液：50g/ ml；樣；樣1、2、3稀釋稀釋100倍倍樣樣1稀釋稀釋600倍（倍（10 l6mll6ml）；樣）；樣2 2、3 3稀釋稀釋200倍（倍（10 ll2ml2ml）；各峰）；各峰稀釋稀釋5-10倍（倍（10 l6mll6ml）a a、膠的制備、膠的制備b b 加樣：各步驟留樣的樣液；層析后的蛋白峰。加樣：各步驟留樣的樣液；層析后的蛋白峰。樣品的處理：樣品加等量的樣品的處理：樣品加等量的40%40%蔗糖溶液蔗糖溶液、一滴一滴0.1%0.1%溴酚藍(lán)。溴酚藍(lán)。加樣量：加樣量：2020l l樣品樣品+ 5+ 5( (. .c c 電泳：點(diǎn)樣端負(fù)極，恒壓電泳：點(diǎn)樣端負(fù)