現(xiàn)代微生物遺傳學(xué)單元PPT課件

1、第一節(jié) 質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)和命名 質(zhì)粒： 存在于細菌、真菌等微生物細胞中、獨立于染色體外、能進行自我復(fù)制的遺傳因子。 對于宿主，一般是非必需的 通常是共價(covalent)、閉合(closed)、環(huán)狀(circular)雙鏈DNA.(但也有例外：線狀DNA，RNA) 附加體：整合在染色體上，或游離，并能攜帶宿主的染色體基因。第1頁/共32頁 一、質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn) F質(zhì)粒(1946年)，第一個被發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒 20世紀50-70年代：抗性質(zhì)粒的大量研究，以及其他質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn) 20世紀70年代后，質(zhì)粒廣泛應(yīng)用于遺傳工程和分子生物學(xué)研究中。第2頁/共32頁 二、質(zhì)粒的命名原則 最初發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒由研究者根據(jù)表型、大小等特

2、征自行命名。(F因子、R質(zhì)粒、Col質(zhì)粒等) 1976年Novick提出了質(zhì)粒命名原則： 質(zhì)粒名稱一般由三個英文字母及編號組成； 第一個字母一律小寫p表示（plasmid） 后兩個字母要大寫，可以采用發(fā)現(xiàn)者人名、實驗室名稱、表型性狀或其他特征的英文縮寫。 編號為阿拉伯數(shù)字，用于區(qū)分同一類型的不同質(zhì)粒。(pUC18, pUC19等)第3頁/共32頁第二節(jié) 質(zhì)粒編碼的遺傳表型 大多數(shù)質(zhì)粒均控制著宿主細胞的一種或幾種特殊性狀，具有一定的表型，質(zhì)?？梢罁?jù)其表型不同可劃分為以下幾類： 1.致育質(zhì)粒 2.抗藥性質(zhì)粒 組成：轉(zhuǎn)移區(qū)和抗性決定子 抗藥的機制：改變抗生素作用的靶點；修飾抗生素；組織抗生素進入；產(chǎn)

3、生一種酶能代替宿主細胞中被抗生素作用的靶點。第4頁/共32頁 3.產(chǎn)生抗生素的質(zhì)粒 細菌素：細菌產(chǎn)生的一般只能抑制或殺死種內(nèi)不同亞種或菌株中敏感細菌的特殊多肽類代謝產(chǎn)物。 Col質(zhì)粒：10種，有非接合型和接合型之分。 4.產(chǎn)生毒性的質(zhì)粒(BT) 5.降解質(zhì)粒： 假單胞菌屬是一類能廣泛利用有機化合物進行生長的細菌。其體內(nèi)含有大量的降解質(zhì)粒。 6.致病性質(zhì)粒： 根癌土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒；以及破傷風梭菌、肉毒梭菌和大腸桿菌等都存在致病性質(zhì)粒。第5頁/共32頁 7. 共生固氮質(zhì)粒 根瘤菌普遍喊有該類質(zhì)粒。 包括共生質(zhì)粒和非共生質(zhì)粒，非共生質(zhì)粒對共生作用可有正或負的調(diào)節(jié)作用。 8. 隱蔽質(zhì)粒(crypt

4、ic plasmid) 酵母的2m質(zhì)粒（p171） 長為2m的6kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子 位于酵母細胞核內(nèi)，50100拷貝 只攜帶與復(fù)制和重組有關(guān)的4 個基因，無遺傳表型 質(zhì)粒上有兩個600bp長的IR，被一個2.7kb區(qū)域和一個2.3kb小區(qū)域所間隔 兩個IR上都有一個專一重組位點(FRT)，經(jīng)過重組，可使質(zhì)?；プ儺悩?gòu)成A型和B型。第6頁/共32頁第三節(jié) 質(zhì)粒的檢測 檢測質(zhì)粒的方法主要根據(jù)質(zhì)粒的（遺傳學(xué)特性）和（分子結(jié)構(gòu)特性）。 遺傳特性：獨特的表型、轉(zhuǎn)移、人為消除等。 分子結(jié)構(gòu)：cccDNA和染色體相比對理化因子有更強的抗性。第7頁/共32頁 一、質(zhì)粒消除（理化因子和生物學(xué)方法） 理化因子

5、消除法 消除劑：吖啶類，EB，某些抗生素，高溫，UV等 如何判斷某一遺傳性狀的喪失是質(zhì)粒消除的結(jié)果還是染色體基因突變的結(jié)果呢？ 回復(fù)突變情況 突變率 理化因子消除質(zhì)粒的作用機制： 對質(zhì)粒本身的復(fù)制和分離產(chǎn)生抑制作用，在生長中被淘汰 選擇性抑制帶有質(zhì)粒的菌的生長。第8頁/共32頁 2.原生質(zhì)體消除法 使待消除質(zhì)粒的菌株在一定條件下形成原生質(zhì)體，在再生后生長的菌株中可出現(xiàn)高頻率質(zhì)粒消除菌。第9頁/共32頁 二、遺傳轉(zhuǎn)移 將質(zhì)粒導(dǎo)入已經(jīng)消除了該質(zhì)粒的原宿主細胞，比較導(dǎo)入前后表型性狀的差異或恢復(fù)程度。 三、分子雜交 在初步確定某菌株可能含有質(zhì)粒的情況下，利用已知表型性狀的基因片段作探針進行分子雜交，來

6、檢測其菌株是否含有該種質(zhì)粒。第10頁/共32頁 四、質(zhì)粒的分離、檢測與純化 質(zhì)粒分離方法：堿變性法 菌體的培養(yǎng)和收集 溶菌 堿變性處理 離心分離 有時為了快速提取質(zhì)粒DNA，可以在提取液堿變性后，用pH4.8的醋酸鈉高鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH到中性，這時染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而即使變性的質(zhì)?？梢曰謴?fù)到原來的構(gòu)型，再通過離心，這樣可以縮短提取質(zhì)粒的時間。 第11頁/共32頁 純化和檢測方法 瓊脂糖凝膠電泳(質(zhì)粒3種構(gòu)型泳動速度不同，瓊脂糖濃度，EB染色，分子量的判斷) 氯化銫-EB密度梯度離心 電鏡觀察第12頁/共32頁第四節(jié) 質(zhì)粒的復(fù)制與調(diào)節(jié) 一、質(zhì)粒的大小和拷貝數(shù) 1.大小測定

7、表示方式：MD或kb，1MD的雙鏈DNA1.65kb。 測定方法：電泳、電鏡、測序。 大小范圍：1200kb，個別8001000。 2.質(zhì)粒的拷貝數(shù) 嚴緊型質(zhì)粒(stringent plasmid)或低拷貝質(zhì)粒； 松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)或高拷貝質(zhì)粒。（氯霉素可抑制細胞分離，終止染色體復(fù)制，但松弛型質(zhì)?？沙掷m(xù)復(fù)制，其拷貝數(shù)可達到10003000）。第13頁/共32頁 二、質(zhì)粒的復(fù)制 1.質(zhì)粒復(fù)制的方式(P120) 質(zhì)粒的復(fù)制起點稱為oriV,大腸桿菌為oriC。 復(fù)制主要通過型復(fù)制和滾環(huán)復(fù)制之一進行。其中以型復(fù)制為主（包括單向和雙向）。 質(zhì)粒只編碼一種或少數(shù)幾種與復(fù)制有關(guān)的

8、蛋白質(zhì)，其他復(fù)制蛋白都來自宿主。第14頁/共32頁 2.復(fù)制起點區(qū)oriV的功能和pBR322質(zhì)粒 復(fù)制起點區(qū)oriV功能與質(zhì)粒載體的構(gòu)建、寄主范圍 pBR322質(zhì)粒：pMB1的ori和rop（ROP蛋白對質(zhì)粒的復(fù)制負調(diào)控）區(qū)；pSC101的tetr；Tn3的ampr。屬中等拷貝質(zhì)粒，1030個/細胞 pUC類：高拷貝質(zhì)粒（100300個/細胞），也是pMB1的ori，但是沒有rop。第15頁/共32頁 質(zhì)粒的寄主范圍和質(zhì)粒的拷貝數(shù)均決定于質(zhì)粒的ori區(qū)域。第16頁/共32頁三、質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控 質(zhì)粒的調(diào)控一般采用直接或間接的負調(diào)控機制。 負調(diào)控因子可是蛋白質(zhì)、RNA或DNA重復(fù)序列。 調(diào)控類型

9、可分兩類： 抑制物-靶位調(diào)控(inhibitor-target regulation) 重復(fù)子-競爭結(jié)合調(diào)控(iteron-binding regulation)第17頁/共32頁 1.抑制物-靶位調(diào)控 依賴一小段反向轉(zhuǎn)錄的RNA作為抑制物，通過它與質(zhì)粒DNA復(fù)制引物或編碼Rep蛋白（復(fù)制蛋白）的mRNA的互補結(jié)合以阻止質(zhì)粒復(fù)制的起始。 (1) ColE1質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控（P122圖5-7）第18頁/共32頁 抑制物（負調(diào)控因子）：反義RNA、Rop蛋白 靶位：質(zhì)粒復(fù)制的前提引物 機制：反義RNA和引物RNA互補結(jié)合，阻止其發(fā)揮作用；Rop 蛋白具有強化反義RNA和引物RNA結(jié)合的作用。是抑制物對

10、靶位的直接調(diào)控模型。第19頁/共32頁 (2)R1質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控 抑制物通過抑制Rep蛋白的形成而阻止了該蛋白對oriV的激活作用。是間接調(diào)控模型。 抑制物： CopB蛋白：是PrepA啟動子的阻遏蛋白；copA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA：Rep蛋白mRNA互補，抑制其合成 靶位：Rep蛋白的合成 第20頁/共32頁 2.重復(fù)子-競爭結(jié)合調(diào)控 采用該機制進行調(diào)控的質(zhì)粒為重復(fù)子質(zhì)粒。 在復(fù)制起始位點ori和復(fù)制基因rep附近存在著多個長度為1722bp的DNA短片段。這些短片段叫重復(fù)子。 重復(fù)子能與復(fù)制必需的Rep蛋白競爭性結(jié)合，從而抑制了質(zhì)粒的復(fù)制和拷貝數(shù)的增加。 pSC101、F、P1等都屬于重復(fù)子

11、質(zhì)粒。第21頁/共32頁 重復(fù)子質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控機制（兩種,p124-125） (1)轉(zhuǎn)錄自體調(diào)控：RepA蛋白通過與自身啟動子區(qū)的某些序列（如pSC101中的反向重復(fù)序列IR1和IR2）的結(jié)合而抑制自身的合成，這種方式叫做轉(zhuǎn)錄自體調(diào)控。第22頁/共32頁 (2)偶聯(lián)模型調(diào)控：由于重復(fù)子序列間的相互作用使兩個質(zhì)粒偶聯(lián)在一起，從而抑制了質(zhì)粒復(fù)制的起始，該方式即為偶聯(lián)模型。 質(zhì)粒濃度低時， RepA蛋白只與一個質(zhì)粒結(jié)合； 質(zhì)粒濃度高時， RepA蛋白通過與重復(fù)子序列的結(jié)合使兩個質(zhì)粒聯(lián)結(jié)在一起，阻止質(zhì)粒的復(fù)制。第23頁/共32頁 F質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控 F質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)也含有1922bp的重復(fù)序列，repE基因

12、編碼的RepE蛋白也是質(zhì)粒復(fù)制所必需的。 RepE蛋白是一種自體調(diào)控蛋白，可能也是通過與自身啟動子結(jié)合對自身濃度進行調(diào)控。 RepE蛋白通過與重復(fù)子序列結(jié)合抑制質(zhì)粒復(fù)制。第24頁/共32頁四、質(zhì)粒之間的不相容性 不相容性(incompatibility): 親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒，在非選擇性條件下不能穩(wěn)定存在于同一個細胞中，該種特性為質(zhì)粒的不相容性。與質(zhì)粒的復(fù)制起始的控制密切相關(guān)。 同種質(zhì)粒的衍生物總是不相容的； 不同質(zhì)粒的衍生物可能相容，也可能不相容。 不相容群(incompatibility group)：不能在同一個細胞中同時穩(wěn)定存在的質(zhì)粒屬于一個不相容群。因此，不同的不相容群的質(zhì)粒能同

13、時穩(wěn)定存在于一個細胞中。第25頁/共32頁五、質(zhì)粒的穩(wěn)定性 質(zhì)粒的不穩(wěn)定性包括：分離的不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。 質(zhì)粒分配到子細胞中的途徑包括：主動分配(active distribution)和隨機分配(random distribution)兩種方式。第26頁/共32頁 1.主動分配機理 該類質(zhì)粒一般為低拷貝質(zhì)粒。其穩(wěn)定性通過質(zhì)粒編碼的基因產(chǎn)物來實現(xiàn)，包括編碼主動分配體系的par區(qū)和致死基因。par區(qū)：即分配區(qū)partition region，指在細胞分裂過程中使質(zhì)?？截悢?shù)均等分配到子細胞中的質(zhì)粒DNA序列。 質(zhì)粒的復(fù)制與分配是分開獨立進行的。第27頁/共32頁 F質(zhì)粒的par區(qū)結(jié)構(gòu)和分配

14、機理 結(jié)構(gòu)（p128圖5-13）：反式作用基因(sopA, sopB)，順式作用位點(sopC)。 機理： sopC區(qū)的功能類似于真核染色體上的著絲粒，所以又稱為類著絲粒位點(centromete-like site)。反式作用蛋白SopB與順式作用位點sopC區(qū)結(jié)合形成成為分配復(fù)合體的蛋白-核酸復(fù)合物。該復(fù)合物參與質(zhì)粒的分配。如缺失sopABC片段，質(zhì)粒進行隨機分配。 SopA蛋白的功能： SopA蛋白和SopB蛋白屬自體阻遏蛋白。 SopB促進SopA和其自身啟動子結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄?？刂芐opB蛋白濃度。第28頁/共32頁 寄主致死體系(host-killing mechanism) 通過殺

15、死細胞分裂后出現(xiàn)的無質(zhì)粒子細胞的方式，而達到提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的目的。 在F質(zhì)粒中控制寄主致死功能的基因有ccdA,ccdB。 CcdB的致死功能：抑制DNA解旋酶活性；或 引發(fā)解旋酶誘導(dǎo)寄主染色體DNA發(fā)生雙鏈斷裂。 CcdA功能：破壞CcdB活性，抑制CcdB給寄主細胞帶來的毒性。 致死機制： CcdA蛋白不穩(wěn)定，而CcdB穩(wěn)定，因此在新產(chǎn)生的無質(zhì)粒的細胞中， CcdB發(fā)揮起功能而殺死細胞。 其它質(zhì)粒的致死體系和作用機理和F質(zhì)?？赡懿煌?。（比如R1質(zhì)粒）第29頁/共32頁 2. 隨機分配機制 ColE1等多數(shù)高拷貝質(zhì)粒一般沒有專門的par基因，可以依賴于高拷貝質(zhì)粒的隨機分配來實現(xiàn)分裂過程中的穩(wěn)定性。 對于分子生物學(xué)中，當細胞分裂過于旺盛或培養(yǎng)基耗盡時可能出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的細胞，可以通過選擇壓力的方式淘汰之。第30頁/共32頁六、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性 自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒：質(zhì)粒能