考研分子生物學(xué)常見(jiàn)試題

1、分子生物學(xué)常見(jiàn)試題一, 名詞解釋1, 基因:能夠表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)和rna的dna序列,是決定遺傳性狀的功能單位.2, 基因組:細(xì)胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和.3, 端粒:以線性染色體形式存在的真核基因組dna末端都有一種特殊的結(jié)構(gòu)叫端粒.該結(jié)構(gòu)<br>是一段dna序列和蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體,僅在真核細(xì)胞染色體末端存在.4, 操縱子:是指數(shù)個(gè)功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起,構(gòu)成信息區(qū),連同其上游的調(diào)控區(qū)(包括啟動(dòng)子和操縱基因)以及下游的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)所構(gòu)成的基因表達(dá)單位,所轉(zhuǎn)錄的rna為多順?lè)醋?5, 順式作用元件:是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān),能夠被基因調(diào)控蛋白特異

2、性識(shí)別和結(jié)合的特異dna序列.包括啟動(dòng)子,上游啟動(dòng)子元件,增強(qiáng)子,加尾信號(hào)和一些反應(yīng)元件等.6, 反式作用因子:是指真核細(xì)胞內(nèi)含有的大量可以通過(guò)直接或間接結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子.7, 啟動(dòng)子:是rna聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的dna序列.8, 增強(qiáng)子:位于真核基因中遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn),能明顯增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率的特殊dna序列.它可位于被增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄基因的上游或下游,也可相距靶基因較遠(yuǎn).9, 基因表達(dá):是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄,翻譯等一系列過(guò)程,合成特定的蛋白質(zhì),進(jìn)而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的全過(guò)程.10, 信息分子:調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì).

3、其中由細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生命活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)稱為細(xì)胞間信息分子;而在細(xì)胞內(nèi)傳遞信息調(diào)控信號(hào)的化學(xué)物質(zhì)稱為細(xì)胞內(nèi)信息分子.11, 受體:是存在于靶細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)能特異識(shí)別生物活性分子并與之結(jié)合,進(jìn)而發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)的的特殊蛋白質(zhì).12, 分子克隆:在體外對(duì)dna分子按照即定目的和方案進(jìn)行人工重組,將重組分子導(dǎo)入合適宿主,使其在宿主中擴(kuò)增和繁殖,以獲得該dna分子的大量拷貝.13, 蛋白激酶:是指能夠?qū)⒘姿峒瘓F(tuán)從磷酸供體分子轉(zhuǎn)移到底物蛋白的氨基酸受體上的一大類酶.14, 蛋白磷酸酶:是具有催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)分子發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的一類酶分子,與蛋白激酶相對(duì)應(yīng)存在,共同構(gòu)成了磷酸化和去磷酸化這一重

4、要的蛋白質(zhì)活性的開(kāi)關(guān)系統(tǒng).15, 基因工程:有目的的通過(guò)分子克隆技術(shù),人為的操作改造基因,改變生物遺傳性狀的系列過(guò)程.16, 載體:能在連接酶的作用下和外源dn*段連接并運(yùn)送dna分子進(jìn)入受體細(xì)胞的dna分子.17, 轉(zhuǎn)化:指質(zhì)粒dna或以它為載體構(gòu)建的重組dna導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程.18, 感染:以噬菌體,粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組dna分子,在體外經(jīng)過(guò)包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒,才能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞,并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增.19, 轉(zhuǎn)導(dǎo):指以噬菌體為載體,在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移dna的過(guò)程,有時(shí)也指在真核細(xì)胞之間通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移和獲得細(xì)胞dna的過(guò)程.20, 轉(zhuǎn)染:指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組

5、子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程.21, dna變性:在物理或化學(xué)因素的作用下,導(dǎo)致兩條dna鏈之間的氫鍵斷裂,而核酸分子中的所有共價(jià)鍵則不受影響.22, dna復(fù)性:當(dāng)促使變性的因素解除后,兩條dna鏈又可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合形成dna雙螺旋結(jié)構(gòu).23, 退火:指將溫度降至引物的tm值左右或以下,引物與dna摸板互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合形成雜交鏈.24, 筑巢pcr:先用一對(duì)外側(cè)引物擴(kuò)增含目的基因的大片段,再用內(nèi)側(cè)引物以大片段為摸板擴(kuò)增獲取目的基因.可以提高pcr的效率和特異性.25, 原位pcr:以組織固定處理細(xì)胞內(nèi)的dna或rna作為靶序列,進(jìn)行pcr反應(yīng)的過(guò)程.26, 定量pcr:基因表達(dá)涉及的轉(zhuǎn)錄水平的研

6、究常需要對(duì)mrna進(jìn)行定量測(cè)定,對(duì)此采用的pcr技術(shù)就叫定量pcr.27, 基因打靶:是指通過(guò)dna定點(diǎn)同源重組,改變基因組中的某一特定基因,從而在生物活體內(nèi)研究此基因的功能.28, dna芯片na芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量的dna探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面,然后與標(biāo)記的樣品雜交,通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)析,即可獲得樣品的遺傳信息.由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物,所以稱為dna芯片.29, 錯(cuò)義突變:dna分子中堿基對(duì)的取代,使得mrna的某一密碼子發(fā)生變化,由它所編碼的氨基酸就變成另一種的氨基酸,使得多肽鏈中的氨基酸順序也相應(yīng)的發(fā)生改變的突變.3

7、0, 無(wú)義突變:由于堿基對(duì)的取代,使原來(lái)可以翻譯某種氨基酸的密碼子變成了終止密碼子的突變.31, 同義突變:堿基對(duì)的取代并不都是引起錯(cuò)義突變和翻譯終止,有時(shí)雖然有堿基被取代,但在蛋白質(zhì)水平上沒(méi)有引起變化,氨基酸沒(méi)有被取代,這是因?yàn)橥蛔兒蟮拿艽a子和原來(lái)的密碼子代表同一個(gè)氨基酸的突變.32, 移碼突變:在編碼序列中,單個(gè)堿基,數(shù)個(gè)堿基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突變位點(diǎn)之后的三聯(lián)體密碼閱讀框發(fā)生改變,不能編碼原來(lái)的蛋白質(zhì)的突變.33, 癌基因:是細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長(zhǎng)的基因,具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的特性.當(dāng)癌基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)發(fā)生異常時(shí),其產(chǎn)物可使細(xì)胞無(wú)限制增殖,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生.包括病毒

8、癌基因和細(xì)胞癌基因.34, 細(xì)胞癌基因:存在于正常的細(xì)胞基因組中,與病毒癌基因有同源序列,具有促進(jìn)正常細(xì)胞生長(zhǎng),增殖,分化和發(fā)育等生理功能.在正常細(xì)胞內(nèi)未激活的細(xì)胞癌基因叫原癌基因,當(dāng)其受到某些條件激活時(shí),結(jié)構(gòu)和表達(dá)發(fā)生異常,能使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化.35, 病毒癌基因:存在于病毒(大多是逆轉(zhuǎn)錄病毒)基因組中能使靶細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的基因.它不編碼病毒結(jié)構(gòu)成分,對(duì)病毒無(wú)復(fù)制作用,但是當(dāng)受到外界的條件激活時(shí)可產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用.36, 基因診斷:以dna或rna為診斷材料,通過(guò)檢查基因的存在,結(jié)構(gòu)缺陷或表達(dá)異常,對(duì)人體的狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過(guò)程.37, rflp:即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性,個(gè)體

9、之間dna的核苷酸序列存在差異,稱為dna多態(tài)性.若因此而改變了限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)則可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長(zhǎng)度和數(shù)量發(fā)生變化,稱為rflp.38, 基因治療:一般是指將限定的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入患者特定的靶細(xì)胞,以最終達(dá)到預(yù)防或改變特殊疾病狀態(tài)為目的治療方法.39, 反義rna:堿基序列正好與有意義的mrna互補(bǔ)的rna稱為反義rna.可以作為一種調(diào)控特定基因表達(dá)的手段.40, 核酶:是一種可以催化rna切割和rna剪接反應(yīng)的由rna組成的酶,可以作為基因表達(dá)和病毒復(fù)制的抑制劑.41, 三鏈dna:當(dāng)某一dna或rna寡核苷酸與dna高嘌呤區(qū)可結(jié)合形成三鏈,能特異地結(jié)合在dna的大溝中,并與富含

10、嘌呤鏈上的堿基形成氫鍵.42, sscp:單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)是一種基于dna構(gòu)象差別來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變的方法.相同長(zhǎng)度的單鏈dna,如果堿基序列不同,形成的構(gòu)象就不同,這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性.43, 管家基因:在生物體生命的全過(guò)程都是必須的,且在一個(gè)生物個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的基因.44, 細(xì)胞全能性:指同一種生物的所有細(xì)胞都含有相同的dna,即基因的數(shù)目和種類是一樣的,但在不同階段,同一個(gè)體的不同組織和器官中基因表達(dá)的種類和數(shù)目是不同的.45, sd序列:轉(zhuǎn)錄出的mrna要進(jìn)入核糖體上進(jìn)行翻譯,需要一段富含嘌呤的核苷酸序列與大腸桿菌16s rrna3,末端富含嘧啶的序列互補(bǔ),是核糖體的識(shí)

11、別位點(diǎn).46, 反義核酸技術(shù):是通過(guò)合成一種短鏈且與dna或rna互補(bǔ)的,以dna或rna為目標(biāo)抑制翻譯的反義分子,干擾目的基因的轉(zhuǎn)錄,剪接,轉(zhuǎn)運(yùn),翻譯等過(guò)程的技術(shù).47, 核酸探針:探針是指能與某種大分子發(fā)生特異性相互作用,并在相互作用之后可以檢測(cè)出來(lái)的生物大分子.核酸探針是指能識(shí)別特異堿基順序的帶有標(biāo)記的一段dna或rna分子.48, 周期蛋白:是一類呈細(xì)胞周期特異性或時(shí)相性表達(dá),累積與分解的蛋白質(zhì),它與周期素依賴性激酶共同影響細(xì)胞周期的運(yùn)行.49, cap:是大腸桿菌分解代謝物基因活化蛋白,這種蛋白可將葡萄糖饑餓信號(hào)傳遞個(gè)許多操縱子,使細(xì)菌在缺乏葡萄糖時(shí)可以利用其他碳源.50, 順?lè)醋?

12、1, 結(jié)構(gòu)域二, 問(wèn)答題(一),病毒,原核,真核基因組的特點(diǎn)答:1,病毒基因組的特點(diǎn): 種類單一;單倍體基因組:每個(gè)基因組在病毒中只出現(xiàn)一次;形式多樣;大小不一;基因重疊;動(dòng)物/細(xì)菌病毒與真核/原核基因相似:內(nèi)含子;具有不規(guī)則的結(jié)構(gòu)基因;基因編碼區(qū)無(wú)間隔:通過(guò)宿主及病毒本身酶切;無(wú)帽狀結(jié)構(gòu);結(jié)構(gòu)基因沒(méi)有翻譯起始序列.2,原核基因組的特點(diǎn):為一條環(huán)狀雙鏈dna;只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn);具有操縱子結(jié)構(gòu);絕大部分為單拷貝;可表達(dá)基因約50%,大于真核生物小于病毒;基因一般是連續(xù)的,無(wú)內(nèi)含子;重復(fù)序列很少.3,真核基因組的特點(diǎn):真核生物基因組遠(yuǎn)大于原核生物基因組,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,基因數(shù)龐大,具有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn);基因

13、組dna與蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體,儲(chǔ)存于細(xì)胞核內(nèi);真核基因?yàn)閱雾樂(lè)醋?而細(xì)菌和病毒的結(jié)構(gòu)基因多為多順?lè)醋?基因組中非編碼區(qū)多于編碼區(qū);真核基因多為不連續(xù)的斷裂基因,由外顯子和內(nèi)含子鑲嵌而成;存在大量的重復(fù)序列;功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族;存在可移動(dòng)的遺傳因素;體細(xì)胞為雙倍體,而精子和卵子為單倍體.(二),乳糖操縱子的作用機(jī)制答:1,乳糖操縱子的組成:大腸桿菌乳糖操縱子含z,y,a三個(gè)結(jié)構(gòu)基因,分別編碼半乳糖苷酶,透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶,此外還有一個(gè)操縱序列o,一個(gè)啟動(dòng)子p和一個(gè)調(diào)節(jié)基因i.2,阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié):沒(méi)有乳糖存在時(shí),i基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列o處,乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài),

14、不能合成分解乳糖的三種酶;有乳糖存在時(shí),乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu),不能結(jié)合于操縱序列,乳糖操縱子被誘導(dǎo)開(kāi)放合成分解乳糖的三種酶.所以,乳糖操縱子的這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控.3,cap的正性調(diào)節(jié):在啟動(dòng)子上游有cap結(jié)合位點(diǎn),當(dāng)大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時(shí),camp濃度升高,與cap結(jié)合,使cap發(fā)生變構(gòu),cap結(jié)合于乳糖操縱子啟動(dòng)序列附近的cap結(jié)合位點(diǎn),激活rna聚合酶活性,促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄,對(duì)乳糖操縱子實(shí)行正調(diào)控,加速合成分解乳糖的三種酶.4,協(xié)調(diào)調(diào)節(jié):乳糖操縱子中的i基因編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控與cap的正調(diào)控

15、兩種機(jī)制,互相協(xié)調(diào),互相制約.(三),真核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制答:真核生物在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要是通過(guò)反式作用因子,順式作用元件和rna聚合酶的相互作用來(lái)完成的,主要是反式作用因子結(jié)合順式作用元件后影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過(guò)程.1, 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成:真核生物rna聚合酶識(shí)別的是由通用轉(zhuǎn)錄因子與dna形成的蛋白質(zhì)-dna復(fù)合物,只有當(dāng)一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到dna上,形成有功能的啟動(dòng)子,才能被rna聚合酶所識(shí)別并結(jié)合.轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過(guò)程為:tfd結(jié)合tata盒;rna聚合酶識(shí)別并結(jié)合tfd-dna復(fù)合物形成一個(gè)閉合的復(fù)合物;其他轉(zhuǎn)錄因子與rna聚合酶結(jié)合形成一個(gè)開(kāi)放復(fù)合物.在這個(gè)過(guò)程

16、中,反式作用因子的作用是:促進(jìn)或抑制tfd與tata盒結(jié)合;促進(jìn)或抑制rna聚合酶與tfd-dna復(fù)合物的結(jié)合;促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成.2, 反式作用因子:一般具有三個(gè)功能域(dna識(shí)別結(jié)合域,轉(zhuǎn)錄活性域和結(jié)合其他蛋白結(jié)合域);能識(shí)別并結(jié)合上游調(diào)控區(qū)中的順式作用元件;對(duì)基因的表達(dá)有正性或負(fù)性調(diào)控作用.3, 轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控:反式作用因子的活性調(diào)節(jié):表達(dá)式調(diào)節(jié)反式作用因子合成出來(lái)就具有活性;共價(jià)修飾磷酸化和去磷酸化,糖基化;配體結(jié)合許多激素受體是反式作用因子;蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)復(fù)合物的解離與形成.反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合:反式作用因子被激活后,即可識(shí)別并結(jié)合上游啟

17、動(dòng)子元件和增強(qiáng)子中的保守性序列,對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用.反式作用因子的作用方式成環(huán),扭曲,滑動(dòng),oozing.反式作用因子的組合式調(diào)控作用:每一種反式作用因子結(jié)合順式作用元件后雖然可以發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用,但反式作用因子對(duì)基因調(diào)控不是由單一因子完成的而是幾種因子組合發(fā)揮特定的作用.(四),真核生物轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制答1),5,端加帽和3,端多聚腺苷酸化的調(diào)控意義:5,端加帽和3,端多聚腺苷酸化是保持mrna穩(wěn)定的一個(gè)重要因素,它至少保證mrna在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中不被降解.(2),mrna選擇性剪接對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的作用(3),mrna運(yùn)輸?shù)目刂?五),受體的特點(diǎn)答:1,高度專一性;2,高度親和性;3,可

18、逆性;4,可飽和性;5,特定的作用模式(六),表皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑答:表皮生長(zhǎng)因子受體是一個(gè)典型的蛋白酪氨酸激酶受體,這個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要步驟是:1, 受體二聚化的形成及其磷酸化:表皮生長(zhǎng)因子與受體的結(jié)合使受體發(fā)生二聚化,從而改變受體構(gòu)象,使蛋白酪氨酸激酶活性增強(qiáng),受體自身的幾個(gè)蛋白酪氨酸殘基在激酶的作用下發(fā)生磷酸化.2, 募集接頭蛋白grb2:表皮生長(zhǎng)因子受體自身被磷酸化后,不僅其激酶活性增強(qiáng),而且其構(gòu)象發(fā)生變化,從而適合與含sh2結(jié)構(gòu)域的蛋白分子相結(jié)合.grb2是作為接頭蛋白結(jié)合到受體上.3, 調(diào)控分子sos的活化:sos含有可與sh3結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的富含脯氨酸基序,當(dāng)grb2結(jié)

19、合到磷酸化的表皮生長(zhǎng)因子受體后,它的兩個(gè)sh3結(jié)構(gòu)域即可結(jié)合sos,使之活化.4, 低分子量g蛋白ras的活化:sos可促進(jìn)ras釋放gdp,結(jié)合gtp的反應(yīng),使ras激活.活化的ras作用其下游分子raf,使之活化.raf是mapk級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一個(gè)分子,由此啟動(dòng)了mapk的三級(jí)激活過(guò)程.5, mapk的級(jí)聯(lián)激活:raf是一種mapkkk,它作用于mek,使之磷酸化而激活,活化的mek在作用于mapk家族的erk1,使之磷酸化激活由此完成了三級(jí)激活.6, 轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化及轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用:活化的erk可以轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi),使某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)生磷酸化,從而影響基因的轉(zhuǎn)錄.(七),camp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

20、答:1,組成:胞外信息分子(主要是胰高血糖素,腎上腺素和促腎上腺皮質(zhì)激素),受體,g蛋白,ac,camp , pka.2,途徑:信號(hào)分子與受體結(jié)合,引起受體構(gòu)象變化受體活化g蛋白活化后的g蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶(ac)ac 催化atp生成campcamp 活化pka,pka使目標(biāo)蛋白磷酸化,調(diào)節(jié)代謝酶的活性或調(diào)節(jié)基因的表達(dá)(八),ip3-ca2+信號(hào)途徑:信號(hào)分子與受體結(jié)合,引起受體構(gòu)象變化受體活化g蛋白活化后的g蛋白激活plcplc 水解pip2生成ip3 和dgip3 使鈣通道打開(kāi),細(xì)胞內(nèi)ca2+升高ca2+ 與cam結(jié)合,激活ca2+-cam依賴的蛋白激酶ca2+ -cam依賴的蛋白激酶使

21、目標(biāo)蛋白磷酸化.(九),分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件答:(1),常用的工具酶1, 限制性核酸內(nèi)切酶:是細(xì)菌產(chǎn)生的一類能識(shí)別和切割雙鏈dna分子內(nèi)特定的堿基順序的核酸水解酶.2, dna連接酶:將兩段dna分子拼接起來(lái)的酶.3, dna聚合酶:催化單核苷酸鏈延伸.4, 逆轉(zhuǎn)錄酶:依賴于rna的dna聚合酶,這是一種有效的轉(zhuǎn)錄rna成為dna的酶,產(chǎn)物dna又稱互補(bǔ)dna.5, 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶:將脫氧核糖核酸加到dna的3末端.6, 堿性磷酸酶:催化去除dna,rna等的5磷酸基團(tuán).7, 依賴dna的rna聚合酶:識(shí)別特異性啟動(dòng)子,rna轉(zhuǎn)錄.(2),良好載體的條件1,必須有自身

22、的復(fù)制子;2,載體分子上必須有限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn),即多克隆位點(diǎn),以供外源dna插入;3,載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志,以區(qū)別陽(yáng)性重組子和陰性重組子;4,載體分子必須有足夠的容量;5,可通過(guò)特定的方法導(dǎo)入細(xì)胞;6,對(duì)于表達(dá)載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子,前導(dǎo)順序,增強(qiáng)子,加尾信號(hào)等dna調(diào)控元件.(十),藍(lán)-白篩選的原理答:某些質(zhì)粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶基因片段,在半乳糖苷酶基因的基因區(qū)外又另外引入了一段含多種單一限制酶位點(diǎn)的dna序列.這些位點(diǎn)上如果沒(méi)有克隆外源性dn*段,在質(zhì)粒被導(dǎo)入lac-的大腸桿菌后,質(zhì)粒攜帶的半乳糖苷酶基因?qū)⒄１磉_(dá),與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補(bǔ),產(chǎn)生

23、有活性的半乳糖苷酶,加入人工底物x-gal和誘導(dǎo)劑iptg后,出現(xiàn)藍(lán)色的菌落.如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源dn*段,將使lac z基因滅活,不能生成半乳糖苷酶,結(jié)果菌落出現(xiàn)白色.由于這種顏色標(biāo)志,重組克隆和非重組克隆的區(qū)分一目了然.(十一)sanger雙脫氧鏈終止法的原理答:dna鏈中核苷酸以3',5'-磷酸二酯鍵連接,合成dna所用的底物是 2'-脫氧核苷三磷酸.2',3'ddntp與普通dntp不同,它們?cè)诿撗鹾颂堑?'位置缺少一個(gè)羥基.在dna聚合酶作用下通過(guò)三磷酸基團(tuán)摻入到延伸的dna鏈中,但由于沒(méi)有3'羥基,不能同后續(xù)的dntp形

24、成磷酸二酯鍵,因此,正在延伸的dna鏈不能繼續(xù)延伸.在dna合成反應(yīng)混合物的4種普通dntp中加入少量的一種ddntp,鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競(jìng)爭(zhēng),產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈,其長(zhǎng)度取決于引物末端到出現(xiàn)過(guò)早鏈終止位置間的距離.在4組獨(dú)立酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddntp,結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸,它們將分別終止于模板鏈的a,c,g或t位置.(十二),核酸分子雜交的原理答:具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定的條件下(適宜的溫度及離子強(qiáng)度等)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合,重新形成雙鏈;在這一過(guò)程中,核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化,以及在復(fù)性過(guò)程中個(gè)分子間鍵的形成和斷裂.雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知

25、序列.(十三),影響雜交的因素答:1,核酸分子的濃度和長(zhǎng)度:核酸濃度越大,復(fù)性速度越快.探針長(zhǎng)度應(yīng)控制在50-300個(gè)堿基對(duì)為好.2,溫度:溫度過(guò)高不利于復(fù)性,而溫度過(guò)低,少數(shù)堿基配對(duì)形成的局部雙鏈不易解離,適宜的溫度是較tm值低25度.3,離子強(qiáng)度:在低離子強(qiáng)度下,核酸雜交非常緩慢,隨著離子強(qiáng)度的增加,雜交反應(yīng)率增加.高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定,所以進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)必須維持雜交反應(yīng)液中的鹽濃度和洗膜液中的鹽濃度.4,雜交液中的甲酰胺:甲酰胺能降低核酸雜交的tm值.它有以下優(yōu)點(diǎn):在低溫下探針更穩(wěn)定;能更好地保留非共價(jià)結(jié)合的核酸.5,核酸分子的復(fù)雜性:是指存在于反應(yīng)體系

26、中的不同順序的總長(zhǎng)度.兩個(gè)不同基因組dna變性后的相對(duì)雜交速率取決于樣品濃度絕對(duì)一致時(shí)的相對(duì)復(fù)雜性(即dna中的堿基數(shù)).6,非特異性雜交反應(yīng):在雜交前應(yīng)對(duì)非特異性雜交反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行封閉,以減少其對(duì)探針的非特異性吸附作用.(十四),探針的種類和優(yōu)缺點(diǎn)答:1,cdna探針:通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cdna后,將其克隆于適當(dāng)?shù)目寺≥d體,通過(guò)擴(kuò)增重組質(zhì)粒而使cdna得到大量的擴(kuò)增.提取質(zhì)粒后分離純化作為探針使用.它是目前應(yīng)用最為廣泛的一種探針.2,基因組探針:從基因組文庫(kù)里篩選得到一個(gè)特定的基因或基因片段的克隆后,大量擴(kuò)增,純化,切取插入片段,分離純化為探針.3,寡核苷酸探針:根據(jù)已知的核酸順序,采用dna合成

27、儀合成一定長(zhǎng)度的寡核苷酸片段作為探針.4,rna探針:采用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法可以得到rna或反義rna作為探針.(十五),探針的標(biāo)記法答:1,缺口平移法:此法是利用適當(dāng)濃度的dnase 在dna雙鏈上隨機(jī)切割單鏈,造成單鏈切口.切口處產(chǎn)生一個(gè)5末端和3末端,3末端就可以作為引物,在大腸桿菌dna聚合酶的催化下,以互補(bǔ)的dna單鏈為摸板,依次將dntp連接到切口的3末端的羥基上,合成新的dna單鏈;同時(shí)dna聚合酶的53的核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除,新合成鏈不斷延伸,從而使原dna分子上的部分核苷酸殘基被標(biāo)記的核苷酸所取代.2,隨機(jī)引物法:隨機(jī)引物是人工合成的長(zhǎng)度為6個(gè)寡

28、核苷酸殘基的寡聚核苷酸片段的混合物.對(duì)于任何一個(gè)用作探針的dn*段,隨機(jī)引物混合物中都會(huì)有一些六核苷酸片段可以與之結(jié)合,起到dna合成引物的作用.將這些引物與變性的dna單鏈結(jié)合后,以4種dntp(其中一種是標(biāo)記物標(biāo)記的dntp)為底物,合成與探針dna互補(bǔ)的切帶有標(biāo)記物的dna探針.3,pcr標(biāo)記法:在pcr反應(yīng)底物中,將一種dntp換成標(biāo)記物標(biāo)記的dntp, 這樣標(biāo)記的dntp就在pcr反應(yīng)的同時(shí)摻入到新合成的dna鏈上.4,末端標(biāo)記法:只是將dn*段的一端進(jìn)行標(biāo)記.(十六),pcr的基本原理答cr是在試管中進(jìn)行的dna復(fù)制反應(yīng),基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)dna半保留復(fù)制的機(jī)理,以及體外dna分

29、子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì),人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度,以促使雙鏈dna變成單鏈,單鏈dna與人工合成的引物退火,然后耐熱dna聚合酶以dntp為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈dna.pcr全過(guò)程每一步的轉(zhuǎn)換是通過(guò)溫度的改變來(lái)控制的.需要重復(fù)進(jìn)行dna模板解鏈,引物與模板dna結(jié)合,dna聚合酶催化新生dna的合成,即高溫變性,低溫退火,中溫延伸3個(gè)步驟構(gòu)成pcr反應(yīng)的一個(gè)循環(huán),此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行,就可使目的dna得以迅速擴(kuò)增.dna模板變性:模板雙鏈dna 單鏈dna,94.退火:引物+單鏈dna 雜交鏈,引物的tm值.引物的延伸:溫度至70 左右, taq dna聚合酶以

30、4種dntp為原料,以目的dna為模板,催化以引物3'末端為起點(diǎn)的5'3'dna鏈延伸反應(yīng),形成新生dna鏈.新合成的引物延伸鏈經(jīng)過(guò)變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板pcr,就是如此反復(fù)循環(huán),使目的dna得到高效快速擴(kuò)增.(十七),pcr引物設(shè)計(jì)的基本要求答:1,引物長(zhǎng)度一般為1530個(gè)核苷酸.過(guò)短影響pcr的特異性,過(guò)長(zhǎng)會(huì)提高相應(yīng)退火溫度,使延伸溫度超過(guò)taqdna聚合酶最適溫度74,影響產(chǎn)物的生成.2,引物的堿基盡可能隨機(jī),避免出現(xiàn)嘌呤,嘧啶堿基堆積現(xiàn)象.3'端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)g和c.否則會(huì)使引物和模板錯(cuò)誤配對(duì).g+c含量一般占45% -55%.3'端

31、和5'端引物具有相似的tm值,tm值計(jì)算公式:tm=4(g+c)+ 2(a+t)3,引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu).引物的連續(xù)互補(bǔ)序列,一般不超過(guò)3bp.4,兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,尤其應(yīng)避免3'端的互補(bǔ)重疊.5,引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不超過(guò)70%,引物3'末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列,否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增.6,引物3'端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn),因此一定要與模板dna配對(duì).引物3'端最佳堿基選擇是g和c,形成的堿基配對(duì)比較穩(wěn)定.7,引物與模板結(jié)合時(shí),引物的5'端最多可以游離十幾個(gè)堿基而不影響pcr

32、反應(yīng)的進(jìn)行.8,引物的5'端可以修飾,如附加限制酶位點(diǎn),引入突變位點(diǎn),用生物素,熒光物質(zhì),地高辛標(biāo)記,加入其它短序列包括起始密碼子,終止密碼子等.(十八),pcr的反應(yīng)條件答:1,pcr反應(yīng)的緩沖液:tris -hcl緩沖液kcl 促進(jìn)引物的退火,濃度太高時(shí)會(huì)抑制taq dna聚合酶活性.加入bsa或明膠有利于保護(hù)taqdna聚合酶活性.必要時(shí)加入適量二甲基亞砜(dmso)或甲酰胺利于破壞模板二級(jí)結(jié)構(gòu),提高pcr反應(yīng)特異性.2,鎂離子濃度 一般用量1.5-2.0 mmol/l,taq dna聚合酶活性需要mg 2+.mg 2+濃度過(guò)低,會(huì)顯著降低酶活性.mg 2+濃度過(guò)高又使酶催化非特

33、異性擴(kuò)增增強(qiáng).mg 2+濃度還會(huì)影響引物的退火,模板與pcr產(chǎn)物的解鏈溫度,從而影響擴(kuò)增片段的產(chǎn)率.3,底物濃度 工作濃度20-200umol/l, dntps濃度過(guò)高可加快反應(yīng)速度,也增加堿基的錯(cuò)配率和實(shí)驗(yàn)成本.降低濃度會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降,可提高反應(yīng)的特異性.在pcr反應(yīng)中,4種dntp必須以等摩爾濃度配制,以減少pcr反應(yīng)的錯(cuò)配誤差并提高使用效率.4,taq dna聚合酶 75-80時(shí)具有最高的聚合酶活性,150個(gè)核苷酸/秒;具有良好的熱穩(wěn)定性,95仍有活性,應(yīng)用濃度一般為1-2.5u/100ul反應(yīng)體積.5,引物 0.1-0.5umol/l.引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配或非特異性擴(kuò)增,生成引物

34、二聚體,使目的dna片段產(chǎn)率下降.退火溫度與引物tm值有關(guān),引物tm值在55-80 范圍較為理想.6,反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)(十九),影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達(dá)的因素答:1,啟動(dòng)子的強(qiáng)弱;2,基因的劑量;3,影響rna轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的因素:sd序列,mrna;4,外源基因密碼子的選擇;5,表達(dá)產(chǎn)物的大小;6,表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性.(二十),大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)外源基因必須具備的條件答:1,要求外源基因的編碼區(qū)不能含有內(nèi)含子;2,表達(dá)的外源片段要位于大腸桿菌啟動(dòng)子的下游,并形成正確的閱讀框架;3,轉(zhuǎn)錄出的mrna必須有與大腸桿菌16s rrna3,末端相匹配的sd序列,才能被有效的翻譯成蛋白質(zhì).4,蛋白產(chǎn)物必須穩(wěn)定,不易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶快速降解,且對(duì)宿主無(wú)害.(二十一),真核細(xì)胞表達(dá)外源基因的條件答:1,首先必須具備哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的功能元件.要求哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體帶有能在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件;2,注意選擇轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞,不同類型的細(xì)胞具有不同的特性;3,注意選擇適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記.(二十二),轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念,原理及應(yīng)用答:1,概念:是指用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi),并能穩(wěn)定傳代的一類動(dòng)物.它的特點(diǎn)是"分子及細(xì)胞水平