流式分選原理

1、BD FACSAriaIII流式分選儀的原理及應(yīng)用BD生物科學(xué) 孔祥濤400-819-9900COE_BDB_C 流式分選的原理 流式分選的影響因素 分選流程及注意事項(xiàng)流式分選儀的原理及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且能夠同時檢測直線流動狀態(tài)中的單個細(xì)胞的多項(xiàng)物理及生物學(xué)特性，加以分析定量的技術(shù)。流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer）集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細(xì)胞術(shù)分析型流式細(xì)胞儀 VS 分選型流式細(xì)胞儀CaliburAriaIIICat

2、ch tuber （捕獲管分選）唯一可選配分選裝置的小型機(jī)。電子偏轉(zhuǎn)的方式 流式分選的原理 流式分選的影響因素 分選流程及注意事項(xiàng)流式分選儀的原理及應(yīng)用完美的分選純度純度得率得率速度速度高速分選的影響因素 鞘液壓力（Pressure ) PSI 振蕩頻率 (Drop Frequency) Hz噴嘴大小 (Nozzle) m上樣速度(Sample Flow Rate ) events/sec 分選最重要的問題 Good Purity 分選后所得到的細(xì)胞是否是想要的？ Good Recovery 分選后得到的細(xì)胞數(shù)量是否夠用? Good Viability 分選后有多少細(xì)胞是活的？Aria III

3、 高純度 高得率 Sweet spot - 液滴斷點(diǎn)自動監(jiān)控 Accudrop - 液滴延遲自動調(diào)節(jié) 32等分液滴分辨率，精確分選模式Sweet Spot 液滴斷點(diǎn)自動監(jiān)測液滴斷點(diǎn)監(jiān)測窗口振幅自動調(diào)節(jié)，維持?jǐn)帱c(diǎn)穩(wěn)定阻塞報(bào)警，保護(hù)分選樣本不受 污染，實(shí)現(xiàn)分選時無人看管提高分選純度和得率高得率分選,來自于液流穩(wěn)定性Accudrop 液滴延時自動控制專利的BD Accudrop技術(shù)能夠自動地精確確定液滴延遲時間（細(xì)胞顆粒與激光正交的時間和細(xì)胞顆粒到達(dá)斷點(diǎn)處的時間這兩個時間的間隔）, 保證最高的分選純度及得率。全部自動完成精確計(jì)算，無需手動調(diào)節(jié)，并可實(shí)時監(jiān)測。高純度分選,來自于精確地充電Purity

4、and sort coincidence Purity is also maintained by detecting sort coincidenceAria III 液滴32等分分析高純度分選,來自于分析的精度Yield MaskTips: 如何提升分選的純度 設(shè)置合適的分選模式 選擇合適的噴嘴孔徑 確保穩(wěn)定的液流斷點(diǎn) 設(shè)置正確的drop delay 進(jìn)行4路分選時，將純度要求高的細(xì)胞分選設(shè)置在最外的2路 減少樣本的粘連 正確的設(shè)門 確保上樣管路清潔后回測Tips: 如何提升回收率 降低分選速度 減少純度要求 正確的drop delay 正確的加電 合適的收集管 保護(hù)細(xì)胞活力 正確的設(shè)門A

5、ria III 對細(xì)胞的保護(hù) 高活性 1. 無菌處理 Auto clean 2. 圓滑管路設(shè)計(jì) 3. NG流動池 低功率激光照射 4. 電子減速 5. 分選樣本溫控系統(tǒng) （4、25、37、42）影響細(xì)胞活性的因素： 1. 細(xì)胞本身狀態(tài) 2. 細(xì)胞受到的撞擊 3. 激光照射 4. 細(xì)胞所處溫度影響 5. 系統(tǒng)潔凈程度Tips: 如何提升活力 無菌環(huán)境的控制 降低鞘液壓力 增大噴嘴孔徑，脆弱細(xì)胞必須要用大孔徑噴嘴 包被樣本收集管 溫度控制 提升速度 流式分選的原理 流式分選的影響因素 分選流程及注意事項(xiàng)流式分選儀的原理及應(yīng)用鞘液 必須使用鹽離子緩沖溶液作為鞘液，通常是PBS，不建議使用生理鹽水 特

6、別需要維持合適的pH值，通常為中性 無菌分選時，需要高壓滅菌鞘液（建議一直使用無菌鞘液） 一般不加NaN3 注意更換鞘液過濾器合適樣本類型 細(xì)胞大小一般不超過噴嘴孔徑1/5，絕不能超過1/3 建議無菌樣本，容易維持上樣針部分的無菌條件 減少有高濃度PI的樣本，以免殘留在管路內(nèi)，影響后續(xù)樣本活性 濃度可在107/ml 一定要使用300-400目孔徑過濾網(wǎng)過濾分選前 建議先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，調(diào)整實(shí)驗(yàn)設(shè)置，并且預(yù)估回收率，選擇合適的樣本量 Ficoll分離過的PBMC使用PBS+ 1% human AB serum 調(diào)整濃度到 12 x 107 PBMCs/mL分選中 設(shè)門去除粘連體細(xì)胞 正確的分析 對于

7、需要后續(xù)培養(yǎng)或是對于內(nèi)毒素特別敏感的細(xì)胞，建議完成無菌分選準(zhǔn)備流程 選擇合適的分選精度 選擇合適的噴嘴孔徑 選擇合適的上樣速度以保證純度和得率分選中 溫度的改變對細(xì)胞不利，控制上樣艙和收集的溫度 一些細(xì)胞需要特別的培養(yǎng)基或是血清來維持活性，加入不超過2%的血清 pH值的變化同樣會對細(xì)胞活性有影響，加入不超過25 mM的HEPES到收集管中有助于維持pH 樣本的沉降容易導(dǎo)致速度的降低和細(xì)胞的聚集，導(dǎo)致堵塞，樣本分選前過濾，可使用混勻功能或上樣管過濾器，減少此類事件發(fā)生收集 收集管預(yù)先用human AB serum包被，然后加入0.4 mL X-VIVO 15 培養(yǎng)液 + 10% human AB

8、 serum 及 0.2% acetylcysteine（用于培養(yǎng)），或是PBS + 1% Human AB serum（僅用于回測） 選擇合適的收集管，并調(diào)節(jié)分選液流加電，使得分選液流盡可能打在培養(yǎng)基、PBS、血清的液面上，而不是管壁 收集后的細(xì)胞，用250g,10分鐘進(jìn)行離心，小心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)提升活性 減少樣本收集前后的處理過程，去除不必要的離心和重懸 減少剪切力效應(yīng)，輕柔使用移液槍 為減少細(xì)胞吸附到管壁，收集管使用聚丙烯材質(zhì)，并用100% human AB serum包被 分選中可暫停，輕柔混勻樣本管和收集管，確保細(xì)胞懸浮分選后 分選后回測需要確保前后條件一致，確認(rèn)進(jìn)樣針管路無殘留，回測樣本無酚紅 對于特別少的樣本，容易顯得雜質(zhì)比較多 盡量將分選后細(xì)胞的洗滌過程減少到1次，并且休整數(shù)小時后再進(jìn)行培養(yǎng)或是后續(xù)處理分選后回測1、開液流和高壓預(yù)熱30分2、定期更換鞘液濾器（一年一次）3、分選前檢查Nozzle和O-ring 4、及時清洗放置Nozzle的部位和Nozzle Locking Lever 5、檢查和更換快速接頭o-ring 6、使用PBS（不要使用生理鹽水），PBS要過濾（0.2um）儀器的維護(hù)保養(yǎng)7、選擇合適的噴嘴和壓力8、液流啟動完，立刻用DI清洗Clos