植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基及操作技術(shù)

1、第三章第三章 培養(yǎng)基及一般培養(yǎng)技術(shù)（培養(yǎng)基及一般培養(yǎng)技術(shù)（4學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）3.1 3.1 培養(yǎng)基的種類和成份（培養(yǎng)基的種類和成份（1 1學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）3.2 3.2 培養(yǎng)基的制備（母液的配制和保存；培養(yǎng)基的制備（母液的配制和保存；MSMS培養(yǎng)基的配制）（融入實(shí)培養(yǎng)基的配制）（融入實(shí)驗(yàn)課）；一般操作技術(shù)（滅菌、接種、培養(yǎng)、移栽馴化）（驗(yàn)課）；一般操作技術(shù)（滅菌、接種、培養(yǎng)、移栽馴化）（2 2學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）3.3 3.3 組培常見問題與對策（污染、褐化、玻璃化）（組培常見問題與對策（污染、褐化、玻璃化）（1 1學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）第一節(jié)第一節(jié) 培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的成分成分和和種類種類一、培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成

2、組成1 1、無機(jī)營養(yǎng)元素、無機(jī)營養(yǎng)元素(inorganic element) (inorganic element) 1)1)大量元素：大量元素：指濃度大于指濃度大于0.5mmol0.5mmolL L的元素。的元素。 NN、P P、K K、MgMg、S S和和CaCa等等 。2)2)微量元素：微量元素：指小于指小于0.5mmol0.5mmolL L的元素。的元素。 FeFe，B B，MnMn，CuCu，MoMo，ClCl等等 。 在細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)。在細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)。 種類：種類：VBl(鹽酸硫胺素鹽酸硫胺素)、 VB6(鹽酸吡哆醇鹽酸

3、吡哆醇)、 Vpp(煙酸煙酸)、 Vc（抗壞血酸）、（抗壞血酸）、 VH(生物素生物素)、 VB11(葉酸葉酸)、 VB12（鈷胺素（鈷胺素)等。等。 使用濃度：使用濃度：一般用量為一般用量為0.11.0mgL。 又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。 使用濃度使用濃度：一般為：一般為lOOmglOOmgL L， 作用作用：適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀：適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，體和芽的形成。對組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對細(xì)胞壁的形成也有作用。對細(xì)胞壁的形成

4、也有作用。 培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制 作用作用：是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。：是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。 種類種類：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。 使用濃度使用濃度：為：為1010200mg200mgL L。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制5、有機(jī)附加物 （天然復(fù)合物）培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制椰乳椰乳香蕉香蕉馬鈴薯馬鈴薯酵母提取液酵母提取液6 6、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(hormone) (hormone) 培養(yǎng)基及其配制

5、培養(yǎng)基及其配制 * *作用作用：主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成；促進(jìn)主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成；促進(jìn)細(xì)胞脫分化；促進(jìn)細(xì)胞伸長；促進(jìn)生根。細(xì)胞脫分化；促進(jìn)細(xì)胞伸長；促進(jìn)生根。 在促進(jìn)生長方面，根對生長素最敏感。在在促進(jìn)生長方面，根對生長素最敏感。在極低的濃度下，極低的濃度下，(10(10-5-51010-8-8mgmgL)L)就可促進(jìn)生就可促進(jìn)生長，其次是莖和芽。長，其次是莖和芽。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制吲哚乙酸：吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid）萘乙酸：萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid）吲哚丁酸：吲哚丁酸：IBA（indolebutyric ac

6、id）2,4-二氯苯氧乙酸：二氯苯氧乙酸：2,4D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) 培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制生長素作用強(qiáng)弱順序：生長素作用強(qiáng)弱順序：IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)NAA(萘乙酸萘乙酸)IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)2,4D(2,4二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)強(qiáng)強(qiáng)弱弱培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制種類：種類： 6BA(6芐基腺嘌呤芐基腺嘌呤) Kt (kinetin 激動(dòng)素激動(dòng)素) Zt (zeatin 玉米素玉米素) 培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制細(xì)胞分裂素作用強(qiáng)弱順序細(xì)胞分裂素作用強(qiáng)弱順序Kt ( 激動(dòng)素激動(dòng)素)6BA(6芐基腺嘌呤芐基腺嘌呤)Zt

7、(玉米素玉米素)強(qiáng)強(qiáng)弱弱培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制GAGA3 3（赤霉酸）：（赤霉酸）：作用作用：促進(jìn)幼芽伸長生長，促進(jìn)不定胚發(fā)育成?。捍龠M(jìn)幼芽伸長生長，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株。植株。 赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響：當(dāng)有影響：當(dāng)生長素赤霉素比值高生長素赤霉素比值高時(shí)有利于時(shí)有利于木質(zhì)木質(zhì)部部分化，分化，比值低比值低時(shí)有利于時(shí)有利于韌皮部韌皮部分化。分化。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制7、培養(yǎng)材料的支持物 -瓊脂(agar) 固體培養(yǎng)時(shí)最好的固體培養(yǎng)時(shí)最好的固化劑固化劑。 用量：用量：6 610g10gL L。 瓊脂是一種由海藻中提取的高分子

8、碳水化合物，本身并不提供任何營瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40 40 即凝固為固體狀即凝固為固體狀凝膠。凝膠。 瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時(shí)高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、的溫度、時(shí)間、pHpH值值等因素有關(guān)，長時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降，等因素有關(guān)，長時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時(shí)間過久，瓊過酸過堿加之高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時(shí)間過久，瓊脂變褐，也會(huì)

9、逐漸喪失凝固能力。脂變褐，也會(huì)逐漸喪失凝固能力。 培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制固體培養(yǎng)基的特點(diǎn)（與液體培養(yǎng)基相比）:優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): :操作簡便，通氣問題易解決，便于觀察研究。操作簡便，通氣問題易解決，便于觀察研究。缺點(diǎn)缺點(diǎn): :培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸( (即吸收即吸收) )面積小，各種面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分充分利用，同時(shí)養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分充分利用，同時(shí)培養(yǎng)物排出的代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織培養(yǎng)物排出的代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。產(chǎn)生毒害作用。固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制8、抗生物質(zhì)(antib

10、iotic) 種類：卡那霉素、頭孢霉素、種類：卡那霉素、頭孢霉素、青霉素、鏈霉素、慶青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。大霉素等。 濃度：濃度：520mg/L。 作用：作用：可可防止菌類污染防止菌類污染。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制9 9、活性炭、活性炭(active carbon) (active carbon) 目的：目的：是是利用其吸附能力，減少一些有毒物質(zhì)利用其吸附能力，減少一些有毒物質(zhì)的影響的影響；利于生根。；利于生根。 使用濃度：使用濃度：15gL。 它的顆粒大小決定著吸附能力：粒度越小，吸它的顆粒大小決定著吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；溫度低吸附力強(qiáng)，溫度高吸附力附能力越大；溫度低吸

11、附力強(qiáng)，溫度高吸附力減弱，甚至不吸附。減弱，甚至不吸附。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制作用：作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。代謝過程的介質(zhì)和溶媒。 注意：注意：用蒸餾水，最好是重蒸餾水；以保持培用蒸餾水，最好是重蒸餾水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來養(yǎng)基成分的精確性。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。水。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制二、培養(yǎng)基的二、培養(yǎng)基的PHPH值值 (pH value)(pH value)1、多數(shù)植物要求、多數(shù)植物要求pH5.6-5.82、用、用0.1-1N的的NaOH和和0.1-1N的的HCI調(diào)節(jié)調(diào)節(jié).

12、.3、注意：注意：p經(jīng)高壓滅菌后，培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，培養(yǎng)基pHpH會(huì)下降會(huì)下降0.2-0.8,0.2-0.8,故故調(diào)整調(diào)整pHpH值時(shí)值時(shí), ,應(yīng)高于應(yīng)高于0.50.5；ppHpH的大小會(huì)影響瓊脂的凝固能力，當(dāng)?shù)拇笮?huì)影響瓊脂的凝固能力，當(dāng)pH6.0pH6.0時(shí)，培養(yǎng)基將會(huì)變硬，時(shí)，培養(yǎng)基將會(huì)變硬，pH 5.0pH 5.0時(shí)，瓊脂凝固時(shí)，瓊脂凝固不好。不好。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制種類種類最適最適pH值值種類種類最適最適pH值值杜鵑杜鵑4.0月季月季5.8越桔越桔4.5胡蘿卜、石刁胡蘿卜、石刁柏柏6.0蠶豆蠶豆5.5桃桃7.0番茄番茄5.7培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制不同植物對培養(yǎng)基最適

13、不同植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求不同值的要求不同(見表見表) 培養(yǎng)基培養(yǎng)基(culture medium) ：是植物組織培養(yǎng)的重要基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型求也不相同。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功合適的培養(yǎng)基

14、，培養(yǎng)才有可能成功。 三、培養(yǎng)基的種類、配方及特點(diǎn)三、培養(yǎng)基的種類、配方及特點(diǎn)培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制1、根據(jù)態(tài)相不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、根據(jù)態(tài)相不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基2、根據(jù)培養(yǎng)物培養(yǎng)過程：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、根據(jù)培養(yǎng)物培養(yǎng)過程：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基3、根據(jù)作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、根據(jù)作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、 生根培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基4、根據(jù)營養(yǎng)水平：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、根據(jù)營養(yǎng)水平：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、 改良培養(yǎng)基。改良培養(yǎng)基。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制F 若只含有大量元素與微量元素和碳水化合物若只含有大量元素與微量元素和碳水化合物的培養(yǎng)基，

15、稱為的培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基。F 在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加各種各樣的生在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加各種各樣的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他有機(jī)附加物的培養(yǎng)基叫長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他有機(jī)附加物的培養(yǎng)基叫完全完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)基：初代培養(yǎng)基： 指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基：繼代培養(yǎng)基：指用來接種初代培養(yǎng)之后培養(yǎng)物的培養(yǎng)基指用來接種初代培養(yǎng)之后培養(yǎng)物的培養(yǎng)基 。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制1 1、MSMS培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：它是它是19621962年由年由MurashigeMurashige和和SkoogSkoog為培養(yǎng)為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。是目前應(yīng)用最

16、廣泛的培養(yǎng)基。煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。是目前應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：是無機(jī)鹽離子濃度較高，有高含量的是無機(jī)鹽離子濃度較高，有高含量的N N、K K，硝，硝酸鹽量大，營養(yǎng)豐富。酸鹽量大，營養(yǎng)豐富。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制成分名稱成分名稱藥品藥品名稱名稱原配方量原配方量(mg)/L大量元素大量元素NH4NO31650KNO31900CaCl22H2O440MgSO47H2O370KH2PO4170微量元素微量元素MnSO4H2O22.3ZnSO47H2O8.6CoCl26H2O0.025CuSO45H2O0.02H3BO36.2Na2MoO42H2O0.25KI0.83鐵鹽鐵鹽FeSO47

17、H2O28.7Na2-EDTA37.3有機(jī)物有機(jī)物煙酸煙酸(Vpp)0.5鹽酸吡哆醇鹽酸吡哆醇0.5鹽酸硫胺素鹽酸硫胺素0.1肌醇肌醇100甘氨酸甘氨酸22 2、WhiteWhite培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：19431943年由年由WhiteWhite為培養(yǎng)番茄根為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。尖而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)：特點(diǎn)：無機(jī)鹽濃度較低，適于生根培養(yǎng)。無機(jī)鹽濃度較低，適于生根培養(yǎng)。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制(4)B(4)B5 5培養(yǎng)基培養(yǎng)基: :是是19681968年由年由GalmborgGalmborg等為培養(yǎng)大豆等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)：特點(diǎn)：是含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸是含有

18、較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。硫胺素。(5)KM(5)KM8P8P培養(yǎng)基培養(yǎng)基: :它是它是19741974年為原生質(zhì)體培年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)：特點(diǎn)：是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素。單糖和維生素。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制2 2、WhiteWhite培養(yǎng)基培養(yǎng)基 19431943年由年由WhiteWhite為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì) 19631963年作了改良，提高年作了改良，提高M(jìn)gSOMgSO4 4的濃度和增加硼元素的濃度和增加硼元素 無機(jī)鹽濃度較低無機(jī)鹽濃度較低 使用廣泛使用廣泛 在生根培養(yǎng)、胚胎

19、培養(yǎng)中有良好的效果在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果大量元素大量元素含量含量(mg/L）微量元素微量元素含量含量鐵鹽鐵鹽含量含量有機(jī)物有機(jī)物含量含量(mg/L其他其他含量含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇肌醇100蔗糖蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0煙酸煙酸0.3瓊脂瓊脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0鹽酸硫胺素鹽酸硫胺素0.1NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001鹽酸吡哆醇鹽酸吡哆醇0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸甘氨酸3Na2SO42003 3、B5B5培養(yǎng)基培養(yǎng)

20、基 19681968年由年由GamborgGamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì) 含有較低的銨鹽含有較低的銨鹽 較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素組成成分組成成分?jǐn)?shù)量數(shù)量(mg/l）組成成分組成成分?jǐn)?shù)量數(shù)量(mg/l)KNO32500FeSO47H2O27.8CaCl22H2O150CuSO45H2O0.025MgSO47H2O250蔗糖蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇肌醇100H3BO43.0煙酸煙酸1.0MnSO44H2O10鹽酸吡哆醇鹽酸吡哆醇1.0ZnSO47H2O2.0激動(dòng)素激動(dòng)素0.1Na2MoO42H2O0.252,

21、4D0.11.0CoCl26H2O0.025鹽酸硫銨素鹽酸硫銨素10Na2-EDTA37.3B5培養(yǎng)基的組成和配方4 4、N6N6培養(yǎng)基培養(yǎng)基 19741974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì)年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì) KH2PO4和和（NH4NH4）SO4SO4含量高，不含鉬含量高，不含鉬組成成分組成成分?jǐn)?shù)量數(shù)量(mg/l)組成成分組成成分(mg/l)KNO32.3Na2EDTA37.3CaCl22H2O166FeSO47H2O27.8MgSO47H2O185蔗糖蔗糖50KH2PO4400pH5.8(NH4)2SO4463煙酸煙酸0.5KI0.8鹽酸吡哆醇鹽酸吡哆醇0.

22、5H3BO31.6甘氨酸甘氨酸2.0MnSO44H2O4.4鹽酸硫銨鹽酸硫銨1.0ZnSO47H2O1.5N6培養(yǎng)基組成及配方第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的配制配制 一、一、 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制 （一）、母液（一）、母液(stock solution)的配制和保存的配制和保存 所謂所謂母液母液是欲配制液的是欲配制液的濃縮液濃縮液。 意義意義: 保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性 配制時(shí)的快速移取配制時(shí)的快速移取 便于低溫保藏。便于低溫保藏。 一般母液配成比所需濃度高一般母液配成比所需濃度高10-10010-100倍。倍。 母液配制時(shí)可分別配成母液配制時(shí)可分別配成大量元素、微量元

23、素、鐵大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類等鹽、有機(jī)物和激素類等。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制單配法：單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用度的母液。一般用mg/ml mg/ml 或或mg/Lmg/L表示。表示?；炫浞ǎ夯炫浞ǎ簩最悹I養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后再混合成母液。數(shù)稱量，分別溶解后再混合成母液。配制生長素類：配制生長素類：可先用少量可先用少量0.1N0.1N的的NaOHNaOH或或95%95%酒精酒精助溶助溶。濃度為：。濃度為：1-5mg1-5mgmlml。

24、配制細(xì)胞分裂素類：配制細(xì)胞分裂素類：一般先用少量一般先用少量0.5-1N0.5-1N鹽酸加熱溶鹽酸加熱溶解解。濃度為：。濃度為：1-5mg1-5mgmlml。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制母液的配制方法：母液的配制方法：培培養(yǎng)養(yǎng)基基母母液液的的配配制制 母液名稱母液名稱藥品藥品名稱名稱原配方量原配方量(mg)/L擴(kuò)大倍數(shù)擴(kuò)大倍數(shù) 稱取量稱取量(mg)母液體積母液體積(ml)移取量移取量(ml)/L大量元素母液大量元素母液NH4NO3165010165001000100KNO319001019000CaCl22H2O440104400MgSO47H2O370103700KH2PO417010170

25、0微量元素母液微量元素母液MnSO4H2O22.31002230100010ZnSO47H2O8.6100860CoCl26H2O0.0251002.5CuSO45H2O0.0210025H3BO36.2100620Na2MoO42H2O0.2510025KI0.8310083鐵鹽母液鐵鹽母液FeSO47H2O28.71002870100010Na2-EDTA37.31003730有機(jī)物母液有機(jī)物母液煙酸煙酸(Vpp)0.5502550010鹽酸吡哆醇鹽酸吡哆醇0.55025鹽酸硫胺素鹽酸硫胺素0.1505肌醇肌醇100505000甘氨酸甘氨酸250100培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制配制配制方

26、法：方法：1 1）、）、將母液按將母液按順序順序擺放擺放2 2）、）、取適量的蒸餾水取適量的蒸餾水( (所需培養(yǎng)基量的所需培養(yǎng)基量的2/3)2/3)入容器入容器3 3）、）、按需要量依次取母液及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)按需要量依次取母液及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)4 4）、）、加入蔗糖加入蔗糖(30g/L)(30g/L)溶解溶解5 5）、）、加瓊脂加瓊脂(6-10g/L)(6-10g/L)，煮沸，煮沸，2-3min2-3min5 5）、）、定容定容6)6)、調(diào)調(diào)PHPH值值(pH=5.8)(pH=5.8)7)7)、分裝培養(yǎng)瓶，封口分裝培養(yǎng)瓶，封口8)8)、高壓滅菌高壓滅菌培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制第三節(jié)第三節(jié) 組培技

27、術(shù)（組培技術(shù)（滅菌滅菌、接種、培養(yǎng)、移栽、接種、培養(yǎng)、移栽馴化馴化）消毒消毒:是指殺死、消除或充分是指殺死、消除或充分抑制抑制部分微生物，部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。使之不再發(fā)生危害作用。滅菌滅菌:是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制一、培養(yǎng)基的滅菌一、培養(yǎng)基的滅菌常用的滅菌方法常用的滅菌方法物理方法物理方法化學(xué)方法化學(xué)方法干熱滅菌干熱滅菌(烘燒和灼燒烘燒和灼燒)濕熱滅菌濕熱滅菌(常壓或高壓蒸煮常壓或高壓蒸煮)射

28、線處理射線處理(紫外線、超聲波、微波紫外線、超聲波、微波)過濾除菌過濾除菌大量無菌水沖洗大量無菌水沖洗升汞升汞(氯化汞氯化汞)甲醛甲醛(福爾馬林福爾馬林)過氧化氫過氧化氫高錳酸鉀高錳酸鉀來蘇兒來蘇兒漂白粉漂白粉次氯酸鈉次氯酸鈉酒精酒精培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌法培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌法 培養(yǎng)基在制備后的培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌。內(nèi)完成滅菌。 高壓滅菌的原理高壓滅菌的原理： 在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在10

29、8kPa108kPa的壓力的壓力下，鍋內(nèi)下，鍋內(nèi)溫度達(dá)溫度達(dá)121121。在此蒸氣溫度下，可以。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制將鍋內(nèi)將鍋內(nèi)空氣空氣完全排除后，關(guān)閉完全排除后，關(guān)閉放氣閥。放氣閥。當(dāng)壓力表上升達(dá)當(dāng)壓力表上升達(dá)108kPa108kPa時(shí)，鍋內(nèi)溫度達(dá)時(shí)，鍋內(nèi)溫度達(dá)121121（在此蒸氣溫度下，可以很快（在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢），芽孢），維持維持15-30min15-30min。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制滅菌方法：滅菌方法： 滅菌鍋有很多

30、種，實(shí)驗(yàn)室中常用手提式高壓蒸滅菌鍋有很多種，實(shí)驗(yàn)室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，使用時(shí)要注意一下幾點(diǎn)：汽滅菌鍋，使用時(shí)要注意一下幾點(diǎn)：1、鍋中應(yīng)放足量的水，以免造成空燒或干燒；、鍋中應(yīng)放足量的水，以免造成空燒或干燒；2、裝鍋時(shí)不要過度傾斜，可保持內(nèi)部有一定的空、裝鍋時(shí)不要過度傾斜，可保持內(nèi)部有一定的空 間，利于蒸汽流動(dòng)；間，利于蒸汽流動(dòng)；3、增壓前高壓鍋內(nèi)的空氣必須排凈，否則易影響、增壓前高壓鍋內(nèi)的空氣必須排凈，否則易影響 滅菌效果；滅菌效果；4、滅菌過程中，應(yīng)盡量保持壓力恒定，嚴(yán)格遵、滅菌過程中，應(yīng)盡量保持壓力恒定，嚴(yán)格遵守滅菌時(shí)間；守滅菌時(shí)間；5、排氣降壓時(shí)應(yīng)緩慢進(jìn)行；、排氣降壓時(shí)應(yīng)緩慢進(jìn)行

31、；6、只有待高壓鍋內(nèi)壓力表指針恢復(fù)到零后，才、只有待高壓鍋內(nèi)壓力表指針恢復(fù)到零后，才能開啟壓力鍋；能開啟壓力鍋；7、高壓鍋工作時(shí)，應(yīng)有專人看守。、高壓鍋工作時(shí)，應(yīng)有專人看守。高壓滅菌的原理 在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121。在。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。熱的芽孢。 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)

32、全部是水蒸氣，滅菌完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到升到0.05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到表上升達(dá)到0.1MPa時(shí)時(shí),開始計(jì)時(shí)，維持壓力開始計(jì)時(shí)，維持壓力0.10.15MPa 2

33、0分鐘。分鐘。 在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，二是，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大濕熱的穿透力比干熱大；三是；三是濕熱的蒸汽有潛熱濕熱的蒸汽有潛熱存在，每存在，每1克水在克水在100時(shí)，由時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出226kJ（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。物體的溫度，從而

34、增加滅菌效力。 在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。 如果壓力未降到如果壓力未降到0時(shí)，打開排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，時(shí)，打開排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造

35、成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，需逐漸減壓。污染，需逐漸減壓。 過濾滅(除)菌（不耐熱的物質(zhì) ） 一些生長調(diào)節(jié)劑一些生長調(diào)節(jié)劑( (赤霉素、玉米素赤霉素、玉米素) )、某些維生素是不耐熱的，常用某些維生素是不耐熱的，常用過濾過濾滅菌滅菌- -細(xì)菌過濾器細(xì)菌過濾器方法。方法。 防細(xì)菌濾膜網(wǎng)孔的直徑為防細(xì)菌濾膜網(wǎng)孔的直徑為0.45m0.45m以以下，可阻止細(xì)菌細(xì)胞和真菌的孢子下，可阻止細(xì)菌細(xì)胞和真菌的孢子通過。通過。培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制空間及物體表面滅菌空間及物體表面滅菌培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基及其配制l熏蒸劑熏蒸劑: :甲醛甲醛和和高錳酸鉀，高錳酸鉀，1 1周后通風(fēng)周后

36、通風(fēng)1 1天天。(1)紫外線滅菌紫外線滅菌(2)熏蒸滅菌熏蒸滅菌l10-2010-20分鐘分鐘 滅菌后的培養(yǎng)基經(jīng)冷卻和凝固后即可滅菌后的培養(yǎng)基經(jīng)冷卻和凝固后即可使用，檢驗(yàn)使用，檢驗(yàn)滅菌效果。滅菌效果。 檢驗(yàn)方法：檢驗(yàn)方法： 將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)室中將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)室中3 3天，若沒有污染現(xiàn)象，說明滅菌可天，若沒有污染現(xiàn)象，說明滅菌可靠，可以使用?？?，可以使用。 保存在低溫條件下。常溫下保存時(shí)要進(jìn)行防塵和避光處理。保存在低溫條件下。常溫下保存時(shí)要進(jìn)行防塵和避光處理。 保存時(shí)間不可過長。保存時(shí)間不可過長。培養(yǎng)基培養(yǎng)基的保存的保存二、外植體的選擇和滅菌二、外植體的選擇和滅菌 1、 外植體的選擇外植體的選

37、擇 2、 外植體的滅菌方法外植體的滅菌方法 3、 污染原因和預(yù)防措施污染原因和預(yù)防措施 1 1、外植體的選擇外植體的選擇 植物組織培養(yǎng)的主要過程大致包括植物組織培養(yǎng)的主要過程大致包括：培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的制備的制備、外植體外植體的選擇的選擇、器具的消毒、無菌操作和環(huán)境條件的調(diào)控。、器具的消毒、無菌操作和環(huán)境條件的調(diào)控。 1 1）、選擇）、選擇優(yōu)良的種質(zhì)優(yōu)良的種質(zhì) 無論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，或者是進(jìn)行生物技術(shù)研究無論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，或者是進(jìn)行生物技術(shù)研究，選取選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)，性狀優(yōu)良的種質(zhì)，或或特殊的基因型特殊的基因型。對材料的選擇要有明確的目。對材料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，提

38、高成功機(jī)率，增加其實(shí)用價(jià)值。的，具有一定的代表性，提高成功機(jī)率，增加其實(shí)用價(jià)值。 2 2）、）、選擇健壯的植株選擇健壯的植株 組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株上，組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株上，選取選取發(fā)育正常的器官或組織發(fā)育正常的器官或組織。因?yàn)檫@些器官或組織代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，。因?yàn)檫@些器官或組織代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，比較容易培養(yǎng)成功。比較容易培養(yǎng)成功。3 3）、）、選擇最適的時(shí)期選擇最適的時(shí)期 組織培養(yǎng)選擇材料時(shí)，要注意植物的生長組織培養(yǎng)選擇材料時(shí)，要注意植物的生長季節(jié)、植物季節(jié)、植物的生長發(fā)的生長發(fā)育階段。如快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生長的最適時(shí)期取材，這樣不

39、僅成活率育階段。如快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生長的最適時(shí)期取材，這樣不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高高，而且生長速度快，增殖率高。4 4）、）、選取適宜的大小選取適宜的大小 培養(yǎng)無菌培養(yǎng)無菌材料時(shí)，取材的大小根據(jù)不同植物材料而異。材料太材料時(shí)，取材的大小根據(jù)不同植物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一般選取培養(yǎng)材料的大小，在。一般選取培養(yǎng)材料的大小，在0.5cm-1.0cm0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培養(yǎng)或。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小。脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小。三、外植體的滅菌

40、方法三、外植體的滅菌方法1、常用滅菌藥劑的使用和效果、常用滅菌藥劑的使用和效果2、外植體的滅菌方法、外植體的滅菌方法1、常用滅菌藥劑的使用和效果、常用滅菌藥劑的使用和效果滅菌劑滅菌劑使用濃度（使用濃度（% %）清除的難易清除的難易消毒時(shí)間消毒時(shí)間效效 果果次氯酸鈣次氯酸鈣910910易易530530很好很好次氯酸鈉次氯酸鈉2 2易易530530很好很好漂漂 白白 粉粉飽和濃度飽和濃度易易530530很好很好氯氯 化化 汞汞0.110.11較難較難210210最好最好酒酒 精精70757075易易0.220.22好好過氧化氫過氧化氫10121012最易最易515515好好溴溴 水水1212易易2

41、10210很好很好硝硝 酸酸 銀銀1 1較難較難530530好好抗抗 菌菌 素素450mg/L450mg/L中中30603060較好較好2、外植體的滅菌方法、外植體的滅菌方法 外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又先要進(jìn)行外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又先要進(jìn)行預(yù)處預(yù)處理理。植物材料一般采取的預(yù)處理方法是：。植物材料一般采取的預(yù)處理方法是：先對植物組織進(jìn)行先對植物組織進(jìn)行修整，去掉不需要的部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料在流水中修整，去掉不需要的部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。經(jīng)過預(yù)處理的植物材料，其表面仍有很多沖洗干凈。經(jīng)過預(yù)處理的植物材料，其表面仍有很多細(xì)菌細(xì)菌和和真菌真菌，因此還

42、需進(jìn)一步滅菌。，因此還需進(jìn)一步滅菌。 常規(guī)的表面滅菌處理方法常規(guī)的表面滅菌處理方法把材料放進(jìn)把材料放進(jìn)70%的酒精中約的酒精中約30s。用用0.1%的升汞（的升汞（HgCl2）浸泡）浸泡510min 。 或用或用10%的的次氯酸鈉溶液次氯酸鈉溶液浸浸泡泡10 15min。無菌蒸餾水沖洗無菌蒸餾水沖洗35次。次。滅菌時(shí)進(jìn)行攪動(dòng)，使植物材料與滅菌劑有良好滅菌時(shí)進(jìn)行攪動(dòng)，使植物材料與滅菌劑有良好 的接觸。的接觸。在滅菌劑里滴入數(shù)滴在滅菌劑里滴入數(shù)滴0.1%的的Tween20（吐溫）（吐溫） 或或Tween80濕潤劑，則滅菌效果更好。濕潤劑，則滅菌效果更好。 四、四、污染原因和預(yù)防措施污染原因和預(yù)防措

43、施1、污染的原因、污染的原因污染污染是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。污染的原因：污染的原因：從病原菌方面來分析主要有細(xì)菌及真菌兩大類；從污染從病原菌方面來分析主要有細(xì)菌及真菌兩大類；從污染的途徑而言，主要是由于外植體帶菌、培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底、操的途徑而言，主要是由于外植體帶菌、培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底、操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。細(xì)菌污染的特點(diǎn)細(xì)菌污染的特點(diǎn)：在外植體附近在外植體附近的培養(yǎng)基中出現(xiàn)的培養(yǎng)基中出現(xiàn)渾濁渾濁和和云霧狀云霧狀痕痕跡。跡。一般在接種后一

44、般在接種后12天即可發(fā)現(xiàn)。天即可發(fā)現(xiàn)。原因：材料帶菌；原因：材料帶菌； 培養(yǎng)基滅菌不徹底；培養(yǎng)基滅菌不徹底； 操作人員未遵守操作規(guī)程。操作人員未遵守操作規(guī)程。因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用70%酒精擦洗，鑷子、剪刀、接種針在酒精擦洗，鑷子、剪刀、接種針在使用前必須在火焰上燒紅。使用前必須在火焰上燒紅。真菌污染的特點(diǎn)真菌污染的特點(diǎn)：培養(yǎng)瓶內(nèi)往往會(huì)出現(xiàn)白、黑或綠等不同顏色培養(yǎng)瓶內(nèi)往往會(huì)出現(xiàn)白、黑或綠等不同顏色菌絲菌絲塊。塊。在接種后在接種后310天才能發(fā)現(xiàn)。天才能發(fā)現(xiàn)。原因：周圍環(huán)境不清潔；原因：周圍環(huán)境不清潔； 超凈工作臺(tái)的過濾裝置失效；超凈工作臺(tái)的過濾裝置失效； 培養(yǎng)瓶等器皿

45、的口徑過大。培養(yǎng)瓶等器皿的口徑過大。為了減少損失，提高工作效率，必須在每個(gè)操作環(huán)節(jié)注意防止污染為了減少損失，提高工作效率，必須在每個(gè)操作環(huán)節(jié)注意防止污染的發(fā)生。的發(fā)生。 2 2、污染的預(yù)防措施、污染的預(yù)防措施 發(fā)現(xiàn)污染的材料應(yīng)及時(shí)處理，否則將導(dǎo)致培養(yǎng)室環(huán)境污染。發(fā)現(xiàn)污染的材料應(yīng)及時(shí)處理，否則將導(dǎo)致培養(yǎng)室環(huán)境污染。 對一些特別寶貴的材料，可以取出再次進(jìn)行更為嚴(yán)格的滅菌，對一些特別寶貴的材料，可以取出再次進(jìn)行更為嚴(yán)格的滅菌，然后接入新鮮的培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。然后接入新鮮的培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。 要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開瓶蓋前，先要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進(jìn)行高壓滅集中進(jìn)行高壓滅菌菌，

46、再清除污染物，然后洗凈備用。，再清除污染物，然后洗凈備用。1）防止材料帶菌的措施防止材料帶菌的措施（1）用莖尖作外植體時(shí)，可在室內(nèi)或無菌條件下對）用莖尖作外植體時(shí)，可在室內(nèi)或無菌條件下對 枝條先進(jìn)行枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)。u枝條枝條 水洗凈水洗凈 插入無糖的營養(yǎng)液或自來水插入無糖的營養(yǎng)液或自來水 抽枝抽枝 以這種新抽的嫩枝條作為外植體以這種新抽的嫩枝條作為外植體 接種。這樣便可大大減少材料的污染。接種。這樣便可大大減少材料的污染。u在無菌條件下對采自田間的枝條進(jìn)行暗培養(yǎng)，待在無菌條件下對采自田間的枝條進(jìn)行暗培養(yǎng)，待 抽出的抽出的黃化枝條時(shí)采枝，經(jīng)滅菌后接種也可明黃化枝條時(shí)采枝，經(jīng)滅菌后接種也可

47、明 顯減少污染。顯減少污染。 （2）選擇合適的時(shí)間去田間采取外植體）選擇合適的時(shí)間去田間采取外植體 避免避免陰雨天陰雨天去田間采取外植體。去田間采取外植體。 在晴天采取外植體時(shí)，下午采取的外植體要比早晨在晴天采取外植體時(shí)，下午采取的外植體要比早晨采的污染少，因材料經(jīng)過日曬后可殺死部分細(xì)菌或采的污染少，因材料經(jīng)過日曬后可殺死部分細(xì)菌或真菌真菌。 但目前對材料內(nèi)部污染還沒有令人滿意的滅菌方法但目前對材料內(nèi)部污染還沒有令人滿意的滅菌方法。在菌。在菌類長入組織內(nèi)部時(shí)，不但要除去上年生的鱗片，甚至要除類長入組織內(nèi)部時(shí)，不但要除去上年生的鱗片，甚至要除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織，以收到一定的防污去韌

48、皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織，以收到一定的防污染效果。染效果。2 2）外植體的滅菌）外植體的滅菌（1 1）多次滅菌法：）多次滅菌法： 首先除去主脈（因主脈與支脈交界處常有真菌休眠孢子存在）首先除去主脈（因主脈與支脈交界處常有真菌休眠孢子存在）； 其次，將切好的外植體放入其次，將切好的外植體放入1.3%1.3%的次氯酸鹽溶液中，滅菌的次氯酸鹽溶液中，滅菌30min30min； 第三，在無菌蒸餾水中沖洗第三，在無菌蒸餾水中沖洗3-53-5次；次； 第四，將材料封閉在無菌的培養(yǎng)皿中過夜，保持一定溫度；第四，將材料封閉在無菌的培養(yǎng)皿中過夜，保持一定溫度； 第五，次日將葉片用第五，次日將葉片用2.6%2

49、.6%次氯酸鈉滅菌次氯酸鈉滅菌30min30min，然后用蒸餾水，然后用蒸餾水洗洗3-53-5次。次。（2 2）多種藥液交替浸泡法）多種藥液交替浸泡法 對容易污染而難滅菌的材料：對容易污染而難滅菌的材料： 首先取莖尖、芽或器官外植體，用自來水及肥皂充分洗凈，表面不可附著污首先取莖尖、芽或器官外植體，用自來水及肥皂充分洗凈，表面不可附著污垢、灰塵，用剪刀修剪掉外植體上無用的部分，剝?nèi)パ可削[片；垢、灰塵，用剪刀修剪掉外植體上無用的部分，剝?nèi)パ可削[片； 第第2，將材料放入，將材料放入70%酒精酒精中滅菌數(shù)秒鐘；中滅菌數(shù)秒鐘； 第第3，在，在1：500Roccal B（一種商品滅菌劑名）稀釋液中浸（一

50、種商品滅菌劑名）稀釋液中浸5min； 第第4，放入，放入5%10%次氯酸鈉次氯酸鈉溶液中并滴入溶液中并滴入“吐溫吐溫80”數(shù)滴，滅菌數(shù)滴，滅菌1530min，或浸入或浸入0.1%0.2%升汞升汞溶液中并加入溶液中并加入“吐溫吐溫80”數(shù)滴，滅菌數(shù)滴，滅菌510min； 第第5，用無菌水沖洗，用無菌水沖洗5次。也可從次氯酸鈉溶液中取出后，再放入無菌的次。也可從次氯酸鈉溶液中取出后，再放入無菌的0.1M鹽酸鹽酸中浸片刻，再用無菌水沖洗數(shù)次。中浸片刻，再用無菌水沖洗數(shù)次。 3）玻璃器皿的滅菌）玻璃器皿的滅菌濕熱滅菌法濕熱滅菌法即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行高溫高壓

51、滅菌，滅菌時(shí)間可延長達(dá)菌鍋中進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌時(shí)間可延長達(dá)25min30min。干熱滅菌法干熱滅菌法即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進(jìn)即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進(jìn)行滅菌。行滅菌。煮沸滅菌煮沸滅菌即將玻璃器皿放入水中煮沸進(jìn)行滅即將玻璃器皿放入水中煮沸進(jìn)行滅菌。菌。4 4）金屬器械的滅菌）金屬器械的滅菌 火焰滅菌法：火焰滅菌法：即把金屬器械放在即把金屬器械放在95%的酒的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。這一步驟應(yīng)當(dāng)在無菌操作過程中反復(fù)進(jìn)行。這一步驟應(yīng)當(dāng)在無菌操作過程中反復(fù)進(jìn)行。干熱滅菌法：干熱滅菌法：即將擦洗干凈或烘干的金屬即將擦洗干凈或烘干的金屬器械用紙包

52、好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱器械用紙包好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。中滅菌。 濕熱滅菌法：濕熱滅菌法：工作服、口罩、帽子等布質(zhì)工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質(zhì)品，放入高壓鍋中，質(zhì)品，放入高壓鍋中，121 C的溫度，滅菌的溫度，滅菌20 min30min。5 5）布質(zhì)制品的滅菌）布質(zhì)制品的滅菌 6 6）無菌操作室的滅菌）無菌操作室的滅菌 無菌操作室的地面、墻壁和工作臺(tái)的滅菌可用無菌操作室的地面、墻壁和工作臺(tái)的滅菌可用2%的新潔爾滅或的新潔爾滅或70%的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20-30min。使

53、用前用。使用前用70%的酒精噴霧，使空間灰塵落的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。下。一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。7 7）操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按）操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按照無菌操作的程序進(jìn)行照無菌操作的程序進(jìn)行 在接種前要在接種前要剪除指甲剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好在新最好在新潔爾滅溶液中浸泡潔爾滅溶液中浸泡10min，后用，后用75%的酒精擦手，并用的酒精擦手，并用75%的酒的酒精擦拭接種精擦拭接種瓶表面瓶表面進(jìn)行消毒，以防把微生物帶進(jìn)超凈工作臺(tái)。進(jìn)行消毒，以防把微生物帶進(jìn)超凈工作臺(tái)。 工作人員

54、在接種時(shí)，工作人員在接種時(shí)，最好不要感冒咳嗽和說話最好不要感冒咳嗽和說話。操作人員操作。操作人員操作動(dòng)作要熟練、動(dòng)作快、規(guī)范，這樣可以縮短操作時(shí)間，減少污動(dòng)作要熟練、動(dòng)作快、規(guī)范，這樣可以縮短操作時(shí)間，減少污染染。如脫毒培養(yǎng)的莖尖很小，操作時(shí)間長了就會(huì)使莖尖失水變?nèi)缑摱九囵B(yǎng)的莖尖很小，操作時(shí)間長了就會(huì)使莖尖失水變干，或不慎感染雜菌。干，或不慎感染雜菌。 小小 結(jié)結(jié)1、外植體的選擇、外植體的選擇 ：優(yōu)良種質(zhì)、健壯植株：優(yōu)良種質(zhì)、健壯植株 、最適的時(shí)期、適宜的大、最適的時(shí)期、適宜的大小。小。 2、外植體的滅菌方法：、外植體的滅菌方法：9種常用滅菌藥劑的使用及其效果種常用滅菌藥劑的使用及其效果 、外

55、植體、外植體的滅菌方法。的滅菌方法。3、污染原因和預(yù)防措施：污染的原因、污染的預(yù)防措施（防止材料、污染原因和預(yù)防措施：污染的原因、污染的預(yù)防措施（防止材料帶菌、外植體的滅菌、器皿與金屬器械的滅菌、布質(zhì)制品的滅菌、帶菌、外植體的滅菌、器皿與金屬器械的滅菌、布質(zhì)制品的滅菌、無菌操作室的滅菌、操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按照無菌操作的無菌操作室的滅菌、操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按照無菌操作的程序進(jìn)行）。程序進(jìn)行）。 四、 外植體的接種和培養(yǎng) 1、 外植體的接種 2、 培養(yǎng)條件 1 1、外植體的接種外植體的接種外植體的接種外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料植物材料在無菌環(huán)境中在

56、無菌環(huán)境中切割或分離出器官、組織、細(xì)胞并轉(zhuǎn)入到無菌培養(yǎng)基上的全部操作切割或分離出器官、組織、細(xì)胞并轉(zhuǎn)入到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程過程。操作過程中引起的污染，主要由空氣中的雜菌和工作人員本身引操作過程中引起的污染，主要由空氣中的雜菌和工作人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，應(yīng)特別注意防止工作人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，應(yīng)特別注意防止工作人員本身引起的污染。起的污染。整個(gè)整個(gè)接種過程均須接種過程均須無菌操作：無菌操作：酒精擦拭手酒精擦拭手外植體消毒外植體消毒浸泡浸泡5min器器械械消消毒毒酒精燈灼燒酒精燈灼燒接種的具體操作接種的具體操作旋轉(zhuǎn)灼燒旋轉(zhuǎn)灼燒取外植體取外植體接種接種蓋好

57、瓶塞蓋好瓶塞1操作人員需穿著經(jīng)消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。操作人員需穿著經(jīng)消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。進(jìn)入接種室前，雙手必須進(jìn)行消毒，用肥皂和水洗滌能達(dá)到良進(jìn)入接種室前，雙手必須進(jìn)行消毒，用肥皂和水洗滌能達(dá)到良好的效果好的效果,進(jìn)行操作前再用進(jìn)行操作前再用75%的酒精擦洗雙手。的酒精擦洗雙手。2操作期間經(jīng)常用操作期間經(jīng)常用75%的酒精擦拭雙手和臺(tái)面。特別注意防止的酒精擦拭雙手和臺(tái)面。特別注意防止“雙重傳遞雙重傳遞”的污染，例如器械被手污染后又污染培養(yǎng)基等的污染，例如器械被手污染后又污染培養(yǎng)基等。3在打開培養(yǎng)瓶、三角瓶或試管時(shí)，在打開培養(yǎng)瓶、三角瓶或試管時(shí)，最大的最大的污染危

58、險(xiǎn)是污染危險(xiǎn)是管口邊管口邊沿沿沾染沾染的微生物的微生物落入落入管內(nèi)管內(nèi)，解決這個(gè)問題，可在打開前用火焰，解決這個(gè)問題，可在打開前用火焰燒瓶口燒瓶口。如果培養(yǎng)液接觸了瓶口，則瓶口要燒。如果培養(yǎng)液接觸了瓶口，則瓶口要燒到足夠到足夠的熱度，的熱度，以殺死存在的細(xì)菌。為避免以殺死存在的細(xì)菌。為避免灰塵灰塵污染瓶口，可用污染瓶口，可用紙紙包扎瓶口和包扎瓶口和塞子，以塞子，以遮蓋遮蓋瓶子頸部和試管口，相對地減少污染瓶子頸部和試管口，相對地減少污染機(jī)會(huì)機(jī)會(huì)。4 4工具用后及時(shí)消毒，避免交叉污染。工具用后及時(shí)消毒，避免交叉污染。5 5工作人員的呼吸也是污染的主要途徑。通常在平靜呼吸時(shí)細(xì)菌工作人員的呼吸也是污染

59、的主要途徑。通常在平靜呼吸時(shí)細(xì)菌是很少的，但是談話或咳嗽時(shí)細(xì)菌便增多，因此操作過程應(yīng)是很少的，但是談話或咳嗽時(shí)細(xì)菌便增多，因此操作過程應(yīng)禁止禁止不必要的談話不必要的談話并戴上口罩。并戴上口罩。6 6由于空氣中有灰塵，因此在操作時(shí)，仍要注意避免灰由于空氣中有灰塵，因此在操作時(shí)，仍要注意避免灰塵的落入。盡量把蓋子蓋好，當(dāng)打開瓶子或試管時(shí)，塵的落入。盡量把蓋子蓋好，當(dāng)打開瓶子或試管時(shí)，應(yīng)拿應(yīng)拿成斜角，成斜角，以免灰塵落入瓶中。刀、剪、鑷等用具，一般在以免灰塵落入瓶中。刀、剪、鑷等用具，一般在使用前浸泡在使用前浸泡在95%95%酒精中，用時(shí)在火焰上消毒，待酒精中，用時(shí)在火焰上消毒，待冷卻后冷卻后使用。

60、每次使用前均需進(jìn)行用具消毒。使用。每次使用前均需進(jìn)行用具消毒。 外植體外植體的培養(yǎng)條件的培養(yǎng)條件 接種后的外植體應(yīng)送到培養(yǎng)室去培養(yǎng)。組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)之一接種后的外植體應(yīng)送到培養(yǎng)室去培養(yǎng)。組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)之一就是在人工控制的環(huán)境條件下，使培養(yǎng)物生長發(fā)育，研究植物的就是在人工控制的環(huán)境條件下，使培養(yǎng)物生長發(fā)育，研究植物的生命活動(dòng)。培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件要生命活動(dòng)。培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件要根據(jù)植物對環(huán)境條件的不同需求根據(jù)植物對環(huán)境條件的不同需求進(jìn)行調(diào)控進(jìn)行調(diào)控。其中最主要的是光照、溫度、濕度、氧氣和培養(yǎng)基的。其中最主要的是光照、溫度、濕度、氧氣和培養(yǎng)基的pHpH值等。值等。1 1、光照光照 對離體培養(yǎng)物的生長發(fā)育，