活體動物體內(nèi)生物發(fā)光和熒光成像技術(shù)

1、活體動物體內(nèi)生物發(fā)光和熒光成像技術(shù)基礎(chǔ)原理與應(yīng)用簡介文章來自中國生物器材網(wǎng) 文章目錄：一、活體生物發(fā)光成像技術(shù)二、活體動物熒光成像技術(shù)三、生物發(fā)光成像與熒光成像的比較四、活體動物可見光成像儀器原理與操作流程活體動物體內(nèi)成像技術(shù)是指應(yīng)用影像學(xué)方法，對活體狀態(tài)下的生物過程進(jìn)行組織、細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究的技術(shù)?；铙w動物體內(nèi)成像技術(shù)主要分為可見光成像 (optical imaging)、核素成像（radio-nuclear imaging）、核磁共振（magnetic resonance imaging ，MRI）成像和超聲（ultrasound）成像、計(jì)算機(jī)斷層攝影（comput

2、ed tomography ，CT）成像五大類，其中可見光成像和核素成像特別適合研究分子、代謝和生理學(xué)事件，通常稱為功能成像；超聲成像和CT則適合于解剖學(xué)成像，通常稱為結(jié)構(gòu)成像。功能成像與結(jié)構(gòu)成像比較，前者更能夠反映細(xì)胞或基因表達(dá)的空間和時(shí)間分布，從而了解活體動物體內(nèi)的相關(guān)生物學(xué)過程、特異性基因功能和相互作用。所以，活體動物體內(nèi)功能成像技術(shù)可用于觀察和追蹤靶細(xì)胞、基因的表達(dá)，同時(shí)檢測多種分子事件，優(yōu)化藥物和基因治療方案，從分子和細(xì)胞水平對藥物療效進(jìn)行觀察，從整體動物水平上評估疾病發(fā)展過程，對同一個(gè)動物進(jìn)行時(shí)間、環(huán)境、發(fā)展和治療影響跟蹤。由于功能成像的諸多優(yōu)勢，這項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研

3、究及藥物開發(fā)等方面，本文重點(diǎn)介紹活體動物可見光成像技術(shù)。 體內(nèi)可見光成像(optical in vivo imaging)技術(shù)主要包括生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)成像兩種技術(shù)。生物發(fā)光成像是用熒光素酶(luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，利用其產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)底物發(fā)生生化反應(yīng)產(chǎn)生生物體內(nèi)的探針光信號；而熒光成像則是采用熒光報(bào)告基因（如GFP、RFP）或Cyt及dyes等熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，利用熒光蛋白或染料產(chǎn)生的熒光就可以形成體內(nèi)的熒光光源。前者是動物體內(nèi)的自發(fā)光，不需要激發(fā)光源，可通過高度靈敏的CCD直接捕捉光信號，而后者則需

4、要外界激發(fā)光源的激發(fā)才可以捕捉發(fā)光信號。傳統(tǒng)的動物實(shí)驗(yàn)方法需要在不同的時(shí)間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相比之下，體內(nèi)可見光成像技術(shù)通過對同一組實(shí)驗(yàn)對象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細(xì)胞及基因）的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)也更加真實(shí)可信。另外, 這一技術(shù)由于不涉及放射性物質(zhì)，具有操作簡單，所得結(jié)果直觀，靈敏度高等特點(diǎn), 在剛剛發(fā)展起來的幾年時(shí)間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。 一、活體生物發(fā)光成像技術(shù) （一）技術(shù)原理1. 標(biāo)記原理哺乳動物生物發(fā)光，一般是將Firefly luciferase基因（由554個(gè)氨基酸構(gòu)成，約

5、50KD）即熒光素酶基因整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí), 熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)?；?、細(xì)胞和活體動物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。將標(biāo)記好的細(xì)胞接種到實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)后，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。 除Firefly Luciferase外，有時(shí)也會用到Renilla Luciferase。二者的底物不一樣

6、，前者的底物是熒光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光波長不一樣，前者所發(fā)的光波長在540600nm，后者所發(fā)的光波長在460540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快，而且特異性沒有前者好，所以大部分活體實(shí)驗(yàn)使用Firefly Luciferase作為報(bào)告基因，如果需要雙標(biāo)記，也可采用后者作為備選方案。 熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素。熒光素在氧氣、ATP存在的條件下和熒光素酶發(fā)生反應(yīng)，生成氧化熒光素(oxyluciferin)，并產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。 對于細(xì)菌標(biāo)記，一般利用發(fā)光酶

7、基因操縱子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。利用這種辦法進(jìn)行標(biāo)記的細(xì)菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。但是一般細(xì)菌標(biāo)記需要轉(zhuǎn)座子的幫助把外源基因插入到細(xì)菌染色體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。 2. 底物熒光素的特點(diǎn)熒光素由于諸多優(yōu)點(diǎn)得到廣大科研人員的青睞，主要特點(diǎn)如下：(1) 熒光素不會影響動物的正常生理功能。(2)熒光素是280道爾頓的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障。(3) 熒光素在體內(nèi)擴(kuò)散速度快，可通過腹腔注射或尾部靜脈注射進(jìn)入動物體內(nèi)。腹腔注射擴(kuò)散較慢，持續(xù)發(fā)光長。熒光素腹腔注射老鼠后約1min后表達(dá)熒光

8、素酶的細(xì)胞開始發(fā)光，10min后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的最高點(diǎn)，在最高點(diǎn)持續(xù)約2030 min后開始衰減，約3h后熒光素排除，發(fā)光全部消失，最佳檢測時(shí)間是在注射后1535min之間；若進(jìn)行熒光素靜脈注射，擴(kuò)散快，但發(fā)光持續(xù)時(shí)間很短?？蒲腥藛T根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)總結(jié)出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。(4) 觀察時(shí)間的間隔沒有最短限制，只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動物體內(nèi)有一定的代謝過程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道，可以控制對下一次觀察結(jié)果的影響。 3. 光學(xué)原理光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時(shí)會被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時(shí)會發(fā)生折射現(xiàn)象，

9、而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內(nèi)可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍(lán)綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用活體動物生物發(fā)光成像技術(shù)最少可以檢測到皮下的幾百個(gè)細(xì)胞。當(dāng)然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的最少細(xì)胞數(shù)是不同的。一般認(rèn)為，每一厘米深度，發(fā)光強(qiáng)度衰減10倍，血液豐富的組織或器官（比如心臟、肝臟、肺臟）衰減多，與骨骼相鄰的組織或器官衰減少。在相同的深度情況下，檢測到的發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系，可由儀器

10、量化檢測到的光強(qiáng)度，反映出細(xì)胞的數(shù)量。 （二）活體生物發(fā)光成像技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域活體生物發(fā)光成像技術(shù)是一項(xiàng)在某些領(lǐng)域有不可替代優(yōu)勢的技術(shù)，比如腫瘤轉(zhuǎn)移研究、藥物開發(fā)、基因治療、干細(xì)胞示蹤等方面。1腫瘤學(xué)活體生物發(fā)光成像技術(shù)能夠讓研究人員能夠直接快速的測量各種癌癥模型中腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及對藥物的反應(yīng)。其特點(diǎn)是極高的靈敏度使微小的腫瘤病灶（少到幾百個(gè)細(xì)胞）也可以被檢測到，比傳統(tǒng)方法的靈敏度大大提高了；非常適合于腫瘤體內(nèi)生長的定量分析；避免由于宰殺老鼠而造成的組間差異；節(jié)省動物成本。由于以上特點(diǎn)，使基于轉(zhuǎn)移模型、原位模型、自發(fā)腫瘤模型等方面的腫瘤學(xué)研究得到發(fā)展。建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型，可以觀察腫瘤轉(zhuǎn)

11、移情況，進(jìn)一步探討腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制；可進(jìn)行原位接種，觀察原位以及原位轉(zhuǎn)移模型，使腫瘤學(xué)研究更接近腫瘤臨床發(fā)病的微觀環(huán)境；通過建立自發(fā)腫瘤模型，可以觀察腫瘤發(fā)生機(jī)理。（圖11-1）。 圖11-1 腫瘤的長期檢測，左圖分別是7天，14天，30天成像。來自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2藥物研究在藥效學(xué)評價(jià)方面，熒光素酶癌癥模型可用于癌癥體內(nèi)用藥在整體動物水平上進(jìn)行長期療效跟蹤觀察。利用無創(chuàng)傷活體成像對癌細(xì)胞生長的檢測，可對癌癥治療之前和過程中的癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測和評估。這種方式提供一個(gè)很好的對癌細(xì)胞的反應(yīng)和復(fù)發(fā)評估的預(yù)診斷途徑。用活體成像的方法比傳統(tǒng)技術(shù)有更高的靈敏度，當(dāng)用傳統(tǒng)的方法

12、還不能檢測到瘤塊時(shí)，用該技術(shù)已經(jīng)可以檢測到很強(qiáng)的信號。由于該技術(shù)只是檢測活細(xì)胞，不能檢測已經(jīng)凋亡的細(xì)胞。而用傳統(tǒng)的方法，不能區(qū)別正常細(xì)胞與凋亡的細(xì)胞，所以該技術(shù)可以比傳統(tǒng)技術(shù)更早更靈敏的發(fā)現(xiàn)藥物的療效。 利用活體成像技術(shù)高靈敏度、觀察方便的特點(diǎn)，在抗腫瘤藥物臨床前研究中，通過給予腫瘤接種的小鼠不同劑量，不同給藥時(shí)間、不同給藥途徑，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量及給藥時(shí)間，從而制定合適的劑型與服藥時(shí)間。 在藥物代謝方面，標(biāo)記與藥物代謝有關(guān)的基因，比如CYP3A4等，研究不同的藥物對該基因表達(dá)的影響，從而可以間接知道相關(guān)藥物在體內(nèi)代謝的情況。 在藥劑學(xué)研究方面

13、，可以通過把熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒直接裝載在藥物載體中，觀察藥物載體的靶向臟器與體內(nèi)分布規(guī)律（圖11-2）。在藥理學(xué)方面，還可以通過轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用，觀察藥物作用的通路，用熒光素酶基因標(biāo)記某一個(gè)興趣基因，觀察藥物作用的通路。 圖11-2利用IL-1轉(zhuǎn)基因小鼠篩選抗炎癥藥物，來自上海南方模式生物研究中心 3基因治療基因治療是將正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的。目前，基因治療主要是以病毒做載體，可應(yīng)用熒光素酶基因作為報(bào)告基因加入載體，觀察目的基因是否到達(dá)動物體內(nèi)的特異組織和是否持續(xù)高效表達(dá)，這種非侵入方式具有

14、低毒性及免疫反應(yīng)輕微等優(yōu)點(diǎn)且可以直接實(shí)時(shí)觀察，了解病毒或載體侵染的部位和時(shí)域信息；熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中，用來觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運(yùn)輸和基因治療情況；也可以表達(dá)熒光素酶基因的質(zhì)粒裸DNA為模型DNA，直接注入動物體內(nèi)，利用生物發(fā)光成像可以分析不同載體、不同注射位點(diǎn)、不同注射量對熒光素酶基因表達(dá)的影響，同時(shí)也可以時(shí)空量化分析基因表達(dá)的分布、水平和持續(xù)時(shí)間。這種可視的方法直觀地評價(jià)DNA的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)效率，在基因治療研究中具有重要的指導(dǎo)作用。 4干細(xì)胞及免疫學(xué)用熒光素酶標(biāo)記干細(xì)胞有以下幾種方法：一種是標(biāo)記組成性表達(dá)的基因，做成轉(zhuǎn)基因動物，干細(xì)胞就被標(biāo)記了，若

15、干細(xì)胞移植到另外動物體內(nèi)，可以用活體生物發(fā)光成像技術(shù)示蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、分化及遷徙的過程；另外一種方法是用慢病毒直接標(biāo)記干細(xì)胞后，移植到體內(nèi)觀測其增殖、分化及遷徙過程，研究其修復(fù)、治療損傷或缺陷部分的效果，進(jìn)一步探討其機(jī)制。 可以通過標(biāo)記免疫細(xì)胞，觀察免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞等的識別和殺死功能，評價(jià)免疫細(xì)胞的免疫特異性、增殖、遷移及功能等；通過標(biāo)記異體細(xì)胞，觀察異體細(xì)胞對器官移植影響；也可進(jìn)行一些關(guān)于免疫因子的研究等。 5基因表達(dá)模式與基因功能研究研究基因表達(dá)可以從影響基因表達(dá)的各個(gè)不同的層面進(jìn)行相關(guān)的研究，如利用融合蛋白（p27-luc融合蛋白研究其在Cdk細(xì)胞分裂周期的表

16、達(dá)），興趣基因啟動子控制的熒光素酶（Catenin在腫瘤轉(zhuǎn)移的信號傳導(dǎo)機(jī)制），siRNA方式和轉(zhuǎn)基因動物等方法。 為研究目的基因是在何時(shí)、何種刺激下表達(dá)，將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動物模型。通過這種方法實(shí)現(xiàn)熒光素酶和目的基因的平行表達(dá)，從而可以直接觀察目的基因的表達(dá)模式，包括數(shù)量、時(shí)間、部位及影響其表達(dá)和功能的因素等；也可用于研究動物發(fā)育過程中特定基因的時(shí)空表達(dá)情況，觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達(dá)；以及其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達(dá)或關(guān)閉。 6蛋白質(zhì)相互作用可利用動物體內(nèi)生物發(fā)光成像技術(shù)研究活體動物體內(nèi)蛋白與蛋白的相互作用。

17、其原理是將分開時(shí)都不單獨(dú)發(fā)光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)上，若是這兩個(gè)蛋白質(zhì)之間有相互作用，熒光酶的C端和N端就會被連接到一起，激活熒光素酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在有底物存在時(shí)出現(xiàn)生物發(fā)光。在活體條件下研究藥物對蛋白質(zhì)相互作用的影響，可以觀察到在體外實(shí)驗(yàn)中無法模擬的活體環(huán)境對蛋白質(zhì)相互作用的影響。 7細(xì)胞凋亡利用活體動物生物發(fā)光成像技術(shù)，直接觀察活體動物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡。具體原理是用分子生物學(xué)方法在熒光酶的兩端連接上抑制其發(fā)光的蛋白(如雌激素)，但在其連接處加上caspase (細(xì)胞凋亡時(shí)特異表達(dá)的一種酶)的酶切點(diǎn)。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，表達(dá)caspase，切開抑制熒光酶發(fā)光的蛋白，

18、使熒光素酶開始發(fā)光。 8. 疾病機(jī)理可以標(biāo)記與某種疾病密切相關(guān)的基因，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，通過特定的藥物作用或其他條件下該基因表達(dá)的變化，來推測該疾病的發(fā)病機(jī)理和藥物對疾病治療的效果等。 9其他如RNAi、蛋白質(zhì)核運(yùn)輸?shù)?。在熒光素酶基因的一端接要研究的蛋白質(zhì)的基因，另一端接肯定在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的蛋白的基因，當(dāng)核外的蛋白運(yùn)輸?shù)胶藘?nèi)時(shí)，就會導(dǎo)致熒光素酶N端、C端靠近，恢復(fù)發(fā)光。 二、活體動物熒光成像技術(shù) （一）技術(shù)原理1標(biāo)記原理活體熒光成像技術(shù)主要有三種標(biāo)記方法。（1）熒光蛋白標(biāo)記：熒光蛋白適用于標(biāo)記細(xì)胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsR

19、ed）等；（2）熒光染料標(biāo)記：熒光染料標(biāo)記和體外標(biāo)記方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以標(biāo)記抗體、多肽、小分子藥物等；（3）量子點(diǎn)標(biāo)記：量子點(diǎn)（quantum dot)是一種能發(fā)射熒光的半導(dǎo)體納米微晶體，是由數(shù)百到數(shù)萬個(gè)原子組成的原子簇，尺寸在100nm以下，外觀恰似一極小的點(diǎn)狀物。量子點(diǎn)作為一類新型的熒光標(biāo)記材料，其在長時(shí)間生命活動監(jiān)測及活體示蹤方面具有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光試劑相比較，量子點(diǎn)熒光比有機(jī)熒光染料的發(fā)射光強(qiáng)的20倍，穩(wěn)定性強(qiáng)100倍以上，具有熒光發(fā)光光譜較窄、量子產(chǎn)率高、不易漂白、激發(fā)光譜寬、顏色可調(diào)，并且光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易分解等諸多優(yōu)點(diǎn)。主要

20、應(yīng)用在活細(xì)胞實(shí)時(shí)動態(tài)熒光觀察與成像，可以在長達(dá)數(shù)天內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞的分化和世系觀察, 以及細(xì)胞間、細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞器間的各種相互作用的原位實(shí)時(shí)動態(tài)示蹤。不但如此，量子點(diǎn)還可以標(biāo)記在其他需要研究的物質(zhì)上，如藥物、特定的生物分子等，示蹤其活動及作用。 2光學(xué)原理熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。同生物發(fā)光在動物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在小動物體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性要好得多，隨著發(fā)光信號在體內(nèi)深度的增加，波長越接近900nm的光線穿透能力越強(qiáng)，同時(shí)可消減背景噪音的干擾，近紅外熒光為觀測生理指標(biāo)的最佳選擇。在實(shí)驗(yàn)條件允許的條件下，應(yīng)盡量選擇發(fā)射波長較長的熒光蛋白或染料

21、。 （二）活體動物熒光成像技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域1腫瘤學(xué)活體熒光成像技術(shù)能夠無創(chuàng)傷定量檢測小鼠的皮下瘤模型。相對于生物發(fā)光成像技術(shù)，活體熒光成像技術(shù)檢測時(shí)間較快，只需要不到1s的時(shí)間，同時(shí)不需要注射底物，節(jié)約了檢測成本。但是需要選擇近紅外熒光檢測深部組織，目前此波段的熒光蛋白種類有限，精確定量較難。（1）GFP標(biāo)記的肺腫瘤模型（H-460-GFP）H-460-GFP是一個(gè)綠色熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞系，它起源于H-460肺小細(xì)胞肺癌，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白基因，并由SV-40啟動子起始基因的表達(dá)。通過H-460-GFP皮下腫瘤模型，建立小鼠肺癌的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可用來進(jìn)行有關(guān)抗癌藥物的篩選（圖11-3）。可

22、用于測量皮下腫瘤的生長和監(jiān)測對潛在化學(xué)治療藥物的反應(yīng)。    圖11-3  左圖是接種后1w熒光成像，右圖是3w熒光成像（上海市腫瘤研究所供圖） （2）量子點(diǎn)標(biāo)記細(xì)胞系通過量子點(diǎn)可以標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，用量子點(diǎn)Qtracker® 705對MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，皮下接種后動態(tài)觀察其生長以及變化（圖11-4）。激發(fā)光波長625nm ，散射光波長680nm。 圖11-4 量子點(diǎn)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞不同時(shí)間熒光成像 2抗體分子探針的一端聯(lián)有能夠和生物體內(nèi)特異靶點(diǎn)結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)（如肽類、酶的底物、配體等），另一端則是熒光

23、染料。通過Cy5.5標(biāo)記的抗體的體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)，可見肝、腎等處的分布（圖11-5）。    圖11-5   Cy5.5標(biāo)記的抗體的體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)（上海市腫瘤研究所供圖） 3 藥學(xué)研究熒光成像在藥物制劑學(xué)研究，尤其是藥物靶向性研究，藥物載體研究中有巨大優(yōu)勢。有關(guān)專家正在設(shè)計(jì)用合適的熒光染料標(biāo)記小分子藥物，觀察藥物在動物體內(nèi)的特異性分布和代謝情況，尤其是中藥研究方面。 應(yīng)用透射儀從樣本底部激發(fā)光源，可以提高活體熒光成像的靈敏度和檢測的深度。圖11-6是應(yīng)用NIR熒光染料標(biāo)記的淀粉酶來觀察治療Alzheimer病的藥物的治療

24、效果，曝光時(shí)間僅為200 ms，激發(fā)波長680nm，散射光波長720nm。 圖11-6  NIR標(biāo)記的淀粉酶成像 4組織工程通過發(fā)展EGFP基因表達(dá)的細(xì)胞系無創(chuàng)傷的評價(jià)組織工程的構(gòu)建。通過EGFP標(biāo)記的組織工程細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)特制的支架上，觀察該細(xì)胞的生長和變化，從而判斷組織工程的成敗與否。 三、生物發(fā)光成像與熒光成像的比較 （一）生物發(fā)光成像技術(shù)優(yōu)點(diǎn)與熒光成像技術(shù)相比較，生物發(fā)光成像技術(shù)主要的優(yōu)勢有：1特異性強(qiáng)，無自發(fā)熒光以熒光素酶作為體內(nèi)報(bào)告源的生物發(fā)光方法，是以酶和底物的特異作用而發(fā)光，特異性極強(qiáng)。動物本身沒有任何自發(fā)光，使得生物發(fā)光具

25、有極低的背景，極高的信噪比。但用熒光方法時(shí)，在受到激發(fā)光激發(fā)時(shí)，生物體中皮膚、毛發(fā)和各種組織及食物等都會產(chǎn)生熒光，特別是被標(biāo)記的靶點(diǎn)深臧于組織內(nèi)部，需要較高能量的激發(fā)光時(shí)，也就會產(chǎn)生很強(qiáng)的背景噪音。雖然熒光信號強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過生物發(fā)光，但極低的自發(fā)光水平使得生物發(fā)光的信噪比遠(yuǎn)高于熒光。 2高靈敏度生物體內(nèi)很多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后，也會發(fā)出熒光，產(chǎn)生的非特異性熒光會影響到檢測靈敏度。特別是當(dāng)發(fā)光細(xì)胞深藏于組織內(nèi)部，則需要較高能量的激發(fā)光源，也就會產(chǎn)生很強(qiáng)的背景噪音。熒光成像的靈敏度最高也只能在動物體內(nèi)檢測到約105細(xì)胞，相對于生物發(fā)光在動物體內(nèi)監(jiān)測到102數(shù)量級細(xì)胞的靈敏度要相差很多。&

26、#160;3. 檢測的深度由于生物發(fā)光的靈敏度高于熒光成像，對于需要深部成像的研究（檢測的深度在34cm），如干細(xì)胞、原位腫瘤與轉(zhuǎn)移，自發(fā)腫瘤等，應(yīng)用生物發(fā)光成像是最佳的選擇。 4. 精確定量生物發(fā)光信號可以用于精確定量，因?yàn)闊晒馑孛富蚴遣迦爰?xì)胞染色體中穩(wěn)定表達(dá)的，單位細(xì)胞的發(fā)光數(shù)量很穩(wěn)定。即便標(biāo)記細(xì)胞在動物體內(nèi)有復(fù)雜的定位，亦可從動物體表的信號水平直接得出發(fā)光細(xì)胞的相對數(shù)量。而對于熒光，激發(fā)光需要穿過組織到達(dá)靶點(diǎn)，發(fā)射光需要從體內(nèi)出來，路徑較長。信號水平取決于激發(fā)光的強(qiáng)度、發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量、靶點(diǎn)的深度、光線穿過的組織對其的吸收及散射等因素，使得熒光強(qiáng)度較難定量。熒光成像定量需要儀器

27、的激發(fā)光能夠保證持續(xù)長時(shí)間穩(wěn)定，并均勻照射到動物體表。NightOWL LB 983成像系統(tǒng)通過熒光光路的特殊設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了對激發(fā)光的能量控制和調(diào)節(jié)，根據(jù)光源的大小與深淺針對性選擇合適的激發(fā)裝置，并且采用窄波帶濾光片，提高了活體熒光成像的穩(wěn)定性和靈敏度，并且該系統(tǒng)操作簡單、費(fèi)用低廉、不涉及放射性。 （二）熒光成像技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在活體動物可見光成像技術(shù)中，相對于生物發(fā)光成像技術(shù)，熒光成像技術(shù)的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在：1. 熒光染料、蛋白標(biāo)記能力強(qiáng)熒光標(biāo)記物種類繁多，包括熒光蛋白、熒光分子、量子點(diǎn)等，可以與基因、多肽、抗體等生物分子標(biāo)記，作為分子探針使用范圍廣。同時(shí)，不同的熒光蛋白或染料還可對樣本進(jìn)行多重

28、標(biāo)記，同時(shí)成像。檢測的波長范圍從3001100nm，某些儀器公司還提供全光譜的濾光片實(shí)現(xiàn)幾乎所有熒光標(biāo)記的體內(nèi)成像。 2. 信號強(qiáng)度大由于熒光是在外界光源激發(fā)下產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，其光子強(qiáng)度較其它光學(xué)信號更強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間長，信號所反應(yīng)的樣本信息量更豐富，對信號接收儀器的要求相對較低，儀器不需要必須配備低溫冷CCD（如絕對溫度-80oC），節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本和購置成本。 3. 實(shí)驗(yàn)成本低相對于活體生物發(fā)光成像來說，熒光成像費(fèi)用低廉，無需注射底物熒光素。熒光發(fā)光基團(tuán)只要在其合適強(qiáng)度的激發(fā)光激發(fā)下就可以發(fā)出定波長的發(fā)射光信號，整個(gè)反應(yīng)不需要向動物注射任何昂貴的反應(yīng)成分，只要保證熒光基團(tuán)穩(wěn)

29、定，就可實(shí)現(xiàn)隨時(shí)激發(fā)隨時(shí)發(fā)光的效果。 4. 活體動物、動物尸體、器官全部可以進(jìn)行成像由于熒光是基于物理能量轉(zhuǎn)移原理，對實(shí)驗(yàn)樣本的生理狀態(tài)要求較低，可以實(shí)現(xiàn)活體、尸體、尸解組織器官樣本的光學(xué)成像。而對于生物發(fā)光，只有在活細(xì)胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。 總之，生物發(fā)光和熒光技術(shù)，如何互為補(bǔ)充，取長補(bǔ)短，分別滿足不同的研究領(lǐng)域，將來的發(fā)展方向是兩種技術(shù)并重。對于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)要求，選擇合適的方法（表11-1）。 表11-1 生物發(fā)光及熒光特點(diǎn)的比較          

30、;        優(yōu)     點(diǎn)缺    點(diǎn)生物發(fā)光特異性強(qiáng)，無自發(fā)熒光高靈敏度，在體內(nèi)可檢測到幾百個(gè)細(xì)胞檢測的深度在3-4厘米精確定量  信號較弱，檢測時(shí)間較長，需要靈敏的CCD鏡頭，儀器精密度要求高；需要注入熒光素，實(shí)驗(yàn)成本高；細(xì)胞或基因需要轉(zhuǎn)基因標(biāo)記；有些物質(zhì)不能用生物發(fā)光標(biāo)記，如抗體、多肽等很難用于人體。熒光熒光染料、蛋白標(biāo)記能力強(qiáng)，多種蛋白及染料可用于多重標(biāo)記；信號強(qiáng)度大，成像速度快；實(shí)驗(yàn)成本低；活體動物、動物尸體、器官全部可

31、以進(jìn)行成像；可銜接體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)，保持研究的連貫性；未來可能用于人體。非特異性熒光限制了靈敏度，體內(nèi)檢測最低約105細(xì)胞；檢測深度受限制；較難精確體內(nèi)定量。   四、活體動物可見光成像儀器原理與操作流程 （一） 儀器原理以NightOWL LB 983為例，來說明活體動物可見光成像系統(tǒng)的儀器設(shè)計(jì)原理。整個(gè)儀器由CCD配合密閉性非常好的暗箱、熒光配件、麻醉系統(tǒng)和軟件組成。CCD鏡頭位于暗箱的左上方，熒光光源和光路位于右上方，動物平臺（可加熱，以保持觀察實(shí)驗(yàn)動物的體溫）位于暗箱的下方，麻醉系統(tǒng)通過管道與暗箱連接。選擇適當(dāng)?shù)腃CD鏡頭，對于體內(nèi)可見光成像是

32、非常重要的。選用的CCD鏡頭對于波長450-700nm的光必須具有非常高的靈敏度和量子效率，而且由于需要探測的光源在皮下幾厘米處，其噪聲信號要盡可能的小?？蒲腥藛T經(jīng)過探索發(fā)現(xiàn)，背照射背部薄化冷CCD是唯一合適的選擇。這種CCD芯片溫度可達(dá)<-800C，在該溫度下，芯片的暗電流和閱讀噪音降到幾乎可以忽略不計(jì)的水平，同時(shí)配合密閉性非常好的暗箱，使得該系統(tǒng)檢測生物發(fā)光和熒光具有無與倫比的靈敏度。CCD由軟件控制升降，自動聚焦，可以獲得從3.5厘米到25厘米的連續(xù)視野。 成像暗箱屏蔽宇宙射線及一切光源，可以使暗箱內(nèi)部保持完全黑暗，CCD所檢測的光線完全由被檢動物體內(nèi)發(fā)出，避免外界環(huán)境的

33、光污染。 在熒光配件的設(shè)計(jì)方面，光源采用75W的鎢鹵燈，該系統(tǒng)首先實(shí)現(xiàn)了熒光激發(fā)光源能量從0%-100%可調(diào)節(jié)，并通過光導(dǎo)纖維反饋控制激發(fā)能量在檢測時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，有利于定量的準(zhǔn)確性。另外，還通過采用均勻照射的激發(fā)裝置、窄波帶的濾光片等保證熒光成像能較好的去除背景噪音的影響，獲得清晰的檢測結(jié)果，較準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。 為了對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行可見光成像，需要將實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行麻醉，以獲得期望的觀察角度及穩(wěn)定的數(shù)據(jù)。對于生物發(fā)光成像來說，由于檢測的時(shí)間較長，一般建議使用氣體麻醉。氣體麻醉系統(tǒng)組成包括：氣體蒸發(fā)器、誘導(dǎo)麻醉箱、流量調(diào)節(jié)閥、單獨(dú)控制開關(guān)的五通道小鼠麻醉室、廢氣吸收裝置等組成。在

34、成像前，將實(shí)驗(yàn)動物置入誘導(dǎo)麻醉箱并被麻醉, 然后放入成像暗箱進(jìn)行觀察 軟件系統(tǒng)負(fù)責(zé)儀器控制和圖像分析。軟件控制鏡頭的焦距、CCD的升降、曝光時(shí)間、濾光片的更換和照明燈的開啟等，具有友好的用戶界面，操作簡便。 （二） 實(shí)驗(yàn)操作流程1.  細(xì)胞標(biāo)記或動物標(biāo)記等進(jìn)行生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)，首先根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同，用熒光素酶基因標(biāo)記腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、病毒、藥物載體或動物，或者用Lux操縱子標(biāo)記細(xì)菌。用熒光素酶基因標(biāo)記可通過質(zhì)粒、慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒等方法進(jìn)行。如果進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)，就用GFP、EGFP或RFP標(biāo)記腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、病毒或動物等，后者用熒光染料（包括量子點(diǎn)）標(biāo)記需

35、要檢測的物質(zhì)，如抗體，藥物載體等。 2.  體外預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測需要檢測的細(xì)胞、病毒、細(xì)菌等標(biāo)記后，在活體成像前，可以通過多孔板預(yù)先檢測一下標(biāo)記是否成功，熒光素酶或熒光蛋白的表達(dá)強(qiáng)度等，并據(jù)此篩選陽性克隆、繪制標(biāo)記物的發(fā)光梯度曲線等。體外預(yù)實(shí)驗(yàn)是作為小動物活體成像解決方案中不可缺少的一部分。比如，利用體外預(yù)實(shí)驗(yàn)初步檢測轉(zhuǎn)染熒光素酶的腫瘤細(xì)胞發(fā)光值，選擇轉(zhuǎn)染率相對高且穩(wěn)定的一批細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。對于通常進(jìn)行的細(xì)胞檢測來說，具體可以通過活體成像儀器檢測活細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度，也可以通過體外化學(xué)發(fā)光和熒光檢測儀檢測細(xì)胞裂解液的發(fā)光強(qiáng)度。 當(dāng)用體外化學(xué)發(fā)光和熒光檢測儀時(shí)，可以更準(zhǔn)確地

36、捕捉到發(fā)光值、更穩(wěn)定的輸出發(fā)光值。對于生物發(fā)光方式而言，實(shí)驗(yàn)所需的儀器是微孔板式化學(xué)發(fā)光檢測儀，如Berthold Centro LB 960。對于熒光方式而言，實(shí)驗(yàn)所需的儀器是微孔板式熒光檢測儀，如Berthold TwinkleTM LB 970。(圖11-7)      圖11-7 左側(cè)為Berthold Centro LB 960，右側(cè)為Berthold TwinkleTM LB 970 3.  活體成像首先麻醉實(shí)驗(yàn)動物，可采用異氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合

37、液麻醉實(shí)驗(yàn)動物。如果采用氣體麻醉，可先注射底物。氣體麻醉的優(yōu)點(diǎn)是動物可以很快進(jìn)入麻醉狀態(tài)，一旦停止麻醉氣體供應(yīng)，動物會在幾分鐘內(nèi)蘇醒。 對于生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)來說，接著注射底物熒光素。最佳的檢測時(shí)間是在注射后15到35分鐘之間。但需要注意的是，對于不同的動物模型，發(fā)光動力學(xué)過程并不完全一致，最好先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定何時(shí)發(fā)光信號最強(qiáng)。 成像，對于生物發(fā)光來說，檢測時(shí)間一般是1分鐘到5分鐘，如果信號特別弱，也可以延長到10分鐘，如果信號特別強(qiáng)，也可在1分鐘以內(nèi)。對于熒光來說，檢測時(shí)間是1秒以內(nèi)。為節(jié)約時(shí)間，檢測生物發(fā)光，最多可同時(shí)檢測5只小鼠。對于熒光實(shí)驗(yàn)，麻醉好就可以馬上檢測。由于激發(fā)

38、光照射的角度會影響檢測的信號值，所以熒光實(shí)驗(yàn)建議每次只檢測1只動物。 參考文獻(xiàn)1. Grassi R, Cavaliere C, Cozzolino S et al.Small animal imaging facility: new perspectives for the radiologist, Radiol med, 2009;114:1521672.Weissleder R, Pittet MJ. Imaging in the era of molecular oncology. Nature.2008;452(7187):580-589.3. Laurent A. Ben

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