細胞培養(yǎng)小結(jié)

1、CO2培養(yǎng)箱，下面的松開是關(guān)，這個閥門只要打開一點點就行，有那么一點兒感覺緊了就可以了，折上管子，看見讀數(shù)在0.03MPa，先讓溫度升至37，穩(wěn)定之后再打開CO2，大概需要4-5個小時。細胞培養(yǎng)：1、 材料：DMEM培養(yǎng)基或1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素，鏈霉素）、0.25%胰蛋白酶（含0.02%的EDTA），PBS等。培養(yǎng)液的制備：DMEM（或1640）+10%血清+1%雙抗。（若用50ml的離心管即45ml DMEM+5ml 血清+0.5ml 雙抗）二、培養(yǎng)過程：1.復(fù)蘇：復(fù)蘇細胞是從零下80冰箱或液氮罐中取出凍存管，迅速投入37水浴中，使其融化（1分鐘左右）（部分融化），用培養(yǎng)基

2、緩慢稀釋至原體積的56倍，大部分細胞完全貼壁后（4-6小時），吸出含有凍存液的培養(yǎng)基，并換成完全培養(yǎng)基；或取出凍存管以后，放入37的水浴至半融化狀態(tài)，然后將凍存管內(nèi)的液體移至培養(yǎng)盒，補充培養(yǎng)基4-5ml。放入培養(yǎng)箱12小時左右使其貼壁生長，第二天換液。2. 換液：首先將培養(yǎng)皿內(nèi)液體倒出，用PBS沖洗2-3遍（目的是使分泌物和死亡的細胞脫落），然后再加入適量的新的培養(yǎng)基。3. 傳代：培養(yǎng)皿內(nèi)細胞長滿后，需要進行傳代培養(yǎng)，首先將培養(yǎng)皿內(nèi)液體倒掉，用PBS沖洗2-3遍，加入2-3ml胰酶，培養(yǎng)一段時間（929為三四分鐘，培養(yǎng)箱內(nèi)）（培養(yǎng)時間可根據(jù)文獻或經(jīng)驗）【下次試試放在培養(yǎng)箱里】，在顯微鏡下觀察細

3、胞全部懸浮即消化完成（此時細胞成圓形），立即加入3-4ml培養(yǎng)液，使其稀釋胰酶（否則會殺死細胞），難脫落的可以敲打培養(yǎng)盒使其懸浮脫落。用移液管進行吹打，使貼壁細胞完全脫落，吹打的時候要從上往下，從靠近瓶口端向瓶底端吹打。并且要注意盡量不產(chǎn)生泡沫。吹打完成后，將液體移至離心管，1000轉(zhuǎn)離心2-3分鐘左右，棄上清液。加入適量新鮮的培養(yǎng)液（23ml），吹打混勻，并進行分裝，補充培養(yǎng)液。4. 凍存：細胞傳到第三代，傳代后的第二天，細胞正處于減數(shù)分裂期，在這個時期凍存（細胞的活性最大），要凍存的培養(yǎng)盒中保證傳代時的濃度比較大。用傳代的步驟，到“棄上清液”這步，加入凍存液（5-10%DMSO+培養(yǎng)基）。

4、每個凍存管是1ml量。傳代：傳三次才會穩(wěn)定，大概十天左右，細胞長到70%-90%就應(yīng)該傳代，具體沒有時間的安排。三、 實驗數(shù)據(jù)1. 細胞計數(shù)取出培養(yǎng)皿，倒掉上清液，用PBS清洗兩遍加2ml胰酶，消化完成后，加部分培養(yǎng)基，離心（1000r/min 2-3min）倒掉上清液，取一滴在玻璃皿的側(cè)面，使其均勻分布于玻璃皿（量不能過大或過?。旁陲@微鏡下觀察，如下圖。數(shù)細胞個數(shù)時，中線上的不數(shù)，只邊上4個小格子，若在線上，則只數(shù)上、左邊上的細胞（是為了避免重復(fù)），記個數(shù)為M，M/4×104，與查出所需的濃度相比，確定需稀釋倍數(shù)。(注：加入板中的體積是0.1ml，細胞個數(shù)=目標濃度*0.1*稀釋后體積)將稀釋后的細胞加入到如下板中，空白組中不加。 空白組：不加細胞，只加培養(yǎng)基，不加藥 外面一圈加100l PBS對照組：正常細胞，不加藥種藥待96孔板中細胞貼壁后（一般是前一天種細胞，24小時后種藥），直接向每孔中加入10ul藥，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加染色劑培養(yǎng)到規(guī)定的時間后，將培養(yǎng)基全部吸