呼吸道標(biāo)本采集和結(jié)果解讀

1、編輯課件1破解呼吸道感染病原學(xué)診斷破解呼吸道感染病原學(xué)診斷的困境：需要你我他的困境：需要你我他王 輝北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科Email：L.CN.MKT.GM.04.2016.5059編輯課件2內(nèi)內(nèi) 容容n 呼吸道感染病原學(xué)n 困境和挑戰(zhàn)n 可能的破解之道2編輯課件3William Osler, The Principles and Practice of Medicine, 1892Diagnosis! Diagnosis! Diagnosis! Medicine is a science of uncertainty and an art of probability. 最重要的是不要看遠(yuǎn)方

2、模糊的事，而是做好手頭清楚的事 編輯課件4歐洲流調(diào)：CAP的主要病原體病原體檢出率(%)一項1996年11月至2008年7月在西班牙進(jìn)行的CAP流調(diào)研究，納入3,524例CAP患者(15%門診患者,85%住院患者) ，其中1,463例患者病原學(xué)呈陽性反應(yīng)。Cillniz C, et al. Thorax. 2011;66(4):340-346. 肺炎鏈球菌和非典型病原體肺炎鏈球菌和非典型病原體是CAP最主要致病菌，混合感染占重要地位N=1463編輯課件5我國CAP的主要致病菌病原體檢出率(%)入選2003年12月至2004年11月中國7個城市12個中心的665例CAP患者并進(jìn)行病原體檢測 20

3、06年我國CAP的大型流調(diào)研究顯示：肺炎支原體是我國肺炎支原體是我國CAP的最主要致病菌，的最主要致病菌，其次為肺炎鏈球菌1 在我國已經(jīng)完成的另兩項全國多中心成人CAP調(diào)查中，肺炎支原體感染的比例分別達(dá)到了20.7%和38.9%，均已超過了肺炎鏈球菌(分離率分別為10.3%和14.8%)，成為成人CAP最常見的致病原2,3 混合感染在社區(qū)呼吸道感染中占有重要地位，以細(xì)菌合并非典型病原體細(xì)菌合并非典型病原體混合感染居多11.劉又寧 陳民鈞 趙鐵梅等. 中華結(jié)核和呼吸雜志.2006;29(1):3-8； Liu Y et al. BMC Infectious Diseases. 2009;9:31

4、.3. Tao LL et al. Chin Med J (Engl). 2012;125(17):2967-2972.編輯課件6成人病毒性肺炎發(fā)病率高，但長期被忽視成人病毒性肺炎發(fā)病率高，但長期被忽視n每年新發(fā)病毒性肺炎約每年新發(fā)病毒性肺炎約200萬萬例，其中成人和兒童各例，其中成人和兒童各100萬萬例例n10項成年人項成年人CAP綜述（共綜述（共2910例），病毒性肺炎占例），病毒性肺炎占22%Jennings LC , et al. Thorax 2008; 63:42-8. Ruuskanen O. Lancet 2011;377:1264-75.6病毒科病毒科病毒種病毒種核酸類型核酸

5、類型正粘病毒科流感病毒單股RNA副粘病毒科呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、人類偏肺病毒單股RNA披膜病毒科風(fēng)疹病毒單股RNA小RNA病毒科鼻病毒、柯薩奇病毒和?？刹《镜牟糠中蛣e單股RNA腺病毒科腺病毒雙股DNA冠狀病毒科人類冠狀病毒、SARS冠狀病毒單股RNA皰疹病毒科單純皰疹病毒、帶狀皰疹、EB和CMV雙股DNA細(xì)小病毒科人類博卡病毒單鏈DNA呼腸孤病毒科呼腸孤病毒（1，2，3，4型）雙鏈RNA編輯課件7Pathogen identifiedPatients n (%)Respiratory Viruses262 (27.5) Influenza virus A94 (9.

6、9) Human rhinovirus41 (4.3) Adenovirus40 (4.2) Human metapneumovirus17 (1.8) Parainfluenza virus type 116 (1.7) Parainfluenza virus type 314 (1.5) Parainfluenza virus type 211 (1.2) Influenza virus B6 (0.6) Human enterovirus5 (0.5) Respiratory syncytial virus type A5 (0.5) Respiratory syncytial viru

7、s type B4 (0.4) Coronavirus OC43/HKU14 (0.4) Coronavirus 229E/NL634 (0.4) Parainfluenza virus type 4 1 (0.1) Bocavirus0 (0.0)北京市成人北京市成人CAP監(jiān)測網(wǎng)：病毒性肺炎監(jiān)測網(wǎng)：病毒性肺炎27.5%2010-2012年本課題組牽頭，聯(lián)合北京市12家醫(yī)院n954例成人CAP患者中，病毒性肺炎占27.5%。n重要病毒：流感病毒、鼻病毒、腺病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒。 JiuXin Qu. BMC Infect DIs 2015 online first 7編輯課件8上呼吸

8、道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥8編輯課件9上呼吸道感染標(biāo)本的采集上呼吸道感染標(biāo)本的采集9 用拭子同時擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁（用拭子同時擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁（3-5次）次）n 咽拭子的采集方法咽拭子的采集方法編輯課件10n 咽拭子的采集咽拭子的采集正確拿咽拭子的方法正確拿咽拭子的方法錯誤拿咽拭子的方法錯誤拿咽拭子的方法上呼吸道感染標(biāo)本的采集上呼吸道感染標(biāo)本的采集編輯課件11上呼吸道感染標(biāo)本的采集上呼吸道感染標(biāo)本的采集11 請患者頭部保持不動，將拭子輕輕轉(zhuǎn)動緩緩插入患者鼻腔，不要用力，請患者頭部保持不動，將拭子輕輕轉(zhuǎn)動緩緩插入患者鼻腔，不要用力， 當(dāng)遇到阻力后即到達(dá)后鼻咽，停留數(shù)秒吸取分泌物，輕輕旋轉(zhuǎn)取

9、出拭子當(dāng)遇到阻力后即到達(dá)后鼻咽，停留數(shù)秒吸取分泌物，輕輕旋轉(zhuǎn)取出拭子鼻鼻 拭拭 子子 標(biāo)標(biāo) 本本 的的 采采 集集編輯課件12l病毒：選用滌綸或人造棉頭塑料柄的拭子（如：聚丙烯纖維頭），病毒：選用滌綸或人造棉頭塑料柄的拭子（如：聚丙烯纖維頭），不能用藻酸鈣不能用藻酸鈣及木柄拭子，可使病毒失活或抑制及木柄拭子，可使病毒失活或抑制PCR反應(yīng)。脫脂棉拭子含有熒光物質(zhì)，影響熒反應(yīng)。脫脂棉拭子含有熒光物質(zhì)，影響熒光定量光定量PCR結(jié)果結(jié)果l細(xì)菌：細(xì)菌：選用藻酸鈣拭子。選用藻酸鈣拭子。棉拭子、尼龍拭子可抑制百日咳博德特菌生長棉拭子、尼龍拭子可抑制百日咳博德特菌生長l采樣后采樣后用于病毒檢測的拭子，將拭子頭

10、浸入含一定量采樣液的螺口管中，尾部棄用于病毒檢測的拭子，將拭子頭浸入含一定量采樣液的螺口管中，尾部棄去，旋緊管蓋，去，旋緊管蓋，及時送檢，如不能立即送檢，及時送檢，如不能立即送檢，可暫時儲存于可暫時儲存于4冰箱內(nèi)，嚴(yán)禁冰箱內(nèi)，嚴(yán)禁-20 冷凍。冷凍。用于細(xì)菌檢測的拭子插回采樣管中或適宜的轉(zhuǎn)運裝置中，立即送檢用于細(xì)菌檢測的拭子插回采樣管中或適宜的轉(zhuǎn)運裝置中，立即送檢12上呼吸道感染標(biāo)本的采集上呼吸道感染標(biāo)本的采集支原體保存液支原體保存液病毒采樣拭子病毒采樣拭子細(xì)菌采樣拭子細(xì)菌采樣拭子編輯課件13下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥13編輯課件14下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥14下呼吸道標(biāo)

11、本中，下呼吸道標(biāo)本中，痰痰& &支氣管鏡標(biāo)本支氣管鏡標(biāo)本最為重要！最為重要！15編輯課件Fukuyama et al. BMC Infectious Diseases 2014, 14:534標(biāo)本的質(zhì)量標(biāo)本的質(zhì)量16編輯課件標(biāo)本的質(zhì)量標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyama et al. BMC Infectious Diseases 2014, 14:53417編輯課件標(biāo)本的質(zhì)量標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyama et al. BMC Infectious Diseases 2014, 14:534In conclusion, sputum Gram stain is highly specifi

12、c for the etiologic diagnosis of CAP and HCAP and useful in guiding pathogen-targeted antibiotic treatment編輯課件18病例病例1 1 男性，64歲 既往史：既往史： 心肌梗死2次 嚴(yán)重的充血性心力衰竭，行雙側(cè)冠狀動脈旁路移植手術(shù) 心臟移植（植入式心臟復(fù)律除顫器） 癥狀：癥狀：呼吸困難、干咳、低熱 初步診斷：初步診斷： 支氣管肺泡灌洗：無致病菌， 正常菌群（真菌和分枝桿菌） 胸片：右下肺局限性密度影肺癌？肺癌？Seifert H. CID, 2009,48:S238-45編輯課件19手術(shù)，手

13、術(shù)， 抗菌藥物抗菌藥物 患者治愈患者治愈 血培養(yǎng)：血培養(yǎng)： 初次：類白喉桿菌（皮膚污染） 第二次：馬紅球菌（免疫缺陷宿主的條件致病菌） 最終診斷：最終診斷：細(xì)菌性肺炎 治療：治療：紅霉素，3個月，治愈微生物結(jié)果微生物結(jié)果條件致病菌感染診斷關(guān)鍵條件致病菌感染診斷關(guān)鍵肺內(nèi)腫塊基本吸收肺內(nèi)腫塊基本吸收Seifert H. CID, 2009,48:S238-45編輯課件20醫(yī)院獲得性肺炎（醫(yī)院獲得性肺炎（HAPHAP）的微生物標(biāo)本采集和送檢要求）的微生物標(biāo)本采集和送檢要求病原檢驗項目最優(yōu)標(biāo)本轉(zhuǎn)運要求；送檢最佳時間銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌屬、粘質(zhì)沙雷菌、不動桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞

14、菌、金黃色葡萄球菌和MRSA、流感嗜血桿菌血培養(yǎng)血培養(yǎng)已經(jīng)注入標(biāo)本的培養(yǎng)瓶室溫下盡快送抵實驗室。革蘭染色定量或半定量需氧和厭氧細(xì)菌培養(yǎng)痰；支氣管抽吸物；支氣管肺泡灌洗液；PSB；肺組織無菌杯或管，室溫，2h肺炎鏈球菌同上尿液無菌容器，室溫，2h混合厭氧菌（吸入）革蘭染色培養(yǎng)PSB標(biāo)本肺組織無菌管；無菌容器放組織；室溫，2h曲霉菌屬真菌涂片或其他真菌染色方法支氣管抽吸物無菌杯或管，室溫，2h真菌培養(yǎng)支氣管肺泡灌洗液；PSB半 乳 甘 露 聚 糖（GM）1-3 -D葡聚糖（G）血清支氣管肺泡灌洗液 促凝管，室溫，立即送檢無菌杯或管，室溫，2h編輯課件21老年老年CAPCAP患者的病原學(xué)診斷患者的病

15、原學(xué)診斷 20112011年年ERS/ESCMDERS/ESCMD指南建指南建議議所有住院患者所有住院患者均應(yīng)進(jìn)行均應(yīng)進(jìn)行血培養(yǎng)血培養(yǎng) 北美指南建議對更嚴(yán)重的北美指南建議對更嚴(yán)重的患者進(jìn)行血培養(yǎng)患者進(jìn)行血培養(yǎng) 血培養(yǎng)有助于血培養(yǎng)有助于確診潛在的確診潛在的肺炎病原體和根據(jù)分離病肺炎病原體和根據(jù)分離病原菌對疾病進(jìn)行重新評估原菌對疾病進(jìn)行重新評估血培養(yǎng)血培養(yǎng)染色法染色法呼吸樣本培養(yǎng)呼吸樣本培養(yǎng)尿抗原檢測尿抗原檢測 對初始抗生素治療方案調(diào)對初始抗生素治療方案調(diào)整具有重要的影響作用整具有重要的影響作用 但同樣的呼吸道標(biāo)本但同樣的呼吸道標(biāo)本缺乏缺乏較高的預(yù)測較高的預(yù)測 老年患者存在功能障礙：老年患者存在功

16、能障礙：無法獲得可評價的痰液；無法獲得可評價的痰液；口咽定植的口咽定植的G G- -菌、金黃色菌、金黃色葡萄球菌和葡萄球菌和MDRMDR菌較多菌較多 肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌的細(xì)菌抗原采用尿免疫層的細(xì)菌抗原采用尿免疫層析技術(shù)檢測析技術(shù)檢測 肺炎鏈球菌抗原的敏感性肺炎鏈球菌抗原的敏感性約大于約大于60%60%，成人患者大成人患者大于于90%90% 軍團(tuán)菌抗原檢測的敏感性軍團(tuán)菌抗原檢測的敏感性大于大于90%90%老年老年CAPCAP患者的病原學(xué)診斷方法患者的病原學(xué)診斷方法Gonzlez-Castillo J,et al.Rev Esp Quimioter.2014;27(1)：

17、69-86編輯課件2222指南中強(qiáng)調(diào)：血培養(yǎng)至少送2套 在發(fā)熱開始的在發(fā)熱開始的24 h內(nèi)進(jìn)行血內(nèi)進(jìn)行血培養(yǎng)。培養(yǎng)。 盡力保證在盡力保證在抗感染治療前抗感染治療前獲得獲得首份首份血培養(yǎng)標(biāo)本。血培養(yǎng)標(biāo)本。 同時經(jīng)同時經(jīng)2個獨立部位抽取血標(biāo)本個獨立部位抽取血標(biāo)本，此結(jié)果比單一部位的血培養(yǎng)更有臨床此結(jié)果比單一部位的血培養(yǎng)更有臨床意義。意義。除外新生兒外，不建議只進(jìn)行單套除外新生兒外，不建議只進(jìn)行單套血培養(yǎng)血培養(yǎng)（級）。級）。 48-96 h后評估治療效果后評估治療效果，再次血培養(yǎng)不能單取，再次血培養(yǎng)不能單取1套，必須同時抽取套，必須同時抽取2套標(biāo)套標(biāo)本本（級）。級）。 但對懷疑但對懷疑血管內(nèi)的感染血

18、管內(nèi)的感染，則應(yīng)該間隔一段時間取，則應(yīng)該間隔一段時間取不同部位不同部位的靜脈穿刺抽的靜脈穿刺抽血，有助于診斷持續(xù)性菌血癥（血，有助于診斷持續(xù)性菌血癥（級）。級）。Crit Care Med 2008 Vol. 36, No. 4；CLSI指南；英國指南編輯課件2323“雙抽四瓶雙抽四瓶”，每瓶，每瓶8-10ml 標(biāo)示標(biāo)示“左側(cè)左側(cè)”、“右側(cè)右側(cè)” 無菌體液無菌體液 如胸水等如胸水等手手 冊冊 宣宣 講講編輯課件24痰標(biāo)本在病原學(xué)診斷中面臨的困難 CAP患者患者40%以上患者無法或及時產(chǎn)生痰以上患者無法或及時產(chǎn)生痰 痰標(biāo)本合格率較低，甚至送檢唾液痰標(biāo)本合格率較低，甚至送檢唾液 培養(yǎng)：痰培養(yǎng)陽性率

19、受多種影響因素影響且影培養(yǎng)：痰培養(yǎng)陽性率受多種影響因素影響且影響極大，包括標(biāo)本采集、運輸、快速處理、合響極大，包括標(biāo)本采集、運輸、快速處理、合理應(yīng)用細(xì)胞學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)、前期無抗生素治療、理應(yīng)用細(xì)胞學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)、前期無抗生素治療、解釋技能解釋技能 涂片革蘭染色：最新數(shù)據(jù)表明，通過革蘭染色涂片革蘭染色：最新數(shù)據(jù)表明，通過革蘭染色辨別辨別1669個個CAP住院病人合格標(biāo)本，只有住院病人合格標(biāo)本，只有14%可以辨別出主要形態(tài)類型可以辨別出主要形態(tài)類型24American Thoracic Society, Infectious Diseases Society of America. Guidelines

20、on the Management of Community-Acquired Pneumonia in Adults, 2007:44 (Suppl 2)編輯課件25痰標(biāo)本不同外觀25唾液唾液膿痰膿痰粘液樣痰粘液樣痰帶血痰帶血痰編輯課件2626標(biāo)本質(zhì)量評估痰涂片標(biāo)本質(zhì)量評估痰涂片Garbage in！唾 液編輯課件27一個小調(diào)查 隨機(jī)調(diào)查中國15家醫(yī)院2014年痰標(biāo)本數(shù)據(jù)27編輯課件28痰標(biāo)本判讀標(biāo)準(zhǔn)的比較28編輯課件29合格痰標(biāo)本：吞噬很重要29WBC內(nèi)吞噬：葡萄球菌編輯課件30涂片項目報告格式30普通細(xì)菌涂片及染色編輯課件31 痰培養(yǎng)標(biāo)本質(zhì)量情況總數(shù)總數(shù)不合格不合格不合格率不合格率兒科兒

21、科9777.78%內(nèi)科內(nèi)科2620188371.87%急診急診64444168.48%血液科血液科1501102067.95%外科外科39726767.25%婦產(chǎn)科婦產(chǎn)科231356.52%門診門診26715056.18%ICU121555745.84% 13家醫(yī)院，痰標(biāo)本合格率不足50%編輯課件32粒缺患者肺炎的致病菌Curr Opin Pulm Med 2015, 21:260271編輯課件33對于確診IA：GM的診斷效能Curr Opin Pulm Med 2015, 21:260271編輯課件34粒缺腫瘤肺炎：微生物學(xué)評價BAL是很好的診斷工具Curr Opin Pulm Med 20

22、15, 21:260271編輯課件35惡性粒細(xì)胞減少患者的肺炎診斷 臨床評估+微生物學(xué)評估+分子 微生物學(xué)評估：最可靠：從無菌部位分離or呼吸道分泌物中非共生菌BAL是首選下呼吸道標(biāo)本，越早采集越好，尤其使用抗生素之前，但不能延誤治療支氣管活檢（TBBX）可揭示侵入血流感染，但培養(yǎng)不優(yōu)于BAL，且因為惡性粒細(xì)胞減少繼發(fā)血小板減少使得并發(fā)癥風(fēng)險高分子方法：半乳甘露聚糖分子試驗測試侵襲性曲霉?。‵DA已經(jīng)批準(zhǔn)）Scott E. Evans and David E. Ost, Pneumonia in the neutropenic cancer patient, Infectious diseas

23、es, 2015,21(3):261-271編輯課件36日均痰標(biāo)本與BAL送檢對比36編輯課件37BAL標(biāo)本量要求 生理鹽水總灌入量不少于100ml，分3-5份進(jìn)行（標(biāo)準(zhǔn)為200-240ml，分4等份進(jìn)行） 好的BAL標(biāo)本，至少30%灌入液回收 30%回收率的被視作不合格，需要重新采集（尤其是10個菌落培養(yǎng)后菌落計數(shù)：相同形態(tài)菌落數(shù)103CFU/mL制作涂片（細(xì)胞離心)血平皿巧克力平皿麥康凱平皿若用接種環(huán)密涂平板， 生長的菌落數(shù)量會低于實際數(shù)量。但用 L 棒涂布平板計數(shù)， 定量培養(yǎng)結(jié)果更準(zhǔn)確編輯課件40肺泡灌洗液的涂片革蘭染色 適量BALF標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞離心，經(jīng)自然干燥、甲醇固定或火焰快速固定3

24、次，革蘭染色 標(biāo)本質(zhì)量判斷以扁平鱗狀上皮細(xì)胞占全部細(xì)胞比例1% 為合格標(biāo)本 敏感度為104個細(xì)胞/mL，若每個油鏡視野可見1個或多個細(xì)菌，報告革蘭染色形態(tài)及白細(xì)胞結(jié)果，提示此菌與活動性肺炎相關(guān)。40Patrick RM. Manual of clinical microbiology. 9th ed. US: ASM Press, 2007: 307- 308中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)下呼吸道感染細(xì)菌培養(yǎng)操作規(guī)范S.編輯課件41肺泡灌洗液定量培養(yǎng)的意義 細(xì)菌性感染，濃度閾值104CFU/mL，低于閾值濃度時，定植可能性大; 高于閾值時，感染可能性大。 真菌性感染，目前沒有BAL的診斷性閾值。

25、絲狀真菌也沒有閾值。但絲狀真菌在呼吸道分泌物中的價值遠(yuǎn)大于酵母菌屬。該類菌在 EORTC /MSG 指南中有“臨床診斷( probable diagnosis)”價值411. A Guide to Utilization of the Microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases: 2013 Recommendations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM

26、), 2013:57(15 August)2. EORTC /MSG 編輯課件42中華結(jié)核和呼吸雜志,2011,34(9)編輯課件43哮喘患者：結(jié)晶和庫什曼螺旋體編輯課件44編輯課件45FilmArray Respiratory Panel第一個用單個標(biāo)本同時檢測病毒和細(xì)菌性呼吸道感染的測試2min上機(jī)時間，1h周轉(zhuǎn)時間300l樣本（鼻咽拭子即可）/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm304177.htmhttp:/ 留取痰培養(yǎng)后，能否先肉眼評估一下標(biāo)本質(zhì)量 送檢痰培養(yǎng)的目的是什么？微生物檢驗報告您參考嗎？何時參考？ 少送痰！多采血！ 我們盡全力幫您找破案證據(jù)（病原菌），前提是您提供一個好的案發(fā)現(xiàn)場（合格標(biāo)本） 當(dāng)您面對感染病人時，微生物室與您零距離！ 不要忘了病毒 不要用了抗生素之后，才想起送培養(yǎng)46編輯課件47編輯課件48藥敏報告共識概要 藥敏試驗的意義和基本原則 具體的專業(yè)要求 特殊耐