腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)林星石

1、腫腫 瘤瘤 細(xì)細(xì) 胞胞 培培 養(yǎng)養(yǎng) 技技 術(shù)術(shù)解放軍總醫(yī)院免疫室解放軍總醫(yī)院免疫室林星石研究員林星石研究員histroyhistroy腫瘤類(lèi)型：腫瘤類(lèi)型：間充質(zhì)間充質(zhì) 上皮上皮 神經(jīng)外胚層神經(jīng)外胚層 造血源性造血源性（1955-1958-1963-1965）in vitro: 原代原代 傳代傳代 建系建系（1967-1970）配基成分：配基成分：純血清純血清 含血清含血清 無(wú)血清無(wú)血清生物學(xué)特性：生物學(xué)特性：細(xì)胞細(xì)胞 亞細(xì)胞亞細(xì)胞 酶和分子酶和分子 腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞in vitroin vitro的特點(diǎn)的特點(diǎn)細(xì)胞保持永生性：細(xì)胞保持永生性：自我復(fù)制自我復(fù)制形態(tài)學(xué)：形態(tài)學(xué)：大小不一大小不一 逐漸

2、一致逐漸一致增殖力更強(qiáng)：增殖力更強(qiáng)：dnadna合成期、分裂期達(dá)合成期、分裂期達(dá)50%突變性：突變性：不同于正常細(xì)胞，失去穩(wěn)定的控制高分化不同于正常細(xì)胞，失去穩(wěn)定的控制高分化 變低分化變低分化表面性狀：表面性狀：負(fù)電荷數(shù)量負(fù)電荷數(shù)量正常，貼壁性正常，貼壁性 ，抗原性可，抗原性可 變異變異接觸抑制減弱或消失：接觸抑制減弱或消失：懸浮生長(zhǎng)特征：懸浮生長(zhǎng)特征：成瘤性：成瘤性：移植到動(dòng)物體內(nèi)可成瘤移植到動(dòng)物體內(nèi)可成瘤腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞in vitro in vitro 培基培基rpmi1640：最常用，最常用，+10+1020%fcs20%fcs，上皮性，上皮性 或懸浮性（或懸浮性（+0.03%+0.0

3、3%谷氨酰胺）谷氨酰胺）dmem：常用常用f12： 適用于上皮性癌，如肝癌，適用于上皮性癌，如肝癌，l-15： 注意：注意：+2g/l nahco3 或或 +20mmol/l hepesph7.2rpmi1640+f12或或l-15（1:1）：）：適用肉瘤適用肉瘤培養(yǎng)液特殊添加劑培養(yǎng)液特殊添加劑 常用的促常用的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子及使用的終濃度細(xì)胞生長(zhǎng)因子及使用的終濃度 添加劑添加劑 終濃度終濃度 添加劑添加劑 終濃度終濃度 bsa 10-5mol/ml egf 5ng/ml transferrin 5-10 g/ml fgf 5ng/ml insulin 5 pg/ml ngf 5ng/ml 氫化

4、可的松氫化可的松 10-5mol/ml 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相同與常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相同 一個(gè)細(xì)胞群體，存在多種亞群，復(fù)雜性一個(gè)細(xì)胞群體，存在多種亞群，復(fù)雜性建株細(xì)胞較正常細(xì)胞易于培養(yǎng)建株細(xì)胞較正常細(xì)胞易于培養(yǎng)細(xì)胞分裂增殖的調(diào)控細(xì)胞分裂增殖的調(diào)控（細(xì)胞周期）（細(xì)胞周期）多種基因的協(xié)同作用多種基因的協(xié)同作用調(diào)控因子：調(diào)控因子： 基因：基因：cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化蛋白磷酸化 蛋白激酶的調(diào)控蛋白激酶的調(diào)控 胸苷激酶的調(diào)控胸苷激酶的調(diào)控 負(fù)調(diào)：負(fù)調(diào)：dna損傷與損傷與dna修復(fù)：抑制抗性修復(fù)：抑制抗性 腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞 細(xì)胞間的相互影響細(xì)胞間的相互影響不同亞群代表

5、不同分化程度的細(xì)胞群不同亞群代表不同分化程度的細(xì)胞群 表型、形態(tài)、受體、對(duì)因子的反應(yīng)等表型、形態(tài)、受體、對(duì)因子的反應(yīng)等 均不同均不同不同亞群釋放不同的正負(fù)調(diào)節(jié)因子不同亞群釋放不同的正負(fù)調(diào)節(jié)因子 (陰陽(yáng)調(diào)控陰陽(yáng)調(diào)控)細(xì)胞因子與激素對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控細(xì)胞因子與激素對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控一個(gè)重要而復(fù)雜的因素一個(gè)重要而復(fù)雜的因素 因素因素 高分化高分化 低分化低分化胰島素胰島素 生長(zhǎng)生長(zhǎng) -凝血孝素凝血孝素 生長(zhǎng)生長(zhǎng) -前列腺素前列腺素 促進(jìn)（促進(jìn)（400) 抑制抑制激情素激情素 - 助黏附助黏附維生素維生素a 抑制生長(zhǎng)及分化抑制生長(zhǎng)及分化_調(diào)整培基中的成分可調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化調(diào)整培基中的成分可調(diào)控細(xì)胞的生

6、長(zhǎng)與分化影響培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的因素影響培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的因素ph營(yíng)養(yǎng)：如血清效價(jià)低營(yíng)養(yǎng)：如血清效價(jià)低細(xì)胞生長(zhǎng)因子的自分泌及旁分泌細(xì)胞生長(zhǎng)因子的自分泌及旁分泌癌基因抑癌基因的變化癌基因抑癌基因的變化排泄廢物的影響排泄廢物的影響細(xì)胞外基質(zhì)的作用細(xì)胞外基質(zhì)的作用細(xì)胞相互間的作用細(xì)胞相互間的作用污染污染培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)技術(shù) - - 取材取材手術(shù)標(biāo)本手術(shù)標(biāo)本活檢標(biāo)本活檢標(biāo)本胸腹水穿刺胸腹水穿刺細(xì)針頭穿刺細(xì)針頭穿刺內(nèi)窺鏡活檢內(nèi)窺鏡活檢 關(guān)鍵：新鮮、無(wú)菌、及時(shí)、準(zhǔn)確關(guān)鍵：新鮮、無(wú)菌、及時(shí)、準(zhǔn)確技術(shù)技術(shù)- - 分離純化分離純化分離：分離：剪碎、酶消化、剪碎、酶消化、ficoll、percoll等等 密度沉降分離密

7、度沉降分離純化：純化：反復(fù)貼壁去除成纖維細(xì)胞反復(fù)貼壁去除成纖維細(xì)胞 自然淘汰去除正常細(xì)胞自然淘汰去除正常細(xì)胞 利用特異抗原標(biāo)志篩選法利用特異抗原標(biāo)志篩選法( panning) 分亞型分亞型 流式細(xì)胞儀分選流式細(xì)胞儀分選 克隆建株克隆建株 高轉(zhuǎn)移株的建立：反復(fù)接種高轉(zhuǎn)移株的建立：反復(fù)接種技術(shù)技術(shù)- -培養(yǎng)培養(yǎng)原代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)：去除纖維細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，去除纖維細(xì)胞及淋巴細(xì)胞， 防止細(xì)菌、真菌污染。防止細(xì)菌、真菌污染。傳代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)：增殖力低的細(xì)胞需要飼養(yǎng)增殖力低的細(xì)胞需要飼養(yǎng) 細(xì)胞適當(dāng)密度細(xì)胞適當(dāng)密度, 基本長(zhǎng)滿后基本長(zhǎng)滿后 傳代傳代, 前前10代不穩(wěn)定，注意代不穩(wěn)定，注意 培養(yǎng)條件，適當(dāng)調(diào)

8、整培基。培養(yǎng)條件，適當(dāng)調(diào)整培基。技術(shù)技術(shù)- - 鑒定與建株鑒定與建株鑒定：鑒定：組織來(lái)源組織來(lái)源 、形態(tài)特征、核型染色體分、形態(tài)特征、核型染色體分析、生長(zhǎng)特性、對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)（析、生長(zhǎng)特性、對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)（tnf)、集落形成、致瘤實(shí)驗(yàn)（裸小鼠）集落形成、致瘤實(shí)驗(yàn)（裸小鼠）建株：建株：生長(zhǎng)半年以上，病理診斷、光鏡及電生長(zhǎng)半年以上，病理診斷、光鏡及電鏡觀察、生長(zhǎng)特征、染色體分析、腫瘤標(biāo)志、鏡觀察、生長(zhǎng)特征、染色體分析、腫瘤標(biāo)志、致瘤及轉(zhuǎn)移情況致瘤及轉(zhuǎn)移情況注意：注意：不是每一腫瘤組織都能建株不是每一腫瘤組織都能建株應(yīng)用應(yīng)用- - 腫瘤治療的研究腫瘤治療的研究治療藥物敏感性的鑒定與篩選治療藥物敏

9、感性的鑒定與篩選腫瘤的多藥耐藥性的鑒定腫瘤的多藥耐藥性的鑒定各種新藥治療的實(shí)驗(yàn)研究各種新藥治療的實(shí)驗(yàn)研究 體外：體外：腫瘤的生長(zhǎng)（腫瘤的生長(zhǎng)（3htdr摻入）摻入） 腫瘤的殺傷率（腫瘤的殺傷率（mtt、51cr釋放）釋放） 體內(nèi)：體內(nèi)：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生長(zhǎng)率、轉(zhuǎn)移率、生存時(shí)間及死亡率生長(zhǎng)率、轉(zhuǎn)移率、生存時(shí)間及死亡率 作用機(jī)理的研究：作用機(jī)理的研究：基因、蛋白、酶、標(biāo)志、受體基因、蛋白、酶、標(biāo)志、受體腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用腫瘤細(xì)胞的遺傳特性：腫瘤細(xì)胞的遺傳特性：各種癌基因及抑各種癌基因及抑癌基因的分析、染色體定位（癌基因的分析、

10、染色體定位（fish法）法）腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為：腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為：細(xì)胞周期細(xì)胞周期（facs)、信號(hào)傳遞、信號(hào)傳遞腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志與激素、受體變化腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志與激素、受體變化（免（免疫細(xì)胞化學(xué)、放射自顯影、酶免疫、熒疫細(xì)胞化學(xué)、放射自顯影、酶免疫、熒光免疫、放射免疫、免疫印跡）光免疫、放射免疫、免疫印跡）單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備 基本原理：基本原理：bunet抗體選擇學(xué)說(shuō)，每個(gè)抗體選擇學(xué)說(shuō)，每個(gè)b細(xì)細(xì)胞只能夠產(chǎn)生一種針對(duì)它的特異性抗原決定胞只能夠產(chǎn)生一種針對(duì)它的特異性抗原決定簇的抗體。從一個(gè)祖先簇的抗體。從一個(gè)祖先b細(xì)胞分裂繁殖形成細(xì)胞分裂繁殖形成

11、的純細(xì)胞系，稱(chēng)為克隆。的純細(xì)胞系，稱(chēng)為克隆。單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備 單克隆抗體定義：來(lái)自克隆系的細(xì)胞基因完單克隆抗體定義：來(lái)自克隆系的細(xì)胞基因完全相同，產(chǎn)生的抗體完全相同。這種從一株全相同，產(chǎn)生的抗體完全相同。這種從一株克隆系產(chǎn)生的抗體克隆系產(chǎn)生的抗體 單克隆抗體（單克隆抗體（mcab)。 1975年年kohler 和和 milstein 首先利用細(xì)胞融首先利用細(xì)胞融合技術(shù)制備了永久分泌單克隆抗體的雜交瘤合技術(shù)制備了永久分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞株。單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備特點(diǎn)：特點(diǎn)：腫瘤細(xì)胞易體外培養(yǎng)和長(zhǎng)期生長(zhǎng)；腫瘤細(xì)胞易體外培養(yǎng)和長(zhǎng)期生長(zhǎng)； b淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 分

12、泌特異性抗體；分泌特異性抗體； 二者雜交融合雜交瘤，繼承二者性質(zhì)。二者雜交融合雜交瘤，繼承二者性質(zhì)。 hat培基：培基：h次黃嘌呤、次黃嘌呤、 a氨基蝶呤氨基蝶呤 t胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷 單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞dna合成途徑：合成途徑： 葉酸衍生物葉酸衍生物 氨基酸、小分子化合物合成氨基酸、小分子化合物合成dna hgprt -tk 次黃鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶次黃鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶 核苷酸前體核苷酸前體單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備hat特點(diǎn)：特點(diǎn)：“a” 葉酸拮抗物葉酸拮抗物骨髓瘤骨髓瘤-骨髓瘤：骨髓瘤：dna合成途徑阻斷；缺

13、合成途徑阻斷；缺hgprt， 不能利用不能利用“h”死亡。死亡。脾細(xì)胞脾細(xì)胞-脾細(xì)胞：脾細(xì)胞：有有hgprt，缺增殖能力，缺增殖能力死亡。死亡。骨髓瘤骨髓瘤-脾細(xì)胞：脾細(xì)胞：hgprt+無(wú)限增殖能力無(wú)限增殖能力 存活。存活。單克隆抗體的制備方法單克隆抗體的制備方法抗原：抗原：純度、分子量。純度、分子量。1. 細(xì)胞細(xì)胞12 1072. 可溶性蛋白質(zhì)抗原可溶性蛋白質(zhì)抗原10 100 g動(dòng)物：動(dòng)物：balb/c鼠，周齡：鼠，周齡：68周，雌性周，雌性佐劑：佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、脂質(zhì)體福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、脂質(zhì)體免免 疫疫 方方 法法1.常規(guī)免疫：常規(guī)免疫：腹腔或頸部多點(diǎn)皮下腹腔

14、或頸部多點(diǎn)皮下 0 天：天：基礎(chǔ)免疫基礎(chǔ)免疫抗原抗原+完全佐劑完全佐劑 15天：天：基礎(chǔ)免疫基礎(chǔ)免疫抗原抗原+不完全佐劑不完全佐劑 30天：天：基礎(chǔ)免疫基礎(chǔ)免疫抗原抗原+不完全佐劑不完全佐劑 45天：天：追加免疫追加免疫同量抗原同量抗原 48天：天：進(jìn)行細(xì)胞融合進(jìn)行細(xì)胞融合 免免 疫疫 方方 法法備注：備注：1. 細(xì)胞、細(xì)菌、病毒等顆粒性抗原有較細(xì)胞、細(xì)菌、病毒等顆粒性抗原有較強(qiáng)抗原性，可不加佐劑，直接腹腔注射。強(qiáng)抗原性，可不加佐劑，直接腹腔注射。2. 可溶性蛋白質(zhì)抗原需加佐劑?？扇苄缘鞍踪|(zhì)抗原需加佐劑。本研究室經(jīng)驗(yàn)：本研究室經(jīng)驗(yàn)：免免 疫疫 方方 法法2. 脾內(nèi)免疫：脾內(nèi)免疫：2.1 0 天

15、：基礎(chǔ)免疫天：基礎(chǔ)免疫 15 天：脾內(nèi)免疫天：脾內(nèi)免疫 18 天：細(xì)胞融合天：細(xì)胞融合2.2 0 天：脾內(nèi)免疫天：脾內(nèi)免疫 4 天：細(xì)胞融合天：細(xì)胞融合免免 疫疫 方方 法法脾內(nèi)免疫脾內(nèi)免疫優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：時(shí)間短，使用抗原量少。時(shí)間短，使用抗原量少。 可溶性抗原：可溶性抗原：210 g 細(xì)胞抗原：細(xì)胞抗原：1 105缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：效果差于常規(guī)免疫，尤其無(wú)基礎(chǔ)免效果差于常規(guī)免疫，尤其無(wú)基礎(chǔ)免 疫的脾內(nèi)免疫。疫的脾內(nèi)免疫。免免 疫疫 方方 法法脾內(nèi)免疫方法：脾內(nèi)免疫方法： balb/c小鼠乙醚麻醉，右臥位，消小鼠乙醚麻醉，右臥位，消毒，無(wú)菌操作剪開(kāi)皮膚，透過(guò)腹膜，用毒，無(wú)菌操作剪開(kāi)皮膚，透過(guò)腹膜，用 4

16、號(hào)針頭注射器注入脾臟，盡量刺深，勿刺號(hào)針頭注射器注入脾臟，盡量刺深，勿刺透，縱軸方向，邊退邊注射或多點(diǎn)注射。透，縱軸方向，邊退邊注射或多點(diǎn)注射。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 抗原體積抗原體積 0.2 ml，脾內(nèi)逐步注射后，脾內(nèi)逐步注射后，針頭拔出口時(shí)要停留片刻，針頭拔出口時(shí)要停留片刻， 縫合切口或用縫合切口或用醫(yī)用黏合劑涂抹切口。醫(yī)用黏合劑涂抹切口。免免 疫疫 方方 法法3 . 弱免疫原免疫方案；弱免疫原免疫方案； 0 天：基礎(chǔ)免疫天：基礎(chǔ)免疫 30 天：基礎(chǔ)免疫天：基礎(chǔ)免疫 45 天：基礎(chǔ)免疫天：基礎(chǔ)免疫 60 天：基礎(chǔ)免疫天：基礎(chǔ)免疫 75 天：基礎(chǔ)免疫天：基礎(chǔ)免疫 6個(gè)月內(nèi)，至鼠血清測(cè)出抗體產(chǎn)生

17、。靜脈個(gè)月內(nèi)，至鼠血清測(cè)出抗體產(chǎn)生。靜脈 或脾內(nèi)追加免疫后或脾內(nèi)追加免疫后7296h細(xì)胞融合。細(xì)胞融合。免免 疫疫 方方 法法4. 體外免疫：體外免疫： 分離小鼠脾細(xì)胞，置分離小鼠脾細(xì)胞，置 10% 20% fcs rpmi1640培基，加適量滋養(yǎng)細(xì)胞與抗原培基，加適量滋養(yǎng)細(xì)胞與抗原（可溶性抗原（可溶性抗原 0.5 5 g/ ml；細(xì)胞性抗原；細(xì)胞性抗原10 5106/ ml），），37，5%co2 培養(yǎng)培養(yǎng) 3 天，天，再分離淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞，融合。再分離淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞，融合。單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備一一.滋養(yǎng)細(xì)胞制備：滋養(yǎng)細(xì)胞制備：1. 機(jī)制：機(jī)制：不明，通常認(rèn)為

18、這類(lèi)細(xì)胞釋放不明，通常認(rèn)為這類(lèi)細(xì)胞釋放 一種或幾種生長(zhǎng)因子，提供必要生長(zhǎng)一種或幾種生長(zhǎng)因子，提供必要生長(zhǎng) 條件。條件。2. 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備滋養(yǎng)細(xì)胞小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備滋養(yǎng)細(xì)胞 正常無(wú)感染正常無(wú)感染balb/c小鼠，處死。小鼠，處死。 75%乙醇浸泡乙醇浸泡 510min，單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備 撕開(kāi)腹部皮膚，撕開(kāi)腹部皮膚， 充分暴露腹腔，充分暴露腹腔， 提起提起 腹膜，剪開(kāi)，吸管注入腹膜，剪開(kāi)，吸管注入5 ml無(wú)血清培基，無(wú)血清培基， 小心提動(dòng)或輕揉腹膜，小心提動(dòng)或輕揉腹膜， 吸出培基。吸出培基。 無(wú)血清培基洗無(wú)血清培基洗2次，細(xì)胞濃度次，細(xì)胞濃度2105/ml, 0.

19、1 ml / 孔孔/ 96孔，相當(dāng)于孔，相當(dāng)于 2104。通。通 常獲常獲2106 5106 只。只。單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備二二. 骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備：骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備：sp2/0, ns-1等等1. 復(fù)蘇，復(fù)蘇，20%fcsrpmi-1640培基為好。培基為好。2. 培養(yǎng)、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（培養(yǎng)、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（1105 5 105/ml），按），按1：5 1：10 稀釋傳代，稀釋傳代，2、3天擴(kuò)大培養(yǎng)，選生長(zhǎng)狀態(tài)、天擴(kuò)大培養(yǎng)，選生長(zhǎng)狀態(tài)、形態(tài)好對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞融合用。形態(tài)好對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞融合用。3. rpmi-1640培基洗培基洗3次（次（1000r/min 5mi

20、n )單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1. 骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞活數(shù)應(yīng)在骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞活數(shù)應(yīng)在95%，2. 無(wú)各種污染，無(wú)各種污染，3.骨髓瘤細(xì)胞質(zhì)量保證、生長(zhǎng)密度合適。骨髓瘤細(xì)胞質(zhì)量保證、生長(zhǎng)密度合適。單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備三三. 免疫脾細(xì)胞懸液制備：免疫脾細(xì)胞懸液制備：1. 免疫免疫balb/c鼠，放眼血致死（收集眼血制鼠，放眼血致死（收集眼血制成血清）。成血清）。2. 浸泡于浸泡于75%乙醇乙醇515分，入超凈臺(tái)，打開(kāi)腹分，入超凈臺(tái)，打開(kāi)腹腔（逐次換器械），取脾。腔（逐次換器械），取脾。3. 剪碎脾臟，注射器內(nèi)芯研磨過(guò)剪碎脾臟，注射器內(nèi)芯研磨過(guò)

21、100目鋼篩，目鋼篩， 平皿預(yù)先平皿預(yù)先23ml rpmi-1640，移入圓底試管，移入圓底試管，補(bǔ)加適量培基，靜置補(bǔ)加適量培基，靜置35分，取上分，取上2/3懸液懸液移入移入50ml離心管，上述反復(fù)離心管，上述反復(fù)23次。次。單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備三三. 免疫脾細(xì)胞懸液制備：免疫脾細(xì)胞懸液制備：5. 上述培基洗細(xì)胞上述培基洗細(xì)胞2次（次（ 1000r/min 10 min ），），6. 不完全培基不完全培基10ml重懸液，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活重懸液，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活 脾細(xì)胞數(shù)，脾細(xì)胞數(shù)，1 10 8 2.5 10 8 /只。只。單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備四四. 50%pe

22、g的準(zhǔn)備：的準(zhǔn)備： 融合前，稱(chēng)融合前，稱(chēng)peg（mw = 4000) 2g，置小，置小瓶?jī)?nèi)，低壓消毒（瓶?jī)?nèi)，低壓消毒（8磅），磅），15min,取出立即取出立即邊加邊搖加入邊加邊搖加入2ml完全培基，（內(nèi)含完全培基，（內(nèi)含0.3%ml二二甲基亞楓，以提高融合率），至完全混合，甲基亞楓，以提高融合率），至完全混合，4 保存。用前保存。用前37 預(yù)熱。要求預(yù)熱。要求peg現(xiàn)配，防止現(xiàn)配，防止ph變堿。變堿。單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備五五. 細(xì)胞融合：細(xì)胞融合：1. 將準(zhǔn)備好的骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞混合于將準(zhǔn)備好的骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞混合于 50ml離心管內(nèi)（脾細(xì)胞離心管內(nèi)（脾細(xì)胞1 10

23、8，骨髓瘤細(xì)，骨髓瘤細(xì)胞胞1 10 7）。用）。用sp2/0時(shí)，脾細(xì)胞：骨髓瘤時(shí)，脾細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞以細(xì)胞以10：1為好；用為好；用ns-1，脾細(xì)胞：骨髓，脾細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞以瘤細(xì)胞以5：1為好。為好。單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備2. rpmi-1640培基洗培基洗2次（次（1500r /min/8min）；）；3. 傾倒上清，吸盡殘留液，輕彈管底，傾倒上清，吸盡殘留液，輕彈管底， 使細(xì)胞使細(xì)胞疏松，離心管移至超凈臺(tái)預(yù)先放置的疏松，離心管移至超凈臺(tái)預(yù)先放置的37 水浴。水浴。4. 1 ml 吸管吸取吸管吸取 0.8 ml 37 peg，110 8 脾細(xì)胞脾細(xì)胞+ 0.8 ml pe

24、g，邊加邊搖，邊加邊搖，60s內(nèi)加完，內(nèi)加完，輕搖輕搖1.5 min。5 min內(nèi)內(nèi)搖動(dòng)緩和搖動(dòng)緩和加入加入10 ml 預(yù)預(yù) 溫溫37 的的rpmi-1640。單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備注意：注意： 第第1 min 加加 1 ml; 第第2 min 加加 1 ml; 第第3 min 加加 1.5 ml; 第第4 min 加加 1.5 ml; 第第5 min 加加 5 ml; 再補(bǔ)加再補(bǔ)加40 ml。 離心：離心：1000r / min / 5min.單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備5. 移出上清，取少量移出上清，取少量hat小心吹散細(xì)胞，細(xì)小心吹散細(xì)胞，細(xì) 胞移入胞移入h

25、at培基中，按免疫脾細(xì)胞培基中，按免疫脾細(xì)胞210 5 / 孔孔/96孔，孔， 加入加入 0.1 ml 0.2 ml/孔（已加入融合當(dāng)天孔（已加入融合當(dāng)天制備的滋養(yǎng)細(xì)胞），制備的滋養(yǎng)細(xì)胞）， co2 孵箱孵箱 37 。提示：提示：接種接種1012塊塊96孔板，使孔板，使80%雜交瘤生長(zhǎng)為雜交瘤生長(zhǎng)為單克隆，減少克隆化次數(shù)，陽(yáng)性孔不易丟失。單克隆，減少克隆化次數(shù)，陽(yáng)性孔不易丟失。單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備六六. 融合細(xì)胞觀察與換液：融合細(xì)胞觀察與換液：1. 第第23天骨髓瘤細(xì)胞退化、核縮、碎裂，天骨髓瘤細(xì)胞退化、核縮、碎裂， 增生、吞噬碎片；增生、吞噬碎片；第第45天可見(jiàn)小堆天可見(jiàn)

26、小堆雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。記錄。雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。記錄。2. 融合后融合后57天確認(rèn)骨髓瘤細(xì)胞全部死亡，天確認(rèn)骨髓瘤細(xì)胞全部死亡， 毛細(xì)吸管吸出毛細(xì)吸管吸出0.1ml 0.15ml hat，換成同量換成同量ht培基。培基。單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備七七. 雜交瘤抗體檢測(cè)：雜交瘤抗體檢測(cè)： 培基變黃，雜交瘤細(xì)胞占孔底面積培基變黃，雜交瘤細(xì)胞占孔底面積1/4、狀狀態(tài)好，可測(cè)上清液抗體（非分泌性比分泌性雜態(tài)好，可測(cè)上清液抗體（非分泌性比分泌性雜交瘤長(zhǎng)速快），及時(shí)測(cè)抗體及時(shí)克隆化，以免交瘤長(zhǎng)速快），及時(shí)測(cè)抗體及時(shí)克隆化，以免目的雜交瘤丟失。目的雜交瘤丟失。 測(cè)定時(shí)間：融合后測(cè)定時(shí)間：融合后1015天，第次換液天，第次換液3天后，天后，elisa、冰凍切片熒光技術(shù)等。、冰凍切片熒光技術(shù)等。 陽(yáng)性孔雜交瘤轉(zhuǎn)入陽(yáng)性孔雜交瘤轉(zhuǎn)入24孔板，孔板，1天后細(xì)胞狀天后細(xì)胞狀態(tài)態(tài) 好即可克隆化。好即可克隆化。單單 克克 隆隆 抗抗 體體 制制 備備八八. 克隆化：有限稀釋法?？寺』河邢尴♂尫?。1. 按前述準(zhǔn)備新鮮滋養(yǎng)細(xì)胞用按前述準(zhǔn)備新鮮滋養(yǎng)細(xì)胞用htht培基接種培基接種 9696孔板，孔板，0.1ml/0.1ml/孔?？?。2. 向向2424孔板加孔板加0.9