1分子生物學(xué)改造學(xué)習(xí)課程

1、 在體外，通過(guò)堿基取代、插入或缺失的方法，使基因DNA序列中的某個(gè)特定堿基發(fā)生改變，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)工程。 通過(guò)蛋白質(zhì)工程，人們可以隨心所欲地改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)和生物學(xué)功能。例如，我們可以利用蛋白質(zhì)工程改變酶的Km、Vmax，酶促反應(yīng)的最適溫度、最適pH值、酶促反應(yīng)的特異性以及酶蛋白的穩(wěn)定性等。 蛋白質(zhì)工程的主要技術(shù)之一是定點(diǎn)突變技術(shù).第1頁(yè)/共102頁(yè)第一頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。一、定點(diǎn)突變 利用分子生物學(xué)技術(shù)，在體外通過(guò)堿基取代、插入或缺失可以使基因DNA序列中任何一個(gè)特定的堿基發(fā)生改變。這種體外特異性改變某個(gè)堿基的技術(shù)，稱謂定點(diǎn)突變（site dir

2、ected mutagenesis）。 定點(diǎn)突變具有簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已發(fā)展成為基因操作的一種技術(shù)。這種技術(shù)不僅適用于基因結(jié)構(gòu)與功能的研究，還可通過(guò)改變基因的密碼子來(lái)改造天然蛋白質(zhì)。第2頁(yè)/共102頁(yè)第二頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。第3頁(yè)/共102頁(yè)第三頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。二、基因定點(diǎn)突變的意義 用于研究基因的結(jié)構(gòu)與功能； 通過(guò)改變基因的密碼子來(lái)改造天然蛋白質(zhì)，使其更符合人們的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或藥物的開(kāi)發(fā)。第4頁(yè)/共102頁(yè)第四頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 如枯草桿菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的絲氨酸(Ser221)鄰近的

3、甲硫氨酸(Met222)易被氧化成硫氫化物，若以其他氨基酸取代Met222，則可提高酶的氧化穩(wěn)定性而又不影響其催化活性。這是結(jié)構(gòu)分析和定點(diǎn)突變改造蛋白質(zhì)的成功范例。第5頁(yè)/共102頁(yè)第五頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 枯草桿菌蛋白酶可作為洗滌劑的添加劑，但由于其只能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽鍵，底物作用范圍過(guò)窄而限制了洗滌劑的高效性，若用帶正電荷的賴氨酸(Lys)取代位于活性中心166位的甘氨酸(Gly)，所獲得的突變酶不僅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽鍵，而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸(Glu)所形成的肽鍵，使其底物作用范圍拓寬，因而可能成為最高效的洗滌劑添加酶，這是定

4、點(diǎn)突變改變蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的成功例子。第6頁(yè)/共102頁(yè)第六頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。加入二硫鍵增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)分子中兩個(gè)半胱氨酸殘基上的巰基（SH）之間氧化脫氫即形成二硫鍵（）。二硫鍵的數(shù)量與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有關(guān)，增加蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，可提高蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。 在一項(xiàng)研究中，通過(guò)寡核苷酸定點(diǎn)突變構(gòu)建了T4溶菌酶的六種變異體,比較了它們的活性.第7頁(yè)/共102頁(yè)第七頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 T4溶菌酶和6種設(shè)計(jì)的變體特性 酶 氨基酸的位置 二硫鍵的數(shù)目 相對(duì)活性 Tm 3 9 21 54 97 142 164 (%) () wt

5、 Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 41.9 pwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu 0 100 41.9 A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46.7 B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 48.3 C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52.9 D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 57.6 E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9 F Cys Cys Cys Thr

6、Cys Cys Cys 3 0 65.9 wt：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；AF：六種設(shè)計(jì)的半胱氨酸變體；Tm:熔點(diǎn)溫度第8頁(yè)/共102頁(yè)第八頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。將Asn和Gln轉(zhuǎn)換成其他氨基酸 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)暴露于高溫時(shí): 天冬酰胺（Asn） 天冬氨酸(Asp) + NH3 谷氨酰胺(Gln) 谷氨酸(Glu) + NH3 導(dǎo)致肽鏈折疊的局部的改變,可能影響其活性。 如酵母的丙糖磷酸異構(gòu)酶是由兩個(gè)相同的亞基組成的二聚體，每個(gè)亞基都含有兩個(gè)Asn殘基，均位于兩個(gè)亞基相互接觸的表面上，可能與該酶的熱穩(wěn)定性有關(guān)。 若將兩個(gè)Asn全部換成Asp，則變體酶即使在常溫下也不穩(wěn)定，而且

7、酶活性也大為降低； 而將2個(gè)Asn分別換為蘇氨酸(Thr)和異亮氨酸(Ile)，其半衰期則延長(zhǎng)。第9頁(yè)/共102頁(yè)第九頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 酵母菌磷酸丙糖異構(gòu)酶及其變體的熱穩(wěn)定性 氨基酸位點(diǎn) 酶 14 78 半衰期（min） 野生型 Asn Asn 13 變體A Asn Thr 17 變體B Asn Ile 16 變體C Thr Ile 25 變體D Asp Asn 11 酶的穩(wěn)定性以在100時(shí)半衰期或者失活率來(lái)表示。半衰期越長(zhǎng)酶越穩(wěn)定第10頁(yè)/共102頁(yè)第十頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。減少游離Cys殘基的數(shù)目 在利用DNA重組技術(shù)表達(dá)外源基因時(shí)，常常會(huì)遇到這種情況：外

8、源蛋白的表達(dá)量很大，但其生物活性卻很低，即外源蛋白的比活性很低。 利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)減少游離的半胱氨酸（Cys）殘基數(shù)目，以減少蛋白錯(cuò)誤折疊的可能性，從而可以提高蛋白質(zhì)的生物活性。第11頁(yè)/共102頁(yè)第十一頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 例如：當(dāng)人-干擾素基因（-IFN）在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，盡管其表達(dá)量很高，但其比活性只及天然蛋白質(zhì)的10%。 DNA序列分析顯示， -IFN所編碼的蛋白質(zhì)有三個(gè)Cys殘基，其中2個(gè)形成分子內(nèi)二硫鍵，而另一個(gè)游離的Cys可能涉及到-IFN分子間二硫鍵的形成，導(dǎo)致二聚體的產(chǎn)生，使單聚體含量減少，活性降底。 將-IFN分子中的游離Cys殘基用Ser來(lái)取代，因?yàn)镃

9、ys與Ser分子結(jié)構(gòu)相似，前者有一個(gè)S原子，而后者是一個(gè)O原子，減少了二聚體的形成，提高了活性蛋白質(zhì)的得率。第12頁(yè)/共102頁(yè)第十二頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。增加酶的活性 用定點(diǎn)突變技術(shù)不僅可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，還可以提高酶的活性。要改變酶的活性，需要一個(gè)詳細(xì)描述了酶的活性位點(diǎn)的圖譜。有了這樣的資料，研究者們即可推測(cè)酶與底物的親和程度，并利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，提高酶的活性。第13頁(yè)/共102頁(yè)第十三頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 天然和突變酪氨酰-tRNA合成酶活性 酶 Kcat(s-1) Km(mmol/L) Kcat/Km(s-1mol-1) Thr-51

10、4.7 2.5 1.860 Ala-51 4.0 1.2 3.200 Pro-51 1.8 0.019 95.800第14頁(yè)/共102頁(yè)第十四頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。改變酶的特異性突變葡萄球菌核酸酶與含-SH寡核苷酸結(jié)合示意圖第15頁(yè)/共102頁(yè)第十五頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。三、定點(diǎn)突變?cè)淼?6頁(yè)/共102頁(yè)第十六頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 第17頁(yè)/共102頁(yè)第十七頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。（一）M13DNA寡核苷酸突變 基因工程中,噬菌體是一種常用的基因載體,其中又以M13M13 和為最常用。 M13噬菌體是一種環(huán)形DNA，基因組大小為6.4k

11、b，在顆粒中包裝的僅是正鏈的DNA，有時(shí)也稱為感染型單鏈DNA(single stranded DNA, ssDNA) 。 當(dāng)感染型單鏈M13噬菌體感染大腸桿菌后，在菌體內(nèi)借助宿主的酶系統(tǒng)先把ssDNA復(fù)制為雙鏈（dsDNA），稱為復(fù)制型（replication form,RF）M13（RF- M13）。 廣泛用于DNA序列分析和噬菌體表面展示系統(tǒng)（phage display)和單鏈核酸的制備。 四、定點(diǎn)突變的常用方法第18頁(yè)/共102頁(yè)第十八頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。1.基本原理 再使用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段作引物，啟動(dòng)M13單鏈DNA分子進(jìn)行復(fù)制，隨后這段寡核苷酸

12、引物便成為新合成的DNA子鏈的一個(gè)組成部分。 因此所產(chǎn)生的新鏈便具有已發(fā)生突變的堿基序列,將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞后,經(jīng)過(guò)不斷復(fù)制,即可獲得突變的DNA分子,再經(jīng)表達(dá)即可獲得改造后蛋白質(zhì). 為了使目的基因的特定位點(diǎn)發(fā)生突變，所設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物的序列除了所需的突變堿基外，其余的則與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補(bǔ)。 第19頁(yè)/共102頁(yè)第十九頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。2.突變過(guò)程1)合成含有目的基因的正鏈DNA；2)合成含有特殊突變堿基的引物；3）制備異源雙鏈DNA；4）富集和轉(zhuǎn)化雙鏈DNA分子；5）篩選突變體并鑒定第20頁(yè)/共102頁(yè)第二十頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。（二）Kunkel

13、定點(diǎn)突變法 體外DNA合成往往是不完全的，所以部分合成的DNA分子必須通過(guò)蔗糖密度梯度離心除去,獲得純化的突變DNA。 理論上來(lái)說(shuō)，DNA是半保留復(fù)制的，應(yīng)用寡核苷酸定點(diǎn)突變時(shí)，所形成的噬菌體中攜帶突變基因的應(yīng)為一半。但實(shí)際上，由于技術(shù)上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突變基因的噬菌體。第21頁(yè)/共102頁(yè)第二十一頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。具體步驟：具體步驟： 將待突變的基因克隆入將待突變的基因克隆入M13 DNA載載體上，導(dǎo)入具有體上，導(dǎo)入具有dUTP酶（酶（dut）和）和N-尿嘧啶脫糖苷酶（尿嘧啶脫糖苷酶（ung）雙缺陷）雙缺陷的大腸桿菌（的大腸桿菌（dut-，ung-）菌株）

14、菌株中。中。 Dut缺陷缺陷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)dUTP水平上升水平上升，并在并在DNA復(fù)制時(shí)，部分取代復(fù)制時(shí)，部分取代dTTP進(jìn)進(jìn)入入DNA新生鏈中。又由于新生鏈中。又由于ung缺陷缺陷使摻入使摻入DNA的的dUTP殘基不能除去殘基不能除去。由這種大腸桿菌菌株產(chǎn)生的由這種大腸桿菌菌株產(chǎn)生的M13單鏈單鏈DNA大約有大約有1%的的T被被U所取代所取代，然后進(jìn)行然后進(jìn)行DNA定點(diǎn)突變。定點(diǎn)突變。 雙鏈雙鏈DNA導(dǎo)入正常的大腸桿菌中，導(dǎo)入正常的大腸桿菌中，其尿嘧啶其尿嘧啶N-糖基化酶除去糖基化酶除去DNA鏈鏈上的尿嘧啶堿基。上的尿嘧啶堿基。 結(jié)果原來(lái)的結(jié)果原來(lái)的M13模板鏈被降解，模板鏈被降解，只

15、有突變鏈因不含只有突變鏈因不含U，被保留下，被保留下來(lái)。這種方法產(chǎn)生的來(lái)。這種方法產(chǎn)生的M13噬菌體噬菌體中含有突變中含有突變DNA的比例大大增加。的比例大大增加。第22頁(yè)/共102頁(yè)第二十二頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。（三） PCR定點(diǎn)突變 Polymerase Chain Reaction （PCR）是一種體外酶促合成特定DNA片斷的技術(shù)，是根據(jù)人類的需要對(duì)復(fù)雜生命過(guò)程的一種簡(jiǎn)單化的模擬。PCR技術(shù)的原理是DNA半保留復(fù)制。首創(chuàng)。第23頁(yè)/共102頁(yè)第二十三頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 PCR進(jìn)行寡核苷酸定點(diǎn)突變的示意圖 第24頁(yè)/共102頁(yè)第二十四頁(yè)，編輯于星期四：二十三

16、點(diǎn) 三十分。1 1、重疊延伸、重疊延伸PCR PCR （OE-PCROE-PCR） 首先設(shè)計(jì)兩個(gè)首先設(shè)計(jì)兩個(gè)PCRPCR反應(yīng)以產(chǎn)生兩個(gè)含突變位點(diǎn)的反應(yīng)以產(chǎn)生兩個(gè)含突變位點(diǎn)的DNADNA片段，隨后將上述片段，隨后將上述兩個(gè)兩個(gè)PCRPCR產(chǎn)物混合，二者通過(guò)產(chǎn)物混合，二者通過(guò)末端互補(bǔ)區(qū)結(jié)合末端互補(bǔ)區(qū)結(jié)合并在適宜的溫度下并在適宜的溫度下互為引物延互為引物延伸伸得到完整的含突變的基因，對(duì)第一次得到完整的含突變的基因，對(duì)第一次PCRPCR產(chǎn)物進(jìn)行純化處理可顯著提高突產(chǎn)物進(jìn)行純化處理可顯著提高突變效率變效率第25頁(yè)/共102頁(yè)第二十五頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。第26頁(yè)/共102頁(yè)第二十六頁(yè)，編輯

17、于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。2 2、大引物、大引物PCRPCR法法（megaprimer PCR )megaprimer PCR ) 先設(shè)置一個(gè)先設(shè)置一個(gè)PCRPCR反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)含突變的反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)含突變的DNADNA片段，然后再以此片段，然后再以此DNADNA片段作為引物與片段作為引物與原模板退火進(jìn)行原模板退火進(jìn)行PCRPCR擴(kuò)增得到含突變的完整的基因。因?yàn)樽鳛橐锸褂玫臄U(kuò)增得到含突變的完整的基因。因?yàn)樽鳛橐锸褂玫腄NADNA片段較片段較通常的引物要大許多甚至有上百堿基，所以命名為大引物通常的引物要大許多甚至有上百堿基，所以命名為大引物PCRPCR法。法。 第27頁(yè)/共102頁(yè)第二十七頁(yè)，

18、編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。大引物大引物PCR PCR 定點(diǎn)突變技術(shù)路線定點(diǎn)突變技術(shù)路線（圓點(diǎn)指突變位點(diǎn)）第28頁(yè)/共102頁(yè)第二十八頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。3 3、環(huán)狀突變、環(huán)狀突變 PCR PCR 法法定義：以整個(gè)帶有目的基因的質(zhì)粒為模板，用突變劑進(jìn)定義：以整個(gè)帶有目的基因的質(zhì)粒為模板，用突變劑進(jìn)行擴(kuò)增，最后產(chǎn)生環(huán)狀的帶有目的突變的質(zhì)粒。行擴(kuò)增，最后產(chǎn)生環(huán)狀的帶有目的突變的質(zhì)粒。方法：方法：兩個(gè)引物反向、緊鄰但沒(méi)有重疊區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物是平末兩個(gè)引物反向、緊鄰但沒(méi)有重疊區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物是平末端的線性端的線性DNADNA，需用，需用T4T4連接酶環(huán)化處理。連接酶環(huán)化處理。以以Strat

19、ageneStratagene公司開(kāi)發(fā)的定點(diǎn)突變?cè)噭┖袨榇?，公司開(kāi)發(fā)的定點(diǎn)突變?cè)噭┖袨榇恚瑑蓚€(gè)引物也是反向的并且其兩個(gè)引物也是反向的并且其5 5端有端有l(wèi)5l5個(gè)堿基以上的個(gè)堿基以上的重疊區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物為帶黏性末端的線性重疊區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物為帶黏性末端的線性DNADNA，可自行環(huán)，可自行環(huán)化?；?。第29頁(yè)/共102頁(yè)第二十九頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。環(huán)狀突變環(huán)狀突變 PCR PCR 法法第30頁(yè)/共102頁(yè)第三十頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。環(huán)狀突變環(huán)狀突變 PCR PCR 法法第31頁(yè)/共102頁(yè)第三十一頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。第32頁(yè)/共102頁(yè)第三十二頁(yè)，編輯于

20、星期四：二十三點(diǎn) 三十分。第33頁(yè)/共102頁(yè)第三十三頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。第34頁(yè)/共102頁(yè)第三十四頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。通過(guò)特殊氨基酸的改變提高蛋白的穩(wěn)定性第35頁(yè)/共102頁(yè)第三十五頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。通過(guò)引入二硫鍵提高蛋白的穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)分子中兩個(gè)半胱氨酸的巰基之間氧化脫氫即形成二硫鍵。二硫鍵的數(shù)量與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有關(guān)，增加蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，可以提高蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。第36頁(yè)/共102頁(yè)第三十六頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。通過(guò)改變活性中心附近的氨基酸提高酶的催化活性應(yīng)用舉例：大腸桿菌堿性磷酸酶應(yīng)用

21、舉例：大腸桿菌堿性磷酸酶第37頁(yè)/共102頁(yè)第三十七頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。E.coli Alkaline phosphatase: Wild Type D101SAsp101Ser101第38頁(yè)/共102頁(yè)第三十八頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。q易錯(cuò)易錯(cuò)PCR（Error prone PCR）qDNA改組（改組（DNA shuffling）第39頁(yè)/共102頁(yè)第三十九頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。v易錯(cuò) PCR（error-prone PCR）是指通過(guò)改變PCR反應(yīng)條件來(lái)調(diào)整PCR反應(yīng)中突變的頻率,降低聚合酶固有的突變序列傾向性,提高突變譜的多樣性,使得錯(cuò)誤堿基隨機(jī)地

22、以一定的頻率摻入到擴(kuò)增的基因中,從而得到隨機(jī)突變的DNA群體,最后用合適的載體克隆突變基因。v連續(xù)易錯(cuò)PCR (sequential error prone PCR)策略。即將一次PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變。第40頁(yè)/共102頁(yè)第四十頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。方法：l增加MgCl2濃度到7mM,穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基配對(duì)l增加聚合酶量到5U,促使在錯(cuò)配堿基處繼續(xù)延伸反應(yīng)l降低一種dNTP的量（降至1-10）.在缺乏正確核苷酸時(shí),聚合酶經(jīng)短暫停留后,會(huì)插入另外3種可用核苷酸的一種l加入次黃嘌呤dITP來(lái)代替被減少的dNTP,能與C、T、A配

23、對(duì)l緩沖液中另加0.5mmol/L MnCl2, Mn2+能降低聚合酶對(duì)模板的特異性l增加dCTP和dTTP的濃度到1mM，促進(jìn)錯(cuò)誤摻入l使用突變DNA聚合酶如Mutazyme GCAT第41頁(yè)/共102頁(yè)第四十一頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。易錯(cuò)PCR(epPCR) 第42頁(yè)/共102頁(yè)第四十二頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。DNA改組（DNA Shuffling）又稱DNA“洗牌”,或DNA體外隨機(jī)拼接技術(shù),它依賴PCR,又不完全等同于傳統(tǒng)的PCR技術(shù),所以,DNA體外隨機(jī)拼接又稱為有性PCR。指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進(jìn)行有性重組(Sexual Recombin

24、ation)。通過(guò)改變單個(gè)基因(或基因家族，gene family)原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新功能。第43頁(yè)/共102頁(yè)第四十三頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。DNA shuffling體外基因突變一般過(guò)程如下 (1)獲得目的基因:選擇一組分別具有一系列所需性狀的基因序列作為重組的親本,親本之間有序列同源性(60%).親本可以是經(jīng)隨機(jī)誘變得到的一組有益突變體,或天然存在的基因家族.常用的有兩種方法。n為了增加突變率采用PCR擴(kuò)增目的基因回收n為了增強(qiáng)保真性，可以采取抽提含有目的基因的質(zhì)粒，通過(guò)酶切回收。第44頁(yè)/共102頁(yè)第四十四頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。(

25、2)基因酶切回收:采用DNase I消化基因DNA得到10-50 bps或100-300 bps的片段，酶切過(guò)程中用Mn2+能提高保真性3倍左右。(3)無(wú)引物PCR:切割的DNA片段通過(guò)相互間的同源隨機(jī)互補(bǔ)并互為引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增,獲得大量隨機(jī)組合的新DNA突變體.為確保得到高保真性的片段，應(yīng)在較高的溫度下復(fù)性。同標(biāo)準(zhǔn)PCR,先對(duì)dsDNA進(jìn)行熱變性,退火時(shí)單鏈片段與足夠長(zhǎng)度互補(bǔ)序列的其它單鏈配對(duì),形成3或5突出端,聚合酶延伸3凹端.反復(fù)循環(huán)，隨著循環(huán)數(shù)增加,片段的平均長(zhǎng)度也增加,最后達(dá)到DNA親本序列的原始長(zhǎng)度.第45頁(yè)/共102頁(yè)第四十五頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。(4)有引物PC

26、R:將無(wú)引物PCR產(chǎn)物作適當(dāng)稀釋，作為模板進(jìn)行PCR，加入特定兩側(cè)引物進(jìn)行最后的PCR擴(kuò)增,便可獲得全長(zhǎng)基因的PCR產(chǎn)物。(5)目的突變基因的獲得:回收目的片段克隆到載體上，轉(zhuǎn)化選擇所需的突變了的目的基因。如篩選抗性基因、高酶活基因等第46頁(yè)/共102頁(yè)第四十六頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。DNase處理無(wú)引物PCR 片段重裝配3355355355335533反復(fù)循環(huán)第47頁(yè)/共102頁(yè)第四十七頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。有引物PCR克隆篩選第48頁(yè)/共102頁(yè)第四十八頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。DNA Shuffling技術(shù)能模擬生物的基因在數(shù)百萬(wàn)年間發(fā)生的分子進(jìn)化過(guò)程

27、，并能在短期的實(shí)驗(yàn)循環(huán)中定向篩選出特定基因編碼的酶蛋白活性提高成千上萬(wàn)倍的功能性突變基因。項(xiàng)目項(xiàng)目進(jìn)化速度進(jìn)化對(duì)象進(jìn)化周期影響對(duì)象突變效率常規(guī)定向常規(guī)定向進(jìn)化進(jìn)化緩慢緩慢進(jìn)化進(jìn)化整個(gè)基因整個(gè)基因組組多年多年完整基因完整基因組組高高DNAShuffling快速快速進(jìn)化進(jìn)化特定基因特定基因/操縱子操縱子/病病毒毒幾天幾天部分基因部分基因組組低低DNA Shuffling與常規(guī)定向進(jìn)化的比較第49頁(yè)/共102頁(yè)第四十九頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。實(shí)例:1994年，美國(guó)的Stemmer采用單個(gè)基因的DNA Shuffling和回交技術(shù)，在大腸桿菌中使編碼-內(nèi)酰胺酶的TEM-I基因的抗生素抑制活

28、性(MIC)從0. 02ug/mL提高到640ug/mL,即提高了32, 000倍。次后，他們又相繼選取了綠色熒光蛋白基因(gfp)和-半乳糖昔酶基因(lac) (1997)用DNA Shuffling技術(shù)模擬并加速了分子進(jìn)化過(guò)程。篩選獲得了酶活性大幅度提高的突變株1996年，Moore等亦采用該技術(shù)對(duì)降解污水中有機(jī)污染物的對(duì)硝基芐基酯酶基因進(jìn)行了定向模擬分子進(jìn)化研究。1998, Crameri等采用4個(gè)不同來(lái)源的先鋒霉素基因混合進(jìn)行異源基因組的DNA Shuffling，使單一循環(huán)的MIC活性提高了270-540倍。而同時(shí)只用單一基因進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)僅提高了8倍。第50頁(yè)/共102頁(yè)第五十頁(yè)，編輯

29、于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。交錯(cuò)延伸重組（staggered extension process，StEP）將DNA Shuffling技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)的DNA體外重組技術(shù)核心技術(shù):有性PCR,在一個(gè)反應(yīng)體系中以2個(gè)以上有一定序列同源性的DNA片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),通過(guò)變換模板機(jī)制實(shí)現(xiàn)DNA序列的重新組裝第51頁(yè)/共102頁(yè)第五十一頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。交錯(cuò)延伸重組的一般過(guò)程如下 (1)獲得目的基因:選擇兩個(gè)以上有一定序列同源性的分別具有優(yōu)良性狀的親本基因作為PCR模板n省去用DNase將DNA切割成片段及片段純化步驟,簡(jiǎn)化了程序(2) 短暫PCR反應(yīng) 在每輪循環(huán)中,退火和延伸

30、反應(yīng)控制在短暫的時(shí)間(5s),引物先在一個(gè)模板鏈上延伸,只能合成出很短的新生鏈.經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火后繼續(xù)進(jìn)行短暫的延伸,此過(guò)程反復(fù)進(jìn)行,直到產(chǎn)生全長(zhǎng)的基因,得到間隔地含不同模板序列的雜交DNA分子.第52頁(yè)/共102頁(yè)第五十二頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。(3)兩端引物PCR:加入兩端引物作標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng),擴(kuò)增全長(zhǎng)的雜交DNA鏈。(4)目的突變基因的獲得:回收目的片段克隆到載體上，從得到的DNA文庫(kù)中選擇或篩選得到性狀優(yōu)化的基因第53頁(yè)/共102頁(yè)第五十三頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。第54頁(yè)/共102頁(yè)第五十四頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分

31、。隨機(jī)引發(fā)重組（ random-priming recombination，RPR ）原理:用一套隨機(jī)引物與模板配對(duì)延伸,產(chǎn)生互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短DNA片段混合物,由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā),這些短的DNA片段中也會(huì)有少量點(diǎn)突變,在隨后的PCR反應(yīng)中,這些短的DNA片段互為引物重新組裝產(chǎn)生全長(zhǎng)的基因模板:一條DNA單鏈或cDNA第55頁(yè)/共102頁(yè)第五十五頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。隨機(jī)引發(fā)重組的一般過(guò)程如下 (1)隨機(jī)引發(fā)合成短DNA片段混合物:以變性DNA為模板,加入隨機(jī)引物,用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段進(jìn)行延伸反應(yīng),得到長(zhǎng)短不一的新生DNA片段(50-500bp)(2)

32、 過(guò)濾、純化DNA片段混合物 去除模板、長(zhǎng)的新生DNA片段、小的新生DNA片段（30bp），蛋白質(zhì)和引物.(3)無(wú)引物PCR.新生DNA片段互為引物,重新組裝產(chǎn)生全長(zhǎng)的雜交DNA鏈(4)標(biāo)準(zhǔn)PCR 加入特異的兩端引物第56頁(yè)/共102頁(yè)第五十六頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。第57頁(yè)/共102頁(yè)第五十七頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。三、基因融合和基因剪接三、基因融合和基因剪接1 1利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由2 2基因融合的策略與蛋白質(zhì)分子嵌合體基因融合的策略與蛋白質(zhì)分子嵌合體3 3蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分

33、子間的連接第58頁(yè)/共102頁(yè)第五十八頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由 外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解降解 通過(guò)與特異蛋白質(zhì)或特異的結(jié)構(gòu)域形成通過(guò)與特異蛋白質(zhì)或特異的結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白融合蛋白，利于快，利于快速回收、純化速回收、純化 融合蛋白可以體外切割去除融合部分，可以獲得天然蛋白融合蛋白可以體外切割去除融合部分，可以獲得天然蛋白 通過(guò)與特定的蛋白質(zhì)形成融合蛋白，可以避免外源蛋白通過(guò)與特定的蛋白質(zhì)形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體包涵體 基因融合是對(duì)基因進(jìn)行

34、改造的手段，廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因融合是對(duì)基因進(jìn)行改造的手段，廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的研究功能的研究第59頁(yè)/共102頁(yè)第五十九頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分?；蛉诤系牟呗曰蛉诤系牟呗詫⒅亟M基因直接剪接于適當(dāng)?shù)膶⒅亟M基因直接剪接于適當(dāng)?shù)男盘?hào)肽信號(hào)肽之后之后將外源基因本身按將外源基因本身按閱讀框架閱讀框架自我融合。對(duì)一些小肽的穩(wěn)定表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的活自我融合。對(duì)一些小肽的穩(wěn)定表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的活性非常重要性非常重要目標(biāo)蛋白在與其融合的蛋白伙伴序列的目標(biāo)蛋白在與其融合的蛋白伙伴序列的C C端或端或N N端融合端融合第60頁(yè)/共102頁(yè)第六十頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。為蛋白質(zhì)的表達(dá)和純

35、化提供方便為蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化提供方便 研究蛋白質(zhì)的定位及移動(dòng)研究蛋白質(zhì)的定位及移動(dòng)控制蛋白質(zhì)固定的空間取向控制蛋白質(zhì)固定的空間取向構(gòu)建具有雙催化活性的融合蛋白或融合酶構(gòu)建具有雙催化活性的融合蛋白或融合酶防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解 改變胞內(nèi)溶解性：硫氧還蛋白，改變胞內(nèi)溶解性：硫氧還蛋白，GSTGST蛋白表達(dá)的空間定位：信號(hào)肽蛋白表達(dá)的空間定位：信號(hào)肽第61頁(yè)/共102頁(yè)第六十一頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。接頭（接頭（linkerlinker）的設(shè)計(jì)）的設(shè)計(jì) 長(zhǎng)度：過(guò)長(zhǎng)對(duì)蛋白裂解敏感，免疫原性增加；過(guò)短影響蛋白折疊 常用非極性的疏水氨基酸：構(gòu)象廣

36、泛，有利于運(yùn)動(dòng)；體積小有利于堆積 單鏈抗體（scFv）第62頁(yè)/共102頁(yè)第六十二頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 生化反應(yīng)常常需要多酶順序催化來(lái)進(jìn)行，稱為順序酶反應(yīng)（Sequence enzyme reaction）。大量的研究表明，通過(guò)基因融合構(gòu)建具有雙酶活力的融合蛋白，可有效提高順序酶反應(yīng)的總轉(zhuǎn)化效率。 第63頁(yè)/共102頁(yè)第六十三頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。黑曲霉葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)曲霉糖化酶(Glucoamylase,GA) 第64頁(yè)/共102頁(yè)第六十四頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。GOD subunitGOD subunitGAG

37、AGLG fusion enzymeLinkerpeptideTranslated fusion peptide chains Expressed fusion enzyme(Ser-Gly)第65頁(yè)/共102頁(yè)第六十五頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用可以使蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化方便地進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)，將目標(biāo)蛋白編碼基因與一段被稱為“親和尾”（Affinity tail）的編碼序列相連接，這段“親和尾”可以與親和層析柱上的配基特異地結(jié)合，使目標(biāo)蛋白可以用親和層析的方法快速而簡(jiǎn)便地純化出來(lái)。融合蛋白標(biāo)簽 第66頁(yè)/共102頁(yè)第六十六頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。含配體溶液

38、含配體溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未結(jié)合的蛋白洗下未結(jié)合的蛋白混合蛋白樣品混合蛋白樣品平衡液平衡液帶有配體的樹(shù)脂珠帶有配體的樹(shù)脂珠（或膠粒）（或膠粒）第67頁(yè)/共102頁(yè)第六十七頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。融合標(biāo)簽的功能融合標(biāo)簽的功能 蛋白純化 蛋白質(zhì)的檢測(cè)和定向固定 體內(nèi)生物事件的可視化 提高重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量 增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)的可溶性及穩(wěn)定性 第68頁(yè)/共102頁(yè)第六十八頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。融合蛋白融合蛋白報(bào)告分子報(bào)告分子 將易于檢測(cè)的蛋白質(zhì)與目的分子融合表達(dá)，可顯示目標(biāo)分子的存在和定位，廣泛應(yīng)用于啟動(dòng)子分析、監(jiān)控轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)、細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥物的篩選 第69

39、頁(yè)/共102頁(yè)第六十九頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein, GFP) )是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。其內(nèi)源發(fā)光基團(tuán)在受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，可高效發(fā)射綠光，且無(wú)需底物和輔因子。GFP可作為一種“熒光標(biāo)簽”被用來(lái)研究目標(biāo)蛋白的定位及移動(dòng)情況。 第70頁(yè)/共102頁(yè)第七十頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。qGreen-GFPqblue-BFPqCyan-CFP qRed-RFPqYellow-YFP第71頁(yè)/共102頁(yè)第七十一頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。各色熒光蛋白對(duì)細(xì)菌的標(biāo)記 The d

40、iversity of genetic mutations is illustrated by this San Diego beach scene drawn with living bacteria expressing 8 different colors of fluorescent proteins. 2008年，科學(xué)家將多種色彩的熒光蛋白質(zhì)植入細(xì)菌的DNA分子結(jié)構(gòu)中。在細(xì)菌體內(nèi)植入熒光蛋白可以觀測(cè)這些細(xì)菌的生命機(jī)理是如何運(yùn)行的。第72頁(yè)/共102頁(yè)第七十二頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 腦內(nèi)連接 這張圖片出自杰夫利希曼(Jeff Lichtman)之手，展現(xiàn)了大腦內(nèi)的連接，圖

41、片中美麗的“彩虹”就是神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)。連線雜志網(wǎng)站曾于2007年刊登這張圖片。第73頁(yè)/共102頁(yè)第七十三頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。神經(jīng)干細(xì)胞 這張不太擁擠的圖像表明干細(xì)胞是如何在空間排列自己的。神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞核被染為了綠色，另一種細(xì)胞星細(xì)胞則表現(xiàn)為紅色。 第74頁(yè)/共102頁(yè)第七十四頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。熒光魚(yú) 在約克鎮(zhèn)科技公司將熒光魚(yú)引入市場(chǎng)后不久，熒光蛋白便迅速在商業(yè)上得到應(yīng)用。在美國(guó)，讀者可以在加利福尼亞以外的任何一個(gè)州購(gòu)買到熒光魚(yú)。(來(lái)源：新浪科技/孝文)第75頁(yè)/共102頁(yè)第七十五頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。GFP在腫瘤發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用GFP 是

42、一個(gè)分子量較小的蛋白,易與其他一些目的基因形成融合蛋白且不影響目的基因產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能。GFP 與目的基因融合,將目的基因標(biāo)記為綠色,即可定量分析目的基因的表達(dá)水平,顯示其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置和量的變化,為探討該基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制提供便利條件。第76頁(yè)/共102頁(yè)第七十六頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。熒光絨毛 2008年綠色熒光蛋白成為諾貝獎(jiǎng)的大贏家。這張圖片就是用諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)炮制的小腸絨毛圖片，小腸絨毛是凸出于小腸的細(xì)小手狀結(jié)構(gòu)，具有吸收食物營(yíng)養(yǎng)的功能。科學(xué)家將紅色熒光蛋白標(biāo)記導(dǎo)入小腸絨毛細(xì)胞中，展現(xiàn)出帶有熒光標(biāo)記的小腸絨毛。第77頁(yè)/共102頁(yè)第七十七頁(yè)，

43、編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。真皮成纖維細(xì)胞 成纖維細(xì)胞制造膠原蛋白，在體內(nèi)充當(dāng)腳手架的作用，支持其它細(xì)胞呆在適當(dāng)?shù)奈恢茫瑫r(shí)讓其它化學(xué)物質(zhì)“沐浴”這些細(xì)胞。 圖像中的這些細(xì)胞來(lái)自人體皮膚，被用于研究病毒是如何透過(guò)皮膚入侵人體的。 為幫助了解這些病毒殼在做什么，科學(xué)家讓它和綠色熒光蛋白結(jié)合，從而使它呈現(xiàn)為綠色。成纖維細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白被染為了紅色，DNA則為藍(lán)色。第78頁(yè)/共102頁(yè)第七十八頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 有機(jī)磷水解酶（Organophosphorus hydrolase, OPH）能夠降解許多種有機(jī)磷農(nóng)藥。將GFP基因與OPH基因的5端融合，構(gòu)建GFP-OPH融合基因，并

44、將其在大腸桿菌中表達(dá)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，綠色熒光直接可見(jiàn)，融合蛋白同時(shí)保持了OPH 和GFP的生物活性。此外，由于GFP的熒光強(qiáng)度與OPH活力成正比，還可通過(guò)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)對(duì)OPH進(jìn)行定量分析。 第79頁(yè)/共102頁(yè)第七十九頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 控制某一代謝途徑的相關(guān)基因, 緊密連鎖地排列在一起.Lac operon I p o Z Y Aoperon I:調(diào)控基因 P:啟動(dòng)子 O:操縱基因 第80頁(yè)/共102頁(yè)第八十頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。乳糖代謝的條件乳糖代謝的條件E. coli: “This is my favorite!”乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖第8

45、1頁(yè)/共102頁(yè)第八十一頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。如何利用乳糖如何利用乳糖E. coli: “I needlactose permease,-galactosidase, andtransacetylase.”第82頁(yè)/共102頁(yè)第八十二頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。何時(shí)利用乳糖何時(shí)利用乳糖E. coli: “I will use lactose only when there is no glucose and there is lactose.”Glucose + Lactose +Glucose Lactose Glucose Lactose +第83頁(yè)/共102頁(yè)第八十

46、三頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)The lac operon第84頁(yè)/共102頁(yè)第八十四頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。大腸桿菌乳糖操縱子 乳糖操縱子控制模型的主要內(nèi)容： Z、Y、A基因的產(chǎn)物由同一條多順?lè)醋拥膍RNA分子所編碼； 啟動(dòng)區(qū)P位于阻遏基因I與操縱區(qū)O之間； 操縱區(qū)是DNA上的一小段序列，是阻遏物結(jié)合的位點(diǎn)； 當(dāng)阻遏物與操縱區(qū)結(jié)合時(shí)，lac mRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制； 誘導(dǎo)物通過(guò)與阻遏物結(jié)合，改變其三維構(gòu)象，使之不能與操縱區(qū)結(jié)合，使lac mRNA能夠合成。第85頁(yè)/共102頁(yè)第八十五頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。第86頁(yè)/共102

47、頁(yè)第八十六頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。第87頁(yè)/共102頁(yè)第八十七頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。第88頁(yè)/共102頁(yè)第八十八頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。乳糖操縱子乳糖存在但是葡萄糖不存在的情況RepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeras

48、eRNAPol.RNAPol.Yipee!第89頁(yè)/共102頁(yè)第八十九頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。蛋白質(zhì)剪接 原理：由蛋白質(zhì)內(nèi)含肽所介導(dǎo)。是一個(gè)蛋白質(zhì)翻譯后的加工過(guò)程，它由一系列分子內(nèi)的剪切-連接反應(yīng)組成。 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽是一個(gè)蛋白質(zhì)前體中的多肽序列，可以催化自身從蛋白質(zhì)前體中斷裂，使兩側(cè)的蛋白質(zhì)外顯子連接成成熟的蛋白質(zhì)。 第90頁(yè)/共102頁(yè)第九十頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。 利用內(nèi)含肽載體致力生物合成利用內(nèi)含肽載體致力生物合成C-S酯酯鍵肽鏈或鍵肽鏈或N-半胱氨酸肽鏈半胱氨酸肽鏈 內(nèi)含肽介導(dǎo)的異源蛋白質(zhì)體外連接內(nèi)含肽介導(dǎo)的異源蛋白質(zhì)體外連接 用反式剪切技術(shù)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)體內(nèi)、體外用反式剪切技術(shù)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)體內(nèi)、體外連接連接 雙內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)自身環(huán)化及蛋白雙內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)自身環(huán)化及蛋白多聚體的生成多聚體的生成內(nèi)含肽的應(yīng)用intein 第91頁(yè)/共102頁(yè)第九十一頁(yè)，編輯于星期四：二十三點(diǎn) 三十分。自18世紀(jì)至今，在諸多研究者不斷進(jìn)取的努力下，胰島素的研究經(jīng)歷了五個(gè)階段：