種子種苗快繁

1、緒論（2學時）重點內(nèi)容：一、概念1、植物組織培養(yǎng)是指在無菌和人工控制的環(huán)境條件下，利用適當?shù)呐囵B(yǎng)基，對離體的植物器官、組織、細胞及原生質體進行培養(yǎng)，使其再生細胞或完整植株的技術，由于培養(yǎng)的植物材料已脫離了母體，又叫植物離體培養(yǎng)（plant culture in vitro）。2、無菌：是指使培養(yǎng)皿、器械、培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料等處于無真菌、細菌、病毒等微生物的狀態(tài)，以保證培養(yǎng)材料在培養(yǎng)皿中正常生長和發(fā)育。3、人工控制的環(huán)境條件：是指對光照、溫度、濕度、氣體等條件進行人工控制，以滿足植物培養(yǎng)材料在離體條件下的正常生長發(fā)育。4、外植體（explant）：由活植物體上切取下來用于組織培養(yǎng)的器官或組織叫外植

2、體。5、愈傷組織（callus），原是指植物在受傷之后表面形成的一團薄壁細胞，在組織培養(yǎng)中，則是在人工培養(yǎng)基上由外植體(explant)長出來的一團無序生長的薄壁細胞。愈傷組織培養(yǎng)所以是一種最常見的培養(yǎng)形式，是因為除莖尖分生組織培養(yǎng)和一部分器官培養(yǎng)以外，其他幾種培養(yǎng)形式最終也都要經(jīng)歷愈傷組織才能產(chǎn)生再生植株，此外，愈傷組織還常常是懸浮培養(yǎng)的細胞和原生質體的來源。二、植物組織培養(yǎng)的特點：植物組織培養(yǎng)的主要特點是采用微生物學的實驗手段來操作植物離體的器官、組織和細胞。這一特點具體表現(xiàn)在以下幾個方面：1、 組織培養(yǎng)的整個過程都是在無菌條件下進行的，外植體、培養(yǎng)基、接種環(huán)境都須經(jīng)過無菌處理。2、 組織

3、培養(yǎng)在多數(shù)情況下是利用成分完全確定的人工培養(yǎng)基進行的，除少數(shù)特殊情況（如進行營養(yǎng)缺陷型突變細胞的篩選）外，培養(yǎng)基中包括了植物生長所需的水分和一切大量元素、微量元素、有機物和植物激素（phytohormone）。培養(yǎng)基的PH和滲透壓也是認為設定的。因此，在組織培養(yǎng)中的植物材料不需依靠自身的光合作用制造養(yǎng)分，而是處于完全的異養(yǎng)狀態(tài)。3、 組織培養(yǎng)的起始材料可以是植物的器官、組織，也可以是單個的細胞，它們都處于離體狀態(tài)下。細胞全能性不僅表現(xiàn)在二倍體細胞水平，而且也表現(xiàn)在單倍體細胞（如小孢子）和三倍體（如胚乳）水平上，即使是去掉了細胞壁的細胞（原生質體），在組織培養(yǎng)條件下也能再生完整植株。4、 組織培

4、養(yǎng)通過連續(xù)繼代培養(yǎng)可以不斷增殖，形成克隆，或通過改變培養(yǎng)基成分，特別是其中的植物激素的種類和配比，而達到不同的實驗目的，如莖芽增殖或生根。5、 組織培養(yǎng)是在封閉的容器中進行的，容器內(nèi)氣體和環(huán)境氣體可通過瓶塞或其他封口材料進行交換。容器內(nèi)內(nèi)的濕度在通常情況下幾乎是100%，因此，組培苗葉表面一般都無角質層或蠟質層，且氣孔保衛(wèi)細胞功能缺乏，氣孔始終都是張開的。6、 組織培養(yǎng)的環(huán)境溫度、光照強度和時間等都是人為設定的，找出這些物理因素的最適參數(shù)對組織培養(yǎng)的成功也很重要。三、植物組織培養(yǎng)的應用與展望概括地說，組織培養(yǎng)系統(tǒng)在農(nóng)業(yè)上的應用有以下幾個方面：1、植物離體快繁2、病毒苗木培育3、培育新品種或創(chuàng)造

5、新物種4、次生代謝物生產(chǎn)5、植物種質資源的離體保存6、人工種子23第一章 實驗室的基本設備和一般技術本章重點內(nèi)容：滅菌技術、培養(yǎng)基一、滅菌技術常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類，即：物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不伺材料不同目的適當選用。1、器具的滅菌（1）干熱滅菌法利用鼓風干燥箱（烘箱）進行烘烤滅菌的方法。此法適用于各種玻璃器皿和器械的滅菌消毒。（2）高壓蒸汽滅菌法利用高壓

6、蒸汽滅菌的方法，是目前最常用的一種滅菌方法。此法適用于培養(yǎng)基、蒸餾水、各種器械、棉塞、包頭紙等的滅菌。2、培養(yǎng)基的滅菌菌種：污染的病原分為細菌和真菌兩大類。細菌污染的特點是菌斑呈粘液狀，而且在接種2-3天后即可發(fā)現(xiàn)。真菌污染的特點是在接種5-10天才能發(fā)現(xiàn)不同顏色的霉菌。發(fā)現(xiàn)污染的材料應及時處理。污染來源：培養(yǎng)基的污染有幾個可能的來源：培養(yǎng)容器；培養(yǎng)基本身；外植體；接種室的環(huán)境；在接種和繼代時用以操作植物材料的器械；培養(yǎng)室的環(huán)境。 滅菌方法：（1）高壓蒸汽滅菌法（2）過濾除菌法一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。3、外植體（

7、植物材料）滅菌 （1） 首先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當?shù)乃⒆拥人⑾?。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。（2）對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70酒精浸10-30s。（3）滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1-2種使用見表4-2。表4-2常用滅菌劑使用濃度及效果比較表（簡單了解）滅菌劑使用濃度持續(xù)時間 /min去除的難易效果次氯酸鈣90%10%530易很好次氯酸鈉2%530易很好氯化汞01%

8、1%58較難最好抗菌素450mg/L3060中較好 滅菌時，把瀝干的植物材料轉放到燒杯或其他器皿中，記好時間，倒入消毒溶液，不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅除氣泡，使消毒徹底。(4) 最后一步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-10次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。外植體選取流水沖洗70酒精表面消毒（2060s）無菌水沖洗消毒劑處理無菌水充分洗凈備用外植體消毒的步驟如下所示：二、培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無機鹽、有機化合物、天然復合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。1、水2、無機元素：包括大量

9、元素和微量元素3、有機化合物 常加入的有機成分主要有以下幾類：(1)碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖、葡萄糖和果糖。蔗糖使用濃度在23，常用3，即配制1L培養(yǎng)基稱取30g蔗糖，有時可用2.5，但在胚培養(yǎng)時采用415的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發(fā)育起重要作用。(2)維生素(3)肌醇(4)氨基酸 （5）植物激素l 生長素類：在組織培養(yǎng)中，生長素主要被用于誘導愈傷組織形成，誘導根的分化和促進細胞分裂、伸長生長。l 細胞分裂素類：在培養(yǎng)基中添加細胞分裂素有三個作用：誘導芽的分化促進側芽萌發(fā)生長，細胞分裂素與生長素相互作用，當組織內(nèi)細胞分裂素生長素的比值高時，誘導愈傷組織或器官分化出不定芽。促進細胞分裂與擴

10、大。抑制根的分化。因此，細胞分裂素多用于誘導不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時使用。生長素與細胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、是長根還是長芽。如為了促進芽器官的分化，應除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的比例。4、天然復合物5、培養(yǎng)材料的支持物（二）培養(yǎng)基的類型1、 含鹽量較大的培養(yǎng)基如MS培養(yǎng)基和改良的MS培養(yǎng)基。該類培養(yǎng)基有利于愈傷組織的誘導、生長和細胞培養(yǎng)，是應用范圍最廣和適應性最強的培養(yǎng)基。2、 硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基這類培養(yǎng)基鹽濃度也很高，尤其是硝酸鉀的含量較高，如B5、N6、SH。在禾谷類植物的花藥、花粉和原生質體培養(yǎng)中得到廣泛應用。

11、3、 含鹽量中等的培養(yǎng)基這類培養(yǎng)基中大量元素為MS的1/2，微量元素種類減少，但含量增加，維生素種類比MS多，如H培養(yǎng)基。4、 低鹽濃度的培養(yǎng)基這類培養(yǎng)基包括White培養(yǎng)基WS和HE培養(yǎng)基等，其中white培養(yǎng)基由于無機鹽的數(shù)量比較低，更適合木本植物的組織培養(yǎng)。第二章 植物組織培養(yǎng)的基本原理本章重點內(nèi)容：一、概念：植物細胞全能性是指植物的細胞具有發(fā)育為胚胎和植株的潛能，即植物細胞具有該植株全部遺傳可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。細胞分化是指導致細胞形成不同結構，引起功能改變或潛在的發(fā)育方式改變的過程。細胞脫分化：即失去分化細胞的典型特征，或消除了細胞分工，使之恢復到分生組

12、織狀態(tài)，或胚性細胞狀態(tài)，即細胞脫分化。 再分化：即脫分化后的分生細胞（愈傷組織）在特定的條件下（離體培養(yǎng)）下，重新恢復細胞分化能力，并經(jīng)歷器官發(fā)生形成單極性的芽或根，或經(jīng)歷胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，進一步發(fā)育成完整植物體，這一過程稱為再分化。二、離體培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生和植株再生愈傷組 織器官發(fā)生途徑再生植株先莖后根先根后莖分別根、莖，維管束連接植株植株植株體細胞胚胎途徑再生植株植株脫分化再分化外植體外植體形態(tài)發(fā)生形成完整植株的途徑三、愈傷組織（一）愈傷組織的特性在不同的實驗中由于目的的不同，對愈傷組織狀態(tài)的要求也不完全相同，但優(yōu)良的愈傷組織通常必須具備以下4個特性中23個特性：1、 高度的胚性或再

13、分化能力，以便從這些愈傷組織得到再生植株。2、 容易散碎，以便用這些愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系，并且在需要時能從中分離出全能性原生質體。3、 旺盛的自我增殖能力，以便用這些愈傷組織建立大規(guī)模的愈傷組 織無性系。4、 經(jīng)過長期繼代保存而不喪失胚性，以便有可能對它們進行各種遺傳操作。為了達到以上目的，我們在誘導愈傷組織時通常采取的策略是：1、選擇適當?shù)幕蛐秃瓦m當?shù)耐庵搀w。雖然幾乎所有高等植物的器官和組織都可能產(chǎn)生愈傷組織，但同一物種內(nèi)不同基因型在離體培養(yǎng)中的反應可能不同，同一植株不同部位的細胞在離體培養(yǎng)中的反應也可能不同。2、 選擇正確的培養(yǎng)基，特別是正確的植物激素的種類和濃度，以及在需要配合使用

14、生長素和細胞分裂素時，二者之間正確的配比。（二）愈傷組織的形成：在脫分化過程中，大多數(shù)情況下形成愈傷組織。愈傷組織的細胞結構往往是異質性的，無明顯極性，其形成過程可分為誘導期、細胞分裂期和形成期愈傷組織形成分裂期形成期誘導期改變原來的分化方向和代謝方向，合成代謝加強，合成大量蛋白質和核酸物質，為細胞的分裂和增殖奠定基礎。外植體外層細胞分裂，細胞脫分化，愈傷組織結構疏松，缺少組織結構，顏色淺而透明愈傷組織表層細胞分裂逐漸停止，轉向內(nèi)部的局部地區(qū)，并改變分裂面的方向，出現(xiàn)瘤狀結構外表，愈傷組織中可以發(fā)現(xiàn)維管組織，但不形成維管系統(tǒng)。愈傷組織的形成特點（三）愈傷組織的形態(tài)建成：外植體細胞在合適的培養(yǎng)條

15、件下發(fā)生脫分化，再分化產(chǎn)生芽和根或形成胚狀體，發(fā)育成苗或完整植株。1、形態(tài)建成的方式：愈傷組織形態(tài)建成方式體細胞胚胎途徑再生植株器官發(fā)生途徑再生植株芽發(fā)生后，芽的基部長根形成小植株先形成根，根上再出芽；愈傷組織的不同部位分別形成芽和根，然后形成維管組織把兩者結合起來形成一個植株。離體培養(yǎng)條件下，經(jīng)過愈傷組織再分化器官一般要經(jīng)過3個生長階段。第一階段是外植體經(jīng)過誘導形成愈傷組織。（愈傷組織的誘導，分裂，形成期）第二階段是“生長中心”形成。第三階段是器官原基及器官形成。二、影響愈傷組織誘導、增殖和形態(tài)建成的因素愈傷組織誘導、增殖及形態(tài)建成是一個連續(xù)的過程，主要受起始材料、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境等因素的調(diào)

16、控。含鹽量較大的培養(yǎng)基，如MS及其改良培養(yǎng)基（較高濃度的硝酸鹽、銨鹽、鉀鹽，較全的微量元素）以及LS、BL培養(yǎng)基基因型型愈傷組織誘導增殖和形態(tài)建成培養(yǎng)基類型培養(yǎng)環(huán)境起始材料料外植體種類，生理狀態(tài)物種硝酸鉀含量較高的B5、N6培養(yǎng)基含鹽量中等培養(yǎng)基，如H培養(yǎng)基，大量元素為MS的1/2，微量元素種類減少，但維生素種類比MS多低鹽濃度培養(yǎng)基，如WS和HE利于根的誘導圖 影響愈傷組織誘導、增殖和形態(tài)建成的因素1、起始材料（1）物種、基因型不同物種外植體誘導的愈傷組織器官分化明顯不同。同屬不同種，甚至同一物種不同基因型的愈傷組織器官分化的能力也不一樣?；蛐褪请x體培養(yǎng)過程中影響愈傷組織誘導、增殖和形態(tài)建

17、成的一個重要因素。（2）外植體類型與生理狀態(tài)以不同器官作為外植體誘導的愈傷組織，其器官發(fā)生能力因植物而異，有的植物差別不大，有的則明顯不同；外植體的生理年齡也影響愈傷組織器官發(fā)生的能力。2、培養(yǎng)環(huán)境（1）溫度：一般情況下愈傷組織誘導和增殖的最適溫度為（25±2）（2）光：光對愈傷組織的誘導和增殖及分化既有促進作用，又有抑制作用。光的作用反映在光照時間、方式、強度及波長上，一般光照強度為15002500 lx。3、培養(yǎng)基（1）生長調(diào)節(jié)物質培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)物質對愈傷組織誘導及增殖起重要的調(diào)節(jié)作用。在愈傷組織誘導、增殖和形態(tài)建成過程中，調(diào)控幅度最大的是植物生長調(diào)節(jié)物質，主要調(diào)節(jié)生長調(diào)節(jié)物質

18、的種類、濃度和比例，其中生長素和細胞激動素的濃度和配比對外植體愈傷組織的誘導、增殖和形態(tài)建成的調(diào)控起重要作用。Skoog和Miller提出“激素平衡”假說，即高濃度的生長素有利于根的形成，而抑制芽的形成，反之，高濃度的激動素促進芽的形成，而抑制根的形成。（2）抗生素物質研究把說明，某些抗生素對一些外植體愈傷組織的生長有促進或抑制作用。（3）有機成分在愈傷組織的誘導和繼代培養(yǎng)基中，一般加入一定量的有機成分以滿足愈傷組織生長和分化的要求，如糖、維生素類物質，氨基酸、肌醇、嘌呤和嘧啶類物質，以及酪蛋白質水解物及椰子汁等。糖的種類和濃度對組織培養(yǎng)物的增殖和器官分化均有明顯的影響。糖的濃度還可以改變愈傷

19、組織的鮮重和質地。（4）培養(yǎng)基的PH：一般培養(yǎng)基的PH為5.55.8。（5）活性炭等惰性物質活性炭有時會對愈傷組織的分化起到很好的作用。第三章 體細胞胚胎發(fā)生（4學時）本章重點內(nèi)容：一、概念體細胞胚胎：而植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常出現(xiàn)一種起源于體細胞的特殊結構，其發(fā)育過程也象受精卵一樣順序通過原胚期、球形期、魚雷期和子葉期各個階段。這種由愈傷組織的薄壁組織細胞不經(jīng)有性過程而直接產(chǎn)生類似胚的這一結構，我們稱之為胚狀體。人工種子：是指將細胞培養(yǎng)中形成的在形態(tài)上和生理上均與合子胚相似的體細胞胚（胚狀體）或不定芽包埋在能提供養(yǎng)分（人工胚乳）的膠囊里，再在膠囊外面包上一層具有保護功能和防止機械損傷的外膜（人工種

20、皮），造成一種類似天然種子的結構。二、植物體細胞胚胎發(fā)生的方式由外植體誘導體細胞胚胎發(fā)生的途徑有兩種，即直接途徑和間接途徑。直接途徑是指從外植體某些部位的胚性細胞直接誘導分化出體細胞胚胎。間接途徑有兩種情況：是指外植體先脫分化形成愈傷組織，再從愈傷組織的某些細胞分化出體細胞胚胎在大多數(shù)情況下，經(jīng)過愈傷組織的胚胎發(fā)生需要3個培養(yǎng)階段。第一階段是誘導外植體形成愈傷組織，第二階段是誘導愈傷組織胚性化，第三階段是體細胞胚形成。首先，誘導愈傷組織（較高濃度2,4-D的培養(yǎng)基）誘導愈傷胚性化（將上一步誘導出來的愈傷組織轉移到降低2，4-D濃度的培養(yǎng)基中，濃度為初期誘導愈傷組織濃度的1/2，在此培養(yǎng)基中可見

21、少數(shù)球形胚出現(xiàn)）胚胎發(fā)育培養(yǎng)（將胚性愈傷組織再轉入繼續(xù)降低生長素濃度的胚胎發(fā)育培養(yǎng)基中）體細胞胚大量產(chǎn)生。三、體細胞胚胎發(fā)生的特點植物體細胞胚胎建成和誘導器官發(fā)生相比具有明顯的特點特點體細胞胚胎發(fā)生途徑器官發(fā)生途徑極性在體細胞胚胎建成早期就具有胚根和胚芽兩極性存在，成苗率高單極性，生成不定根或不定芽。成活能力弱生理隔離一旦形成，與母體靠極少的維管組織聯(lián)系不定根和不定芽往往與愈傷組織的維管組織連接遺傳穩(wěn)定性單細胞起源，無變異，遺傳穩(wěn)定性好，再生植株與親本高度一致多細胞起源，變異多，遺傳不穩(wěn)定，再生植株需要與親本對照，進行選擇生長周期短，繁殖系數(shù)高長，繁殖系數(shù)低四、影響體細胞胚胎發(fā)生的因素（一）外

22、植體：外植體來源及生理狀態(tài)不同，其體細胞胚發(fā)生能力各異。（二）培養(yǎng)基1、外源激素與體細胞胚的發(fā)生（1）2,4-D與體細胞胚的發(fā)生2,4-D是誘導多種植物離體培養(yǎng)體細胞轉變?yōu)榕咝约毎闹匾に?。?）其他生長激素與體細胞胚的發(fā)生在濃度適宜時，ABA能抑制多種異常體細胞胚的發(fā)生，而且ABA加入培養(yǎng)基的時間越早其效應約明顯。2、多胺（腐胺、尸胺、亞精胺、高亞精胺、精胺等）和乙烯與體細胞胚發(fā)生3、糖類和金屬離子與體細胞胚發(fā)生1、糖的種類和濃度對誘導植物體體細胞胚發(fā)生有重要影響，體細胞胚的不同生長發(fā)育階段對糖濃度的要求也不同。2、金屬離子對體細胞胚發(fā)生也有影響。（三）培養(yǎng)環(huán)境光照影響植物體細胞胚的發(fā)生，

23、而且不同品種對光的作用反應各異。五、人工種子（一）人工種子的特點與天然種子比較，人工種子具有以下特點：1、可以用于固定優(yōu)良基因組合雜種優(yōu)勢，且穩(wěn)定快。2、由生物工程產(chǎn)生的轉基因植株和植物組織與細胞培養(yǎng)篩選獲得的突變體，通過體細胞胚發(fā)生制作人工種子，迅速擴大繁殖，不受季節(jié)限制，可以大批量生產(chǎn)，提供充足種源，成本低，發(fā)芽速度和生長速度比較一致，體積小，運輸方便，還可以直接播種和進行機械化操作等。3、在制作人工種子過程中，加入農(nóng)藥、菌肥、激素等可以提高農(nóng)作物抗病蟲害的能力，加速作物生長和發(fā)育。4、節(jié)約糧食5、保存和快速繁殖脫病毒苗（二）人工種子研制面臨的問題人工種子研制過程中涉及的問題較多，主要包括

24、1、要求高頻率誘導體細胞胚發(fā)生，而且數(shù)量多，質量高2、為使人工種子出苗整齊一致，必須使體細胞胚同步化3、人工種皮材料必須不損害體細胞胚，同時又有利于發(fā)芽和生長，并經(jīng)得起加工、貯藏和運輸。4、人工胚乳必須保證體細胞胚正常發(fā)育和提供充足營養(yǎng)，同時能防腐和防干5、能夠進行機械操作以便大量制種6、提高體細胞胚產(chǎn)生正常植株的轉換率。7、掌握胚狀體遺傳變異的抑制技術8、改進胚狀體的包囊材料和包埋方法。（三）人工種子的制備技術人工種子制備主要包括體細胞胚的誘導與同步化控制、人工種子的包埋、人工胚乳的制作、人工種皮的研制等內(nèi)容。第四章無病毒苗木培育（4學時）本章重點內(nèi)容：一、植物脫病毒的方法當前脫除植物病毒的

25、方法有4種：莖尖培養(yǎng)脫毒法；熱處理脫毒法；微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒法；珠心組織脫毒法。馬鈴薯莖尖培養(yǎng)脫毒法1、莖尖脫毒的程序同一品種個體之間在產(chǎn)量和病毒感染程度上有很大差異。在脫毒之前，對準備進行脫毒復壯的馬鈴薯品種或材料進行田間選株和塊莖選擇。田間選株要注意以下幾方面的問題：一是所選的植株必須符合品種的特征，包括株型、葉形、花色等生物學性狀及熟期等農(nóng)藝性狀。二是植株生長健壯，無明顯的病害癥狀，包括病毒病、真菌、細菌性病害。三是適時早收，挑選單株產(chǎn)量及大薯率高的單株。選作脫毒的塊莖應符合品種特征，包括皮色、肉色、薯形、芽眼等，無病斑、蟲蛀和機械創(chuàng)傷的大薯塊作脫毒材料。馬鈴薯莖尖脫毒程序見圖。發(fā)芽塊

26、莖芽長34mm檢測無PSTV病毒莖尖脫毒把塊莖上芽取下消毒剝莖尖接種于試管中培養(yǎng)莖尖發(fā)育成小植 株單節(jié)切段繁殖34個試管或兩個三角瓶單節(jié)切段繁殖34個三角瓶小植株直接或移栽后檢測無病毒的莖尖苗繁殖利用，莖尖脫毒成功有PSTV淘汰有病毒淘汰2、影響脫毒效果的因素從培養(yǎng)基、外植體、培養(yǎng)條件等三個方面。（1）外植體：品種差異 不同馬鈴薯品種（品系）的莖尖在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，其成苗率存在很大差。有的品種（品系）成苗快并且成苗率高，而有的品種很難獲得再生植株。剝離莖尖的大小 剝離莖尖的大小是影響脫毒率和成苗率的重要因素。離體莖尖愈大，愈易成活，但不易脫除病毒；莖尖愈小，脫毒率越高，但成苗較難。葉

27、原基是成苗的必要條件，不帶葉原基的分生組織，易形成愈傷組織后，分化成不定芽，易發(fā)生突變，失去原品種的性狀。因此，莖尖大小應以生長點所帶的葉原基數(shù)及其鄰近組織的大小為標準。一般以帶12個葉原基，且盡量少帶生長點的鄰近組織為好，這樣的莖尖既有一定的成苗率，也能脫除大多數(shù)病毒。攜帶病毒種類 病毒的種類不同，莖尖組織培養(yǎng)脫毒的難易程度有很大差別。（2）培養(yǎng)基 正確選擇培養(yǎng)基可以顯著提高獲得完整植株的成功率。在很多情況下，MS培養(yǎng)基對莖尖培養(yǎng)都是有效的。一般來說，含有少量（0.10.5mg/L）的生長素或細胞分裂或二者兼有常常是有利的。應避免使用2，4-D，因為它通常能誘導外植體形成愈傷組織，廣泛使用的

28、生長素是NAA和IAA。此外，在培養(yǎng)過程中一般馬鈴薯莖尖組織有幾種生長發(fā)育類型，應根據(jù)不同的類型，改變生長調(diào)節(jié)劑(主要是生長素)的濃度及處理時間。（3） 培養(yǎng)條件 在莖尖培養(yǎng)中，光下培養(yǎng)的效果通常比暗培養(yǎng)效果好，如馬鈴薯莖尖培養(yǎng)時，當莖已長到1cm高時光照強度便增加到4000Lx。第五章植物的離體繁殖（4學時）本章的重點內(nèi)容：一、離體快繁的程序利用組織培養(yǎng)技術對園林植物進行快速繁殖，其基本生產(chǎn)環(huán)節(jié)可用圖51流程圖表示。洗瓶、干燥培養(yǎng)基配制和滅菌馴化和移栽生根壯苗繼代增殖培養(yǎng)接種和初代培養(yǎng)母液配制 外植體選取和消毒1、初代培養(yǎng)：根據(jù)初代培養(yǎng)時發(fā)育的方向可分為：頂芽和腋芽的發(fā)育、不定芽的發(fā)育、體細

29、胞胚狀體的發(fā)生和原球莖。2、繼代培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)中擴繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。3、生根培養(yǎng) 當材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段。若不能及時將培養(yǎng)物轉到生根培養(yǎng)基上去，就會使久不轉移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費。根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程，這個過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。生根培養(yǎng)可采用12或者14MS培養(yǎng)基，全部去掉細胞分裂素，并加入適量的生長素(NAA、IBA等)。4、試管苗移栽馴化 通常采取的措施有：對外界要增加濕度、減弱光照；對試管內(nèi)要通透氣體、增施二氧化碳肥料、逐步降低空氣濕度等。（1）移栽用基質和

30、容器 適合于栽種試管苗的基質要具備透氣性、保濕性和一定的肥力，容易滅菌處理，并不利于雜菌滋生的特點，一般可選用珍珠巖、蛭石、砂子等。（2）移栽前的煉苗 移栽前可將培養(yǎng)物不開口移到自然光照下鍛煉2-3d，讓試管苗接受強光的照射，使其長得壯實起來，然后再開口練苗1-2d，經(jīng)受較低濕度的處理，以適應將來自然濕度的條件。（3）移栽和幼苗的管理 從試管中取出發(fā)根的小苗，用自來水洗掉根部粘著的培養(yǎng)基，要全部除去，以防殘留培養(yǎng)基滋生雜菌。保持小苗的水分供需平衡 防止菌類滋生一定的溫、光條件 適宜的生根溫度是18-20。溫度過低會使幼苗生長遲緩，或不易成活。溫度過高會使水分蒸發(fā)，從而使水分平衡受到破壞，并會促

31、使菌類滋生。 另外在光照管理的初期可用較弱的光照，如在小拱棚上加蓋遮陽網(wǎng)或報紙等，以防陽光灼傷小苗和增加水分的蒸發(fā)。當小植株有了新的生長時，逐漸加強光照，后期可直接利用自然光照。促進光合產(chǎn)物的積累，增強抗性，促其成活。保持基質適當?shù)耐庑?要選擇適當?shù)念w粒狀基質，保證良好的通氣作用。在管理過程中不要澆水過多，過多的水應迅速瀝除，以利根系呼吸。 綜上所述，試管苗在移栽的過程中，只要把水分平衡、適宜的介質、控制雜菌和適宜的光、溫條件控制好，試管苗是很容易移栽的。二、離體快繁中出現(xiàn)的問題和解決的途徑（一）初代培養(yǎng)外植體的褐變 外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時甚至會使整個培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。

32、它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質，它們多呈棕褐色，當擴散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。1、影響褐變的主要原因（1）植物品種 研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此，有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程中應該有所選擇，對不同的品種分別進行處理。 （2）生理狀態(tài) 由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌

33、類物質較多，因此褐變較為嚴重。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴重。 (3)培養(yǎng)基成分 濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。（4）培養(yǎng)條件不當 如果光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。 2、預防褐變的措施（1）選擇合適的外植體 最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。（2）合適的培養(yǎng)條件 無機鹽成分、植物生長物質水平、適宜溫度、及時繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。（3）使用

34、抗氧化劑 在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外使用0.1-0.5的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。（4）連續(xù)轉移 對容易褐變的材料可間隔12-24h的培養(yǎng)后，再轉移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-lOd后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。（二）繼代培養(yǎng)時材料的玻璃化 當植物材料不斷地進行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水跡狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。因為出現(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導生根，因此，使繁殖系數(shù)大為降低。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。當培養(yǎng)基上細胞分裂素水平較

35、高時，也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。 呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細胞持水力差，植株蒸騰作用強，無法進行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的，其具體解決的方法為：增加培養(yǎng)基中的溶質水平，以降低培養(yǎng)基的水勢；減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；增加光照；增加容器通風，最好進行C02施肥，這對減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；降低培養(yǎng)溫度，進行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；降低培養(yǎng)基中細胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。（三）污染污染是指在組培過程中，由于真菌和細菌等微生物的侵染，在培養(yǎng)容器中滋生大量菌斑，使培養(yǎng)材料不能正

36、常生長和發(fā)育的現(xiàn)象。（1）培養(yǎng)基及各種接種器皿滅菌不徹底（2）操作時人為帶（3）外植體滅菌不徹底（4）環(huán)境不清潔（5）超凈工作臺區(qū)域不清潔?？刂莆廴镜拇胧?）培養(yǎng)基及其用具滅菌要徹底，接種器具每次使用后應用酒精灼燒（2）操作人員嚴格遵守操作規(guī)程接種，接種時應用75%的酒精擦拭雙手和培養(yǎng)瓶表面，操作區(qū)內(nèi)不要放入過多待用培養(yǎng)瓶，防止氣流被擋?。?）接種室經(jīng)常滅菌（甲醛、酒精、紫外線燈）； （4）超凈工作臺定期清洗或更換空氣過濾器。（5）污染的外植體材料應及時淘汰，如果種源有限，對外植體材料可進行二次滅菌（四）遺傳穩(wěn)定性植物組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)中，細胞、組織和再生植株均會出現(xiàn)各種變異，且具普遍性，涉

37、及的植物性狀也相當廣泛1、 影響遺傳穩(wěn)定性的因素（1）基因型?；蛐筒煌?，發(fā)生變異的頻率也不同（2）繼代次數(shù)：試管苗繼代培養(yǎng)次數(shù)和時間是造成遺傳變異的關鍵因素，一般隨繼代次數(shù)和時間的增加，變異頻率呈上升趨勢。如香蕉繼代培養(yǎng)不能超過一年，繼代五次時，變異率為2.14%，繼代20次后變異為100%（3）器官發(fā)生方式。莖段、莖尖等形成的叢生芽、單芽、不定芽的方式繁殖，不易發(fā)生變異或變異率極低。2、降低遺傳變異的措施（1）選用不易發(fā)生遺傳變異的基因型材料（2）縮短繼代時間，限制繼代次數(shù)，繼代一定時間后，重新開始外植體的繼代培養(yǎng)（3）采用不易發(fā)生遺傳變異的增殖途徑（4）采用適當?shù)纳L調(diào)節(jié)物質和較低的濃度

38、，減少或不使用易引起誘變的物質，及時剔除生理和形態(tài)異常苗。第六章 植物胚胎培養(yǎng)及離體授粉本章重點內(nèi)容：一、概念(自己整理答案)1、胚胎培養(yǎng)2、胚培養(yǎng)3、胚乳培養(yǎng)4、胚珠培養(yǎng)5、子房培養(yǎng) 6、離體授粉二、胚的培養(yǎng)（一）胚培養(yǎng)的類型離體胚培養(yǎng)可分為幼胚培養(yǎng)和成熟胚培養(yǎng)。（二）胚培養(yǎng)的應用（三）幼胚培養(yǎng)方法1、材料的選擇與滅菌 取回大田或溫室里授粉受精后的子房，用70%的酒精進行幾秒表面消毒，再用0.1%氯化汞滅菌1030min，用無菌水沖洗34次，即可用于胚的分離和培養(yǎng)。2、幼胚的分離及培養(yǎng)（1）幼胚的分離 滅菌后的材料在無菌條件下切開子房壁，用鑷子取出胚珠，剝離珠被，取出完整的幼胚，并置培養(yǎng)基上

39、進行培養(yǎng)。（2）幼胚的培養(yǎng) 胚在發(fā)育的極早時期易發(fā)生夭折，幼胚很難培養(yǎng)成功。在這種情況下，利用胚乳看護培養(yǎng)，則可顯著提高幼胚的成活率。三、 胚珠培養(yǎng) 幼胚培養(yǎng)中，要取出心形期或更早期的胚進行培養(yǎng)，對培養(yǎng)技術的要求更高，分離也更困難，特別在蘭科植物中，即使已經(jīng)成熟的種子也非常小，操作起來就更困難，而分離胚珠則較容易。 （一）胚珠培養(yǎng)的意義 胚珠培養(yǎng)的意義為：利用胚珠培養(yǎng)技術，使雜種盡早培養(yǎng)，防止雜種早期敗育，獲得雜種植株；通過受精前胚珠培養(yǎng)以及未受精的胎座或子房培養(yǎng)，可以作為試管受精的基礎；未受精的胚珠培養(yǎng)能和花藥培養(yǎng)一樣，誘導出大孢子或卵細胞增殖，形成單倍體植株，用于單倍體育種。（二）胚珠培養(yǎng)

40、方法1、材料的選擇和滅菌 2、培養(yǎng)基對胚珠培養(yǎng)的影響 3、胎座和子房對胚珠培養(yǎng)的影響 4、胚發(fā)育時期的影響 四、子房培養(yǎng) 子房培養(yǎng)是指子房從母體上分離下來，置于培養(yǎng)基上，使其進一步發(fā)育成幼苗的技術。子房是雌蕊基部膨大的部分，由子房壁、胎座、胚珠組成。在進行胚珠培養(yǎng)時，常因為分離胚珠困難而改用子房培養(yǎng)，其培養(yǎng)的意義在于：使未受精胚囊中的單倍性細胞誘導發(fā)育成單倍體植株；獲得雜種植株為試管受精提供一項基礎技術。根據(jù)培養(yǎng)的子房是否授粉，可將子房培養(yǎng)分為授粉子房培養(yǎng)和未授粉子房培養(yǎng)。（一）培養(yǎng)方法1、子房外植體的制備 子房培養(yǎng)與相同胚齡胚培養(yǎng)比較，難度大大降低。2、子房培養(yǎng)的條件 用于子房培養(yǎng)的培養(yǎng)基有

41、MS、White、B5、N6、Nitsch等。3、培養(yǎng)子房的發(fā)育 由于子房存在兩種細胞，即性細胞和體細胞，它們都可產(chǎn)生胚狀體或愈傷組織，進一步發(fā)育成植株。因此，這些植株可以來源于性細胞，也可以來源于體細胞。（二）影響子房培養(yǎng)的因素 由于子房培養(yǎng)的目的不同，要求子房的發(fā)育途徑也不一樣，可以通過控制培養(yǎng)基及激素條件調(diào)節(jié)子房發(fā)育的方向。第七章 單倍體的產(chǎn)生（2學時）本章重點內(nèi)容：一、植物單倍體在植物遺傳育種中的應用1、利用單倍體植物控制雜種分離，加快常規(guī)育種速度2、排除顯隱性基因的干擾，提高育種的選擇效率3、遺傳分析的好材料二、離體小孢子的發(fā)育途徑1、A途徑 小孢子第一次有絲分裂為非均等分裂，形成營

42、養(yǎng)細胞和生殖細胞 （1）A-V途徑 由營養(yǎng)細胞重復分裂形成單倍體。 （2）A-G途徑 由生殖細胞重復分裂形成單倍體的胚狀體。 （3）A-VG途徑（E途徑） 由營養(yǎng)細胞和生殖細胞各自獨立分裂，形成兩類細胞群，各群的子細胞都類似其母細胞。 （4）C途徑 營養(yǎng)細胞和生殖細胞通過核融合，形成多倍體植株。2、B途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個細胞。然后由這兩細胞邊續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株三、花粉植株形態(tài)發(fā)生方式 1、胚狀體發(fā)育途徑：小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。2、愈傷組織發(fā)育途徑：小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。四、花

43、藥培養(yǎng)（一）取材花藥在接種以前，應預先用醋酸洋紅壓片法進行鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時期，并找出花粉發(fā)育時期與花蕾或幼穗的大小、顏色等外部特征之間的對應關系。一般而言，單核后期花藥對培養(yǎng)反應較好。（二）預處理適當?shù)念A處理可以顯著提高花藥的愈傷組織誘導率。常用的預處理方法是低溫冷藏，具體的處理溫度和時間長度因物種而異。（三）消毒花藥適宜培養(yǎng)時，花蕾尚未開放，花藥在花被或穎片的嚴密包被之中，本身處于無菌狀態(tài)，因此，通常只要以70%酒精噴灑或擦拭花器或包被著麥穗的葉鞘表面，即可達到滅菌要求。（四）接種 在無菌條件下把雄蕊上的花藥輕輕地從花絲上摘下，水平地放在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，在操作過程中不要使花藥受到損

44、傷，若受損傷，則應淘汰，因為損傷常常回刺激花藥壁形成二倍體愈傷組織。（五）、培養(yǎng)方式 花藥培養(yǎng)的方式主要有3種：1、在瓊脂固化培養(yǎng)基表面培養(yǎng)。2、在加入30% Ficoll 的液體培養(yǎng)基表面漂浮培養(yǎng)。3、利用固體-液體雙層培養(yǎng)基培養(yǎng)，以便既能保持較高的接種密度，培養(yǎng)基又不易失水趕涸。（六）花粉植株的誘導（七）壯苗和移栽五、花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)需將花粉從花藥中分離出來，以單個花粉粒作為外植體進行離體培養(yǎng)。所以與花藥培養(yǎng)相比，花粉培養(yǎng)必須進行花粉的分離與純化。（一）花粉分離與純化的方法將小孢子從花藥里游離出來的主要方法有自然散落法、擠壓法和機械游離法。（二）花粉培養(yǎng)方式1、平板培養(yǎng)2、液體培養(yǎng)（懸浮培養(yǎng)）3、雙層培養(yǎng)4、微室