紫錐菊中菊苣酸提取純化工藝研究

1、紫錐菊提取物中菊苣酸的提取純化研究菊苣酸是紫錐菊提取物中極為重要的免疫活性成分之一，具有增強(qiáng)人體免疫力和抗炎作用?，F(xiàn)有的高純度菊苣酸制備工藝對(duì)生產(chǎn)設(shè)備要求高、不易放大，且目前只能生產(chǎn)對(duì)照品，這在很大程度上限制了紫錐菊提取菊苣酸生產(chǎn)的高效率、低成本化發(fā)展。因此，西安源森生物實(shí)驗(yàn)室將紫錐菊中提取純化菊苣酸成分的工藝作為本次實(shí)驗(yàn)主題進(jìn)行研究：一、源森生物紫錐菊提取菊苣酸準(zhǔn)備儀器與材料高效液相色譜儀；L7420紫外檢測(cè)器；RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；DZ2BC型真空干燥箱；紫錐菊根自然干燥粉碎；菊苣酸對(duì)照品；純度94%;AB-8樹(shù)脂。二、源森生物紫錐菊提取純化菊苣酸的方法與結(jié)果（一）HPLC法測(cè)定紫錐菊提取

2、物中菊苣酸的含量1. 色譜條件：色譜柱:A lltima C18(250 mm×4. 6mm, 5m)；流動(dòng)相:乙腈-1. 8%冰醋酸(2575)；體積流量: 1. 0mL /m in；檢測(cè)波長(zhǎng): 327 nm；柱溫: 35；進(jìn)樣量: 5L。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取菊苣酸對(duì)照品5. 05mg置10mL量瓶中用70%乙醇溶解并加至刻度精密吸取對(duì)照品溶液0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0L注入液相色譜儀中測(cè)定峰面積。 以菊苣酸質(zhì)量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，得方程:Y= 401 209X+ 23 809，r= 0. 999 5，線性范圍:0. 2

3、53. 03g。3. 供試品溶液的制備：精密稱取各提取物、純化物、萃取物樣品適量置10mL量瓶中用70%乙醇溶解超聲提取10 m in加70%乙醇至刻度過(guò)0. 45m濾膜，即得。4. 測(cè)定：采用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定。（二）紫錐菊植物中提取菊苣酸1. 提取溶劑的選擇：從紫錐菊植物中提取菊苣酸一般采取乙醇、甲醇或它們的水溶液。考慮到試劑價(jià)格和工業(yè)化生產(chǎn)的可行性，西安源森生物本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為提取溶劑。分別稱取20g紫錐菊根7份，以10倍質(zhì)量的0、20%、40%、55%、70%、85%、100%乙醇水溶液在80加熱回流提取2h所得濾液蒸干得紫錐菊提取物，采用HPLC測(cè)定紫錐菊提取物中菊苣酸的含量，并計(jì)算菊

4、苣酸的得率。結(jié)果見(jiàn)圖1：由以上圖1可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，紫錐菊提取物匯總菊苣酸的得率逐漸升高，當(dāng)乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，菊苣酸的得率達(dá)最大。隨后，紫錐菊提取菊苣酸的得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低。這是因?yàn)樽襄F菊根中含有多酚氧化酶，乙醇能使多酚氧化酶失活，當(dāng)直接用水提取時(shí)，菊苣酸在幾分鐘之內(nèi)迅速被氧化，所以用水提菊苣酸得率較低；而乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加可阻止紫錐菊提取物中菊苣酸被氧化，但乙醇的體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，紫錐菊藥材組織內(nèi)的菊苣酸在乙醇溶液中的溶解度降低，導(dǎo)致菊苣酸不能被提取出來(lái)。2. 菊苣酸提取條件的優(yōu)化：在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度(A)、溶劑用量(B)、提取時(shí)間(C)、提

5、取次數(shù)(D)為因素，各取3個(gè)水平，以菊苣酸得率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)選，結(jié)果見(jiàn)表1、2：由此可見(jiàn)，紫錐菊提取菊苣酸的最佳組合條件為A3B3C2D3：即溫度為90、溶劑用量為15倍、提取3次、每次2 h。按照正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)提取條件，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，紫錐菊提取物中菊苣酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4. 1%，菊苣酸提取得率為1. 12%。（三）紫錐菊提取物的樹(shù)脂法純化：紫錐菊提取液濃縮至原來(lái)的1/10回收乙醇作為大孔吸附樹(shù)脂的工作液。通過(guò)對(duì)AB-8、S-8、H103、NKA-9、X-5、D4020、D3520、NKA-2、D4006大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AB-8樹(shù)脂對(duì)菊苣酸的飽和吸附

6、容量最高，達(dá)56.36mg/g濕樹(shù)脂。在解吸試驗(yàn)中，AB-8樹(shù)脂吸附飽和后，依次用水及10%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集各部分洗脫液。HPLC分析結(jié)果表明，水及10%乙醇洗脫液中沒(méi)有菊苣酸洗脫下來(lái)， 30%、50%乙醇洗脫液中含有菊苣酸，而70%、90%乙醇溶液中不含菊苣酸。故樹(shù)脂吸附飽和后，先用水洗脫至無(wú)色，再用50%乙醇洗脫，即可得菊苣酸粗品。在靜態(tài)吸附研究的基礎(chǔ)上，上AB-8樹(shù)脂玻璃柱(自制，15 cm×2 cm，樹(shù)脂床體積為30mL)進(jìn)行動(dòng)態(tài)穿透試驗(yàn)。上柱液中菊苣酸質(zhì)量濃度為3. 30mg /mL，以2BV/h連續(xù)上柱，自動(dòng)部分收集流出液，采用HPL

7、C法測(cè)定菊苣酸含量，得到AB-8樹(shù)脂泄漏曲線，見(jiàn)圖2：可見(jiàn)30mL AB-8樹(shù)脂可處理6BV(180mL)的物料液量而基本不發(fā)生泄漏。此時(shí)樹(shù)脂床共吸附菊苣酸594mg (6×30×3. 30)，濕態(tài)AB-8樹(shù)脂對(duì)菊苣酸的工作吸附量(泄漏前吸附量)可達(dá)19. 8mg /mL，達(dá)到飽和時(shí)可處理14BV (420mL)，飽和吸附量可達(dá)46. 2mg /mL。取120mL含菊苣酸3. 0mg /mL水溶液上裝柱體積為30mL的AB-8樹(shù)脂柱上柱完成后用去離子水把樹(shù)脂柱洗至無(wú)色后用50%乙醇溶液洗脫自動(dòng)部分收集器收集洗脫液采用HPLC法測(cè)定菊苣酸含量得到AB-8樹(shù)脂的解吸曲線(圖3)

8、：可見(jiàn)用50%乙醇溶液洗脫,當(dāng)洗脫液體積達(dá)到150mL時(shí)，即為床體積的5倍時(shí)，基本上能把吸附的菊苣酸洗脫完全。洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，得到1. 43 g黃色粉末，HPLC測(cè)定純度為24. 22%，洗脫率為96. 21%。（四）醋酸乙酯的萃取純化：取AB-8樹(shù)脂處理得到的粉末溶于10倍體積水中用6mol/LHCl調(diào)節(jié)至pH 3水溶液分別用醋酸乙酯、正丁醇、異戊醇進(jìn)行萃取醋酸乙酯萃取液直接減壓濃縮。正丁醇、異戊醇因沸點(diǎn)較高，回收有一定的困難，因而萃取液先用5% NaOH調(diào)節(jié)至pH 6. 5后加水反萃分取水層減壓濃縮得粉末。結(jié)果所得產(chǎn)品中菊苣酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為69. 28%、32. 52%、46.

9、30%，因此醋酸乙酯萃取效果最好，得到的產(chǎn)品純度最高，選用醋酸乙酯進(jìn)行萃取。溶液的pH值對(duì)醋酸乙酯萃取的影響的結(jié)果見(jiàn)表3。pH為23時(shí)，紫錐菊提取中的菊苣酸萃取效果較好，萃取率高，產(chǎn)品純度高。這是由于當(dāng)pH3時(shí)，菊苣酸由原來(lái)的菊苣酸鹽變?yōu)橛坞x態(tài)，從而改變了菊苣酸在水相和有機(jī)相中的分配率，因此用醋酸乙酯能很好地把它從水相中萃取出來(lái)。而當(dāng)溶液的pH 3時(shí)，用等體積的醋酸乙酯分別萃取14次，紫錐菊提取中菊苣酸的萃取率分別為41. 40%、63. 43%、80. 51%、96. 83%。即醋酸乙酯萃取4次可以基本萃取完全。（五）紫錐菊提取菊苣酸產(chǎn)品的檢測(cè)：經(jīng)40%乙醇提取、AB-8樹(shù)脂吸附、50%乙醇洗脫、醋酸乙酯萃取最終得到產(chǎn)品為淺黃色粉末，純度達(dá)69%以上。三、西安源森生物實(shí)驗(yàn)室紫錐菊提取純化菊苣酸實(shí)驗(yàn)結(jié)論 由以上實(shí)驗(yàn)可以得出紫錐菊提取物中菊苣酸成分的提取純化最佳工藝為：取一定量的紫錐菊根粉末用15倍的40%乙醇溶液于90下加熱回流提取3次每次為2h合并濾液濃縮至原液體積的1/10回收乙醇濾過(guò)得到的水溶液以2BV /h的流速上柱床體積(BV)為30mL的AB-8樹(shù)脂柱吸附完成后用去離子水洗至流出液無(wú)色再用50%乙醇溶液洗脫乙醇洗脫液濃縮蒸干可得到菊苣酸粗品。粗品溶于水用6mol/L鹽酸調(diào)pH3,醋酸乙酯萃取4次萃取液濃縮蒸干即得產(chǎn)品。因此利用乙醇水溶液提取、AB-8樹(shù)脂吸附、醋