基于氧化鐵納米材料特性的生物分離和生物檢測資料

1、基于氧化鐵納米材料特性的生物分離和生物檢測作者：杜崇磊杜偉 汪冰 豐偉悅 王卓 趙宇亮 【摘要】 氧化鐵納米粒子是一種新型的磁功能材料，被廣泛應用于生物、材料以及環(huán)境等眾多領域。本文介紹了超順磁氧化鐵納米粒子的制備方法，比較了各種方法的優(yōu)缺點；評述了磁性氧化鐵納米粒子在細胞、蛋白質和核酸分離及生物檢測中的應用，對多功能復合磁性氧化鐵納米粒子的構建， 在生物醫(yī)學領域中的應用具有的指導意義。 【關鍵詞】 超順磁性氧化鐵納米粒子； 制備； 生物分離； 生物檢測； 評述Abstract Superparamagnetic iron oxide nanomaterials have been widel

2、y used in the biotechnology, materials and environmental chemistry, etc. In this review, the synthesis methods of superparamagnetic iron oxide, the merits and defects of these methods, and their application in cell, protein, nucleic acid separation and bioassay were reviewed.Keywords Superparamagnet

3、ic iron oxide nanoparticles; Synthesis; Bioseparation； ioassay; Review1 引 言磁性納米粒子是近年來發(fā)展起來的一種新型材料，因其具有獨特的磁學特性，如超順磁性和高矯頑力，在生物分離和檢測領域展現了廣闊的應用前景1。同時，因磁性氧化鐵納米粒子具有小尺寸效應、良好的磁導向性、生物相容性、生物降解性和活性功能基團等特點2， 在核磁共振成像、靶向藥物、酶的固定、免疫測定等生物醫(yī)學領域表現出潛在的應用前景。但由于其較高的比表面積，強烈的聚集傾向，所以通常對其表面進行修飾，降低粒子的表面，能得到分散性好、多功能的磁性納米粒子。對磁性納米

4、粒子的表面進行特定修飾，如果在修飾后的粒子上引入靶向劑、藥物分子、抗體、熒光素等多種生物分子，可以改善其分散穩(wěn)定性和生物相容性， 以實現特定的生物醫(yī)學應用。此外，適當的表面修飾或表面功能化還可以調節(jié)磁性納米粒子表面的反應活性，從而使其應用在細胞分離、蛋白質純化、核酸分離和生物檢測等領域。本文介紹了磁性氧化鐵納米粒子的制備方法， 比較了各種制備方法的優(yōu)缺點，并對其在生物分離及檢測中應用的最新進展進行了評述。2 磁性氧化鐵納米粒子的合成方法磁性納米粒子的制備是其應用的基礎。目前已發(fā)展了多種合成和制備方法，如共沉淀法、水熱合成法、溶膠凝膠法和微乳液法等，上述方法均可制備高分散、粒度分布均勻的納米粒子

5、，并能方便地對其表面進行化學修飾，這些方法的優(yōu)點和缺點見表1。在這些合成方法當中，共沉淀法是水相合成氧化鐵納米粒子最常用的方法。該方法制備的磁性納米顆粒具有粒徑小，分散均勻，高度生物相容性等優(yōu)點，但制得的顆粒存在形狀不規(guī)則，結晶差等缺點。通過在反應體系中加入檸檬酸，可得到形狀規(guī)則、分散性好的納米粒子。利用這種方法合成的磁性納米材料被廣泛應用在生物化學及生物醫(yī)學等領域9。微乳液法制備納米粒子，產物均勻、單分散，可長期保持穩(wěn)定，通過控制膠束、結構、極性等，可望從分子規(guī)模來控制粒子的大小、結構、特異性等。微乳液合成的磁性納米粒子僅溶于有機溶劑，其應用受到限制。通常需要在磁性納米粒子的表面修飾上親水分

6、子，使其溶于水，從而能應用于生物、醫(yī)學等領域。熱分解法是有機相合成氧化鐵納米粒子最多也是最穩(wěn)定的方法。利用熱分解法制備的納米Fe3O4顆粒產物具有好的單分散性，且呈疏水性，可以長期穩(wěn)定地分散于非極性有機溶劑中。該方法合成的氧化鐵納米粒子雖然具有粒徑均一的特點，但必須在其表面偶聯(lián)親水性及生物相容性好的生物分子或制備成核殼結構，才可用于生物醫(yī)學領域。表1 磁性氧化鐵納米粒子的制備方法（略）此外，綠色化學和生物方法合成氧化鐵納米粒子也備受關注28,29。磁性氧化鐵納米粒子除具有的表面效應、小尺寸效應、量子效應、宏觀量子隧道效應等納米粒子基本特性外，它同時還具有超順磁特性、類酶催化特性和生物相容性等特

7、殊性質，因此在醫(yī)學和生物技術領域中的應用引起了人們的廣泛興趣。 3 磁性氧化鐵納米材料在生物分離與生物檢測的應用3.1 磁性氧化鐵納米材料在生物分離的應用磁性氧化鐵納米粒子可以通過外界磁場來控制納米粒子的磁性能，從而達到分離的目的，如細胞分離30，31、蛋白分離32 和核酸分離33等。此外磁性氧化鐵納米粒子由于兼有納米、磁學和類酶催化活性等性能，不僅能夠實現被檢測物的分離和富集，而且能夠使檢測信號放大，在生物分析領域也都具有很好的應用前景34，35。磁性納米粒子（MNP）能夠應用于這些領域主要基于它的表面化學修飾，包括非聚合物有機固定、聚合物有機固定、無機分子固定及靶向配體修飾等36（圖1）。

8、納米粒子表面功能化修飾是目前研究的熱點。3.1.1 磁性氧化鐵納米材料在細胞分離方面的應用 細胞分離技術的目的是快速獲得所需目標細胞。傳統(tǒng)細胞分離技術主要根據細胞的大小、形態(tài)以及密度的差異進行分離，如采用微濾、超濾以及超離心等方法。這些方法操作簡單，但是特異性差，而且存在純度不高、制備量偏小、影響細胞活性等缺點，因此未能被廣泛地用于細胞的純化研究37。近年來，隨著對磁性納米粒子研究的深入，人們開始利用磁性納米粒子來分離細胞38,39。如磁性氧化鐵納米粒子在其表面接上具有生物活性的吸附劑或配體（如抗體、熒光物質、外源凝結素等），利用它們與目標細胞的特異性結合，在外加磁場的作用下將細胞分離、分類以

9、及對其種類、數量分布進行研究。張春明等40運用化學連接方法將單克隆抗體CD133連接到SiO2/Fe3O4復合粒子的表面得到免疫磁性Fe3O4納米粒子，利用它分離出單核細胞和CD133細胞。經培養(yǎng)后可以看出，分離出來的CD133細胞與單核細胞一樣，具有很好的活性，能夠正常增殖形成集落，并且在整個分離過程中對細胞的形態(tài)以及活性沒有明顯的毒副作用，這與Kuhara等30報道的采用磁分離技術分離CD19+和CD20+細胞的結果一致。Chatterjee等39采用外源凝結素分別修飾聚苯乙烯包被的磁性Fe3O4微球和白蛋白磁性微球，利用凝結素與紅細胞良好的結合能力，快速、高效的分離了紅細胞。此外，磁性粒

10、子在分離癌細胞和正常細胞方面的動物實驗也已獲得成功。3.1.2 磁性氧化鐵納米材料在蛋白質和核酸分離中的應用 利用傳統(tǒng)的生物學技術（如溶劑萃取技術等）來分離蛋白質和核酸程序非常繁雜，而磁分離技術是分離蛋白、核酸及其他生物分子便捷而有效的方法。目前在外磁場作用下，超順磁性氧化鐵納米粒子已廣泛應用于蛋白質和核酸的分離。Liu等41利用聚乙烯醇等表面活性劑存在下制備出共聚磁性高分子微球，表面用乙二胺修飾后用于分離鼠腹水抗體，得到很好的分離效果。Xu等42在磁性氧化鐵納米粒子表面偶聯(lián)多巴胺分子，用于多種蛋白質的分離純化。多巴胺分子具有二齒烯二醇配體，它可以與氧化鐵納米粒子表面配位不飽和的Fe原子配位，

11、形成納米顆粒多巴胺復合物，此復合物可以進一步偶聯(lián)次氨基三乙酸分子（NTA），NTA分子可特異螯合Ni，對于具有6×His標簽的蛋白質的分離純化方面表現出很高的專一性。Liu等43用硅烷偶聯(lián)劑（AEAPS）對核殼結構的SiO2/Fe2O3復合粒子的表面進行處理，研究復合磁性粒子對牛血清白蛋白（BSA）的吸附情況，結果表明BSA與磁性復合粒子之間是通過化學鍵作用被吸附的，復合粒子對BSA的最大吸附量達86 mg/g，顯示出在白蛋白的分離和固定上有很大的應用潛力。Herdt等44利用羧基修飾的吸附/解離速度快的核殼型（Fe3O4/PAA）磁性納米顆粒與Cu2+亞氨基二乙酸（IDA）共價交聯(lián)

12、，通過Cu2+與組氨酸較強的親和能力實現了組氨酸標記蛋白的選擇性分離，分離過程如圖2所示。磁性納米粒子也是核酸分子分離的理想載體4。DNA/mRNA含有單一堿基錯位，它們的富集和分離在人類疾病診斷學、基因表達研究方面有著至關重要的作用。Zhao等4合成了一種磁性納米基因捕獲器，用于富集、分離、檢測痕量的DNA/mRNA分子。這種材料以磁性納米粒子為核，包覆一層具有生物相容性的SiO2保護層，表面再偶聯(lián)抗生素蛋白維生素H分子作為DNA分子的探針，可以將1015 mol/L DNA/mRNA有效地富集，并能實時監(jiān)控產物。Tayor等4用硅酸鈉水解法、正硅酸乙酯水解法制備SiO2/Fe2O3磁性納米

13、粒子并對DNA進行了分離。結果表明，SiO2功能化的Fe2O3磁性納米粒子對DNA的吸附分離效果明顯好于單獨Fe2O3磁性納米粒子的分離效果，但是其吸附機理有待進一步研究。3.2 磁性氧化鐵納米材料在生物檢測中的應用3.2.1 基于磁學性能的生物檢測磁性氧化鐵納米粒子因其特有的磁導向性、小尺寸效應及其偶聯(lián)基團的活性，兼有分離和富集地作用，使其在生物檢測領域有廣泛的應用。當檢測目標為低含量的蛋白分子時，不能通過聚合酶鏈反應（PCR）對其信號進行放大，而磁微球與有機染料或量子點熒光微球結合可以對某些特異性蛋白、細胞因子、抗原和核酸等進行多元化檢測，實現信號放大的作用。Yang等4采用一對分子探針分

14、別連接熒光光學條碼（彩色）和磁珠（棕色），對DNA（頂端鑲板）和蛋白質（底截鑲板）生物分子進行目標分析（圖3）。如果目標DNA序列或蛋白存在，它將與兩個磁珠結合一起，形成了一個三明治結構，經過磁選，光學條碼可以在單磁珠識別目標水平下，通過分光光度計或是在流式細胞儀讀出。通過此方法檢測目標分子是基于數百萬個熒光基團組成的微米尺寸光學條碼信號的擴增而檢測出來，其基因和蛋白的檢出限可達到amol/L量級，甚至更低。Nam等利用多孔微粒法（每個微?？商畛浯罅織l形碼DNA）和金納米微粒為基礎的比色法生物條形碼檢測技術檢測了人白細胞介素2（IL2），檢出限可達到30 amol/L，比普通的酶聯(lián)免疫分析技術

15、的靈敏度高3個數量級。Oh等 利用熒光為基礎的生物條形碼放大方法檢測了前列腺特異性抗原（PSA）的水平，其檢出限也低于300 amol/L，而且實現了快速檢測。在免疫檢測中，磁性納米粒子作為抗體的固相載體，粒子上的抗體與特性抗原結合，形成抗原抗體復合物，在磁力作用下，使特異性抗原與其它物質分離，克服了放免和酶聯(lián)免疫測定方法的缺點。這種分離具有靈敏度高、檢測速度快、特異性高、重復性好等優(yōu)點。Yang等5通過反相微乳液法制備了粒徑很小的SiO2包覆的Fe3O4磁性納米粒子，生物分子通過誘導這些高單分散的磁性納米粒子可用于酶的固定和免疫檢測。Lange等5采用直接或三明治固相免疫法（生物素基化抗Ig

16、G抗體和共軛連接鏈霉素的磁性納米粒子組成三明治結構）和超導量子干涉法（SQUID），研究它們在確定抗原、抗體相互作用免疫檢測中的應用，結果表明特異性鍵合的磁性納米顆粒的馳豫信號大小依賴于抗原（人免疫球蛋白G，IgG）的用量，這種磁弛豫(Magnetic relaxation)免疫檢測方法得到的結果與廣泛使用的ELISA方法的結果相當。因磁性納米粒子獨特的性能，在生物傳感器上也有潛在的應用前景。Fan等在磁珠上偶聯(lián)被檢測物的一級抗體，在金納米顆粒上連接二級抗體，兩者反應后，利用HClNaClBr2將Au氧化為Au3+，催化發(fā)光胺（Luminol）化學發(fā)光，人免疫球蛋白G（IgG）的檢出限可達2

17、× 1010 mol/L ，實現了磁性納米顆?；瘜W發(fā)光免疫結合的方法對IgG進行生物傳感分析（圖4）。3.2.2 類酶催化特性在生物檢測中的應用 Cao等5發(fā)現Fe3O4磁性納米粒子能夠催化H2O2氧化3,3',5,5'四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、3,3'二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）和鄰苯二胺（OPD），使其發(fā)生顯色反應，具有類辣根過氧化物酶（HRP）活性（圖5），而且其催化活性比相同濃度的辣根過氧化物酶高40倍。并且Fe3O4磁性納米粒子可以運用磁分離手段進行重復性利用，顯著降低了生物檢測的實驗成本，利用此特性可進行多種生物分子的檢測。利用葡萄糖氧化酶（GOx

18、）與Fe3O4磁性納米粒子催化葡萄糖的反應(見式（1）和(2)，通過比色法檢測葡萄糖，其檢測的靈敏度達到5×105 1×103 mol/L 。由于Fe3O4磁性納米粒子制備簡單、穩(wěn)定性好、活性高，成本低，因而比普通酶更有競爭優(yōu)勢，這也為葡萄糖的檢測提供了高靈敏度和選擇性的分析方法，在生物傳感領域的應用上展現了巨大的潛能，為糖尿病人疾病的診斷提供了快速、靈敏的檢測方法。然而要提高檢測靈敏度，合成催化效率高的Fe3O4磁性納米粒子及多功能磁性納米粒子是關鍵。Peng等5用電化學方法比較了不同尺寸Fe3O4納米粒子的催化活性發(fā)現，隨著尺寸的變小，磁性納米粒子的催化活性變高。Wan

19、g等5制備的單分散啞鈴型PtFe3O4納米粒子，由于本身尺寸和結構特點，可更大限度地提高催化活性。本研究組已經合成了分散性好和磁性高的氧化鐵納米粒子并對其進行了表征，利用其磁學和催化特性，已開展了葡萄糖等生物分子的檢測，該方法的檢出限達到1 mol/L，具有靈敏度高、操作簡便和成本低等優(yōu)點5。總之，Fe3O4磁性氧化鐵納米粒子不但具有顯著的超順磁性，而且具有類辣根過氧化物酶催化特性，可通過使用過氧化物敏感染料，設計了一系列（如乙肝病毒表面抗原等）的免疫檢測模型59，因此超順磁性納米粒子在生物分離和免疫檢測領域具有廣闊的應用前景。4 結 語隨著納米技術的迅速發(fā)展，磁性氧化鐵納米粒子的開發(fā)及其在生

20、物醫(yī)學、生物分析、生物檢測等領域的潛在應用已經越來越受到重視，但同時也面臨很多挑戰(zhàn)和問題。（1）構建并制備尺寸小、粒徑均一、分散性和生物相容性好及催化性能高的多功能磁性納米粒子；（2）根據被檢測生物分子的特點設計多功能磁性氧化鐵納米粒子，實現高靈敏度、特異性檢測；（3）利用納米氧化鐵顆粒作為分子探針進行實時、在線、原位、活體和細胞內生物分子的檢測。這些問題不僅是納米材料在生物分子檢測領域應用需要解決的難點，也是目前其進行生物分子檢測研究的熱點和重點?！緟⒖嘉墨I】1 Perez J M, Simeone F J, Saeki, Y, Josephson L, Weissleder R. J. A

21、m. Chem. Soc., 2003, 125(34): 10192101932 Kim G J, O'Regan R M, Nie S M. 2005 27th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, 2005，17：7147163 JunTao(劉軍濤), LIU RuPing(劉儒平), WANG MiXia(王蜜霞), LIU ChunXiu(劉春秀), LUO JinPing(羅金平), CAI XinXia(蔡新霞). Chinese

22、J. Anal. Chem.(分析化學), ， 37(7): 9859884 Lang C, Schuler D, Faivre D. Macromol. Biosci., 2007, 7(2): 1441515 Silva G A. Surg. Neurol., 2007, 67(2)：1131166 Corot C, Robert P, Idee J M, Port M. Adv. Drug Delivery. Rev., 2006, 58(14): 147115047 Kohler N, Sun C, Wang J, Zhang M Q. Langmuir., 2005, 21(19),

23、 885888648 LI BaoYu(李寶玉). Biomedical Nanomaterials(納米生物醫(yī)藥材料). Beijing（北京）: Chemical Industry Press(化學工業(yè)出版社), 2004: 1419 Tartaj P, Morales M P, GonzalezCarreno T, VeintemillasVerdaguer S, Serna C J. J. Magn. Magn. Mater., 2005, 290: 283410 ZHANG Xin(張 鑫), LI XinGang(李鑫鋼), JIANG Bin(姜 斌). Chinese Chem

24、. Industry. Eng.(化學工業(yè)與工程), 2006, 23(1): 454811 Wu J H, Ko S P, Liu H L, Jung M H, Lee J H, Ju J S, Kim Y K. Colloids Surf. A, 2008, 313: 26827212 CHENG HaiBin(程海斌), LIU GuiZhen(劉桂珍), LI LiChun(李立春), GUAN JianGuo(官建國), Yuan RunZhang（袁潤章）. J. Wuhan University of Technology(武漢理工大學學報), 2003, 25(5): 4613

25、 QIU XingPing(邱星屏). J. Xiamen University: Natural Science(廈門大學學報：自然科學版), 1999, 38(5): 71171514 Mao B D, Kang Z H, Wang E B, Lian S Y, Gao L, Tian C G, Wang C L. Mater. Res. Bull., 2006, 41(12): 2226223115 Fan R, Chen X H, Gui Z, Liu L, Chen Z Y. Mater. Res. Bull., 2001, 36(34): 49750216 Wang H W, Li

26、n H C, Yeh Y C, Kuo C H. J. Magn. Magn. Mater., 2007, 310(2): 2425242717 Harris L A, Goff J D, Carmichael A Y, Riffle J S, Harburn J J, St Pierre T G, Saunders M. Chem. Mater., 2003, 15(6):1367137718 SONG LiXian(宋麗賢), LU ZhongYuan(盧忠遠), LIAO QiLong(廖其龍). J. Funct. Mater.(功能材料), 2005, 36(11): 1762176

27、819 Itoh H, Sugimoto T. J. Colloid. Interface. Sci., 2003, 265(2): 28329520 Xu J, Yang H B, Fu W Y, Du K, Sui Y M, Chen J J, Zeng Y, Li M H, Zou G. J. Magn. Magn. Mater., 2007, 309(2): 30731121 Li Z, Wei L, Gao M Y, Lei H. Adv. Mater., 2005, 17(8): 1130111305 22 Sun S H, Zeng H. J. Am. Chem. Soc., 2

28、002, 124(28): 8204820523 Bang J H, Suslick K S. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(8): 224224 Vijayakumar R, Koltypin Y, Felner I, Gedanken A. Mater. Sci. Eng. A, 2000, 286(1): 10110525 Pinkas J, Reichlova V, Zboril R, Moravec Z, Bezdicka P, Matejkova J. Ultrason. Sonochem, 2008, 15(3): 25726426 Khollam Y

29、B, Dhage S R, Potdar H S, Deshpande S B, Bakare P P, Kulkarni S D, Date S K. Mater. Lett., 2002, 56(4): 57157727 HAI YanBing(海巖冰), YUAN HongYan(袁紅雁), XIAO Dan(肖 丹) Chinese Chem. Res. Appl.(化學研究與應用), 2006, 18(6): 74474628 Jun Y W, Huh Y. M, Choi J S, Lee J H, Song H T, Kim S, Yoon, S, Kim K S, Shin J

30、 S, Suh J S, Cheon J. J. Am. Chem. Soc., 2005, 127(16), 5732573329 Bharde A A, Parikh R Y, Baidakova M, Jouen S, Hannoyer B, Enoki T, Prasad B L V, Shouche Y S, Ogale S, Sastry M. Langmuir, 2008, 24(11): 5787579430 Kuhara M, Takeyama H, Tanaka T, Matsunaga T. Anal. Chem., 2004, 76(21): 6207621331 Y,

31、 G. Biofuctionalization of Nanamaterials. WileyVCH: Weinheim 200532 Safarik I M S. Biomagn. Res. Technol., 2004, 2(1): 733 Yoza B, Arakaki A, Maruyama K, Takeyama H, Matsunaga T. J. Biosci. Bioeng., 2003, 95(1): 212634 Tanaka T, Matsunaga T. Anal. Chem., 2000, 72(15): 3518352235 Matsunag T, Nakayama

32、 H, Okochi M, Takeyama H. Biotechnol. Bioeng., 2001, 73(5): 40040536 Sun C, Lee J S H, Zhang M Q. Adv. Drug. Delivery. Rev., 2008, 60(11): 1252126537 GAN ZhiFeng(甘志鋒), JIANG JiSen(姜繼森) ProGREss in Chemistry(化學進展), 2005, 17(6): 97898638 WEI YanChao(魏衍超), YANG LianSheng(楊連生). Chinese J. Magn. Mater. D

33、ev.(磁性材料及器件), 1999, 30(6): 182139 Chatterjee J, Haik Y, Chen C J. J. Magn. Magn. Mater., 2001, 225(12): 212940 ZHANG ChunMing(張春明), ZHAO GengMing(趙梗明), SIQING SuDu(斯慶蘇都), XIE XiangHua(謝湘華), TAN Ling(譚 玲), DONG YaMing(董亞明). J. Shanghai Normal University(上海師范大學學報), 2008, 37(3): 29129541 Liu X Q, Guan

34、Y P, Yang Y, Ma Z Y, Wu X B, Liu H Z. J. Appl. Polym. Sci., 2004, 94(5): 2205221142 Xu C J, Xu K M, Gu H W, Zheng R K, Liu H, Zhang X X, Guo Z H, Xu B. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126(32): 9938993943 Liu X Q, Ma Z Y, Xing J M, Liu H Z. J. Magn. Magn. Mater., 2004, 270(12): 1644 Herdt A R, Kim B S, Taton T A. Bioconjug. Chem., 2007, 18(1): 18318945 Gu H W, Xu K M, Xu C J, Xu B. Chem. Commun, 2006, 9: 94194946 Zhao X J, TapecDytioco R, Wang K M, Tan W H. Anal. Chem., 2