測量不確定度評估報(bào)告-2015417氯霉素

1、測量不確定度評定報(bào)告DCWD-CX5.4-04-011、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖褂肎B/T20756-2006方法對樣品進(jìn)行前處理，使用液質(zhì)聯(lián)用儀測定樣品溶液中氯霉素類的含量，從而定量樣品中氯霉素的殘留量。對測定的不確定度進(jìn)行分析，找出影響其不確定度的因素，對不確定度進(jìn)行評估，如實(shí)反映測量的置信度和準(zhǔn)確性。2、 材料與方法2.1 儀器與試劑液質(zhì)聯(lián)用儀：設(shè)備編號H067，型號Agilent1260-6460A離心機(jī)：設(shè)備編號H109，型號L-550，最大轉(zhuǎn)速4000r/min電子天平：設(shè)備編號H102，型號AL204，最小分度值0.0001g震蕩器：設(shè)備編號H047，型號HY-4移液器：50l、200l、1

2、000l移液管：10mL試劑：乙酸乙酯（色譜純）、氨水（優(yōu)級純）、超純水、正己烷（色譜純）2.2方法依據(jù)和步驟GB/T20756-2006 可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法提取稱取 5g（±0.05g）試樣，置于 50ml 離心管中；加入 15ml 乙酸乙酯，0.45ml 氫氧化銨，5g 無水硫酸鈉，均質(zhì)提取 30s，以 3500rpm 離心 5min；吸取上清液于 250ml 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中；在殘?jiān)屑尤?15ml 乙酸乙酯，0.45ml 氫氧化銨，用先前的均質(zhì)刀頭均質(zhì)提取 30s，以 3500rpm 離心5min；吸取上清液合

3、并于 250ml 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中；再重復(fù)上述操作 2 次（共 4 次），合并全部全部上清至 250ml 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中；40旋轉(zhuǎn)濃縮至干。凈化旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中的殘?jiān)?5ml 水溶解，含有不溶物時(shí)，超聲 5min；加入 5ml 正己烷，于漩渦混合器混合 30s；靜置（或離心）分層，棄掉上層的正己烷；再加入 5ml 正己烷漩渦混合 30s ，靜置（或離心）分層，棄掉上層；移取水層約 3ml 于 5ml 離心管中，以 13000rpm 離心 5min；0.20µ m 針頭過濾器過濾后，供 LC/MS/MS 測定，外標(biāo)法定量，檢測結(jié)果使用回收率進(jìn)行校正。3 計(jì)算公式和數(shù)學(xué)模型食品中氯霉素的含量按下

4、述公式計(jì)算w= （1）w 樣品中氯霉素的含量，g/kg；Cs 樣品最終測定的濃度，g/kg；V 旋轉(zhuǎn)濃縮至干后溶解用水的體積；m 稱取試料的質(zhì)量， g；x 由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣液中氯霉素和內(nèi)標(biāo)D-5氯霉素的濃度比；cIS 樣液中內(nèi)標(biāo)的濃度，ng/mL；y 氯霉素和內(nèi)標(biāo)的峰面積之比；a 斜率；b 截距；內(nèi)標(biāo)工作液的濃度，ng/mL；V 加入樣品中內(nèi)標(biāo)工作液的體積，mL 4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和各分量靈敏系數(shù)根據(jù)式（1），樣品中氯霉素含量測定的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式（2）計(jì)算：u(w)=c2(y)u2(y)+c2(a)u2(a)+ c2(b)u2(b)+ c2()u2()+c2(V)u2(V)+ c2(m

5、)u2(m)1/2 (2)各分量靈敏度系數(shù)按式（3）計(jì)算：c（y）=； c（a）=-； c（b）= -；c（）=；c（V）=；c（m）= -； （3）5、標(biāo)準(zhǔn)不確定度評估5.1氯霉素和內(nèi)標(biāo)峰面積之比的不確定度u(y)樣液中氯霉素和內(nèi)標(biāo)峰面積之比通過實(shí)驗(yàn)可以直接讀取，與線性回歸無關(guān)，其不確定度主要來源于實(shí)驗(yàn)過程中方法精密度、人員操作、試劑、污染因子和損失因子等所導(dǎo)致的峰面積之比的變動(dòng)性。由此可見，不確定度u（y）以A類評定為主，B類為輔，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法測定n個(gè)平行樣品，得到n個(gè)儀器響應(yīng)值ym,i(i=1,2, n)。對n次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)運(yùn)算，其標(biāo)準(zhǔn)偏差s(y)作為不確定度u(y)，包含了以上

6、變動(dòng)性所導(dǎo)致的不確定度。u(y)=s(y)= （4）式中：實(shí)驗(yàn)中，測定了6個(gè)平行樣品，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果見表1。表1 平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果s(y)0.1；0.1；0.11；0.11；0.11；0.110.1；0.1；0.1；0.10.1011.79×10-3將表1數(shù)據(jù)代入式（4），計(jì)算得：u(y)= 1.79×10-35.2斜率a及截距b的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(a)、u(b) 上述的數(shù)學(xué)模型是在假設(shè)回歸方程為y=ax+b前提下建立。斜率和截距的不確定度主要包括由每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的不確定度和實(shí)驗(yàn)點(diǎn)相對最佳擬合直線的分散性所引起的不確定度。對于每一個(gè)xi(i=1,2,N)平行測定j次得到

7、yi,j(j=1,2,M),回歸方程的斜率、截距可近似按如下計(jì)算6：首先由回歸方程得到的yi=axi+b與相應(yīng)yi,j之差按貝賽爾公式求出其標(biāo)準(zhǔn)差s（yi）S(yi) = （5）式中：- 儀器上所得被測物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比；- 對應(yīng)xi的回歸方程計(jì)算值；N 測量點(diǎn)數(shù)M 測量點(diǎn)重復(fù)次數(shù)。由式（6）、（7）得到a、b的不確定度：u(a) = s(y) （6）u(b) = s(y)式中： 配制氯霉素濃度為0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度為0.1ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定氯霉素與內(nèi)標(biāo)峰面積之比y，擬合方程為Y=0.080928*X+0.019944（R2=0.999

8、88）,所得數(shù)據(jù)和計(jì)算結(jié)果如表2所示。表2 線性回歸測定結(jié)果及擬合方程計(jì)算結(jié)果xiyij由擬合方程計(jì)算所得yi0.20.038 0.036 0.0350.0360.0360.50.06 0.068 0.060.0620.06010.102 0.097 0.0990.0990.10150.422 0.433 0.4190.4250.425100.837 0.820 0.8230.8270.829201.653 1.629 1.6361.641.638由式（6）（7）計(jì)算得到：u(a)=0.0004；u（b）=0.0024。5.3 內(nèi)標(biāo)工作液濃度的不確定度u()由于內(nèi)標(biāo)是100ug/mL濃度的D-

9、5氯霉素儲備液，因此內(nèi)標(biāo)工作液的不確定度由兩部分構(gòu)成：一部分來自內(nèi)標(biāo)定值引入的不確定度；另一部分是由內(nèi)標(biāo)儲備液配制工作液引入的不確定度。（1）內(nèi)標(biāo)定值引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur,Is證書給定的定值最大允差±1.0%，按照均勻分布，ur,Is=1.0%/=0.577%。（2）配制內(nèi)標(biāo)工作液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur,Is（f）內(nèi)標(biāo)工作液按如下步驟配制：移取1.0mL內(nèi)標(biāo)儲備液，定容至50mL，配成2.0ug/mL內(nèi)標(biāo)中間液；移取0.25mL2.0ug/mL標(biāo)準(zhǔn)液，定容至50mL，配成10ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，稀釋因子f1、f2分別為50和200。由1mL移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u

10、r(1.0) 體積的不確定分量ur,1（1.0）：A級1.0mL分度吸量管示值允差±0.008mL，按均勻分布，ur,1(1.0)=0.008/(1.0×)=0.462%。充滿液體至刻度的變動(dòng)性引入的不確定度分量ur,2(1.0):移取1.0mL溶液6次，稱量，得6個(gè)質(zhì)量數(shù)據(jù)，忽略稱量的微小誤差，得ur,2(1.0)=0.125%。由容量瓶校準(zhǔn)溫度與使用溫度差別引入的不確定度分量ur,3(1.0):20時(shí)水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/溫差為±3，按均勻分布，則ur,3(1.0)=3×2.1×10-4/=0.036%。以上不確定度分量

11、不相關(guān)，則：ur(1.0)=0.480%。由50mL容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(50)50mLA級單標(biāo)線容量瓶的最大容量允差為±0.05mL，按均勻分布，計(jì)算方法同，得ur(50)=由0.5mL移液管引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(0.5)0.5mL A級分度吸液管的最大允差為±0.005mL，按均勻分布，計(jì)算方法同，得ur(0.5)=由以上數(shù)據(jù)得：5.4 加入樣品中內(nèi)標(biāo)工作液體積V的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V)樣品中加入內(nèi)標(biāo)工作液的體積V為0.10mL，0.5mL移液管的最大允差為±0.005mL，計(jì)算方法同5.3（2）中，按均勻分布，得u(V)=0.0013mL。5

12、.5 樣品質(zhì)量m的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)樣品質(zhì)量m的標(biāo)準(zhǔn)不確定度包含兩個(gè)分量：天平定值引入的不確定度u(m1)以及重復(fù)稱樣誤差引入的不確定度u(m2)。根據(jù)天平的擴(kuò)展不確定度U=0.01,取k=2，則u(m1)=0.01/2=0.005g。同時(shí)，用砝碼在天平上稱量9次，極差R為0.01g，查表得到C=2.97，用極差法計(jì)算u(m2):u(m2)=因此，u(m)0.005g6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度6.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(w)實(shí)驗(yàn)測得樣品中氯霉素和內(nèi)標(biāo)峰面積之比ym為7.49。由此根據(jù)式（1），得到樣品中氯霉素含量W為6.61ug/kg；同時(shí)根據(jù)式（3），得到各不確定度分量的靈敏系數(shù)如表3所示。表3 各標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量及其靈敏系數(shù)量量值標(biāo)準(zhǔn)不確定度靈敏系數(shù)不確定度分量/ug.kg-1y0.111.79×10-32.4714.42×10-3a0.0809280.00042.7511.1×10-3b0.0199440.0024-2.4715.93×10-310ng/mL0.1442 ng/mL0.02233.22×10-3V0.100mL0.0013 mL