微生物生理生化實(shí)驗(yàn)

1、 山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 2014年 12月 5 日姓名 班級(jí) 13級(jí)生命基地班 學(xué)號(hào) 同組者： 科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 微生物生理生化實(shí)驗(yàn) 組別 3【實(shí)驗(yàn)題目】 微生物生理生化實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 了解生理生化的意義。2. 掌握幾種常用生理生化的實(shí)驗(yàn)方法?！緦?shí)驗(yàn)器材】1、 菌種： 枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，銅綠假單胞菌，變形桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌2、試劑：  盧戈氏碘液、乙醚、吲哚試劑、甲基紅試劑、蒸餾水等3、 儀器和用具：  酒精燈、接種針、培養(yǎng)皿、試管、試管架、燒杯、量筒、德漢氏小管 等4、 培養(yǎng)基 淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基（大分子物質(zhì)水解實(shí)驗(yàn)） 葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（

2、內(nèi)附倒置的德漢氏小管）（糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)） 蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚實(shí)驗(yàn)） 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（甲基紅培養(yǎng)基）【實(shí)驗(yàn)原理】 在所有生活細(xì)胞中存在的全部生物化學(xué)反應(yīng)稱之為代謝，代謝過程主要是酶促反應(yīng)過程。具有酶功能的蛋白質(zhì)多數(shù)在細(xì)胞內(nèi)，稱為胞內(nèi)酶。許多細(xì)菌產(chǎn)生胞外酶，這些酶從細(xì)胞中釋放出來，以促進(jìn)細(xì)胞外的化學(xué)反應(yīng)。各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)出很大的差異，如表現(xiàn)在對(duì)大分子糖類和蛋白質(zhì)的分解能力以及分解代謝的最終產(chǎn)物的不同，反映出他們具有不同的酶系和不同的生理特性，這些特性可被用作為細(xì)菌鑒定和分類的內(nèi)容。具體實(shí)驗(yàn)原理如下：1、 大分子物質(zhì)的水解實(shí)驗(yàn)原理1、淀粉水解 由于微生物對(duì)淀粉這種大分子物質(zhì)不能直接利用

3、，所以必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要為水解酶,通過加水裂解大的物質(zhì)為較小的化合物,使其能被運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)。如淀粉酶將淀粉水解為小分子的糊精,雙糖和單糖，能分泌胞外淀粉酶的微生物，則能利用其周圍的淀粉。已知淀粉遇到碘會(huì)顯現(xiàn)藍(lán)色，因此可通過在淀粉培養(yǎng)基上滴加碘液來判斷微生物是否能產(chǎn)生淀粉酶分解淀粉，菌落周圍不呈藍(lán)色，出現(xiàn)無色透明圈，則該菌種能夠水解淀粉。2、油脂水解 脂肪酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸，而產(chǎn)生的脂肪酸可改變培養(yǎng)基的PH,因此在油脂培養(yǎng)基上接種細(xì)菌，培養(yǎng)一段時(shí)間后可通過觀察菌苔的顏色判斷菌種是否能夠水解油脂，若出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，則說明這種菌可產(chǎn)生分解油脂的

4、酶。2、 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)原理 糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng),在腸道細(xì)菌的鑒定上尤為重要.絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源,但是它們?cè)诜纸馓穷愇镔|(zhì)的能力上有很大的差異.有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機(jī)酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和氣體(如氫氣,甲烷,二氧化碳等);有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣.例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。產(chǎn)酸后再加入溴甲酚指示劑后會(huì)使溶液呈黃色，且德漢氏小管中會(huì)收集到一部分氣體。若細(xì)菌不能使糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則最后溶液為指示劑的紫色，且德漢氏小管中無氣體。A 培養(yǎng)前的情況B 培養(yǎng)后 產(chǎn)酸不產(chǎn)氣C 培養(yǎng)后 產(chǎn)酸產(chǎn)氣 圖1：糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)3、 IMViC實(shí)驗(yàn)1、 吲哚實(shí)驗(yàn) 用來檢測(cè)

5、吲哚的產(chǎn)生，在蛋白胨培養(yǎng)基中，若細(xì)菌能產(chǎn)生色氨酸酶，則可將蛋白胨中的色氨酸分解為丙酮酸和吲哚，吲哚與對(duì)二甲基氨基苯甲醛反應(yīng)生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，所以吲哚實(shí)驗(yàn)可以作為一個(gè)生物化學(xué)檢測(cè)的指標(biāo)。大腸桿菌吲哚反應(yīng)陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。2、 甲基紅實(shí)驗(yàn) 某些細(xì)菌在糖代謝過程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者進(jìn)而被分解產(chǎn)生甲酸、乙酸和乳酸等多種有機(jī)酸，使培養(yǎng)基的PH值降低，加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，即甲基紅反應(yīng)。盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸，但是這個(gè)實(shí)驗(yàn)在區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌上還是有價(jià)值的。這兩種細(xì)菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有

6、機(jī)酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)的后期仍能維持酸性（PH4),而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機(jī)酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇，丙酮酸等，使PH升至6左右。因此，大腸桿菌為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟】1、淀粉水解實(shí)驗(yàn)  （1）倒平板：按照淀粉培養(yǎng)基配方配制固體淀粉培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50左右， 在酒精燈火焰旁倒平板，每組兩個(gè)平板。  （2）標(biāo)記：用記號(hào)筆在平板底部劃成四部分，標(biāo)好要進(jìn)行接種的菌的編號(hào)，以免混淆。 （3）接種：在無菌操作臺(tái)上，將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌分別在 標(biāo)記好的區(qū)域內(nèi)點(diǎn)種，如圖1所示，注意僅用接種針接觸極少面積的培養(yǎng)

7、基，避 免因接種菌量過多而造成假陽性。  （4）培養(yǎng)：將平板倒置，在28溫箱中培養(yǎng)兩天。  （5）觀察：取出培養(yǎng)基，觀察各種細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，打開平板蓋子，滴入適量盧戈氏碘液于 平板中，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板，觀察培養(yǎng)皿中菌落周圍是否 有無色透明圈產(chǎn)生，若有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已經(jīng)被水解，該種菌為陽性， 反之則為陰性。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2、油脂水解試驗(yàn)（1）倒平板：按照油脂培養(yǎng)基配方配制固體油脂培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50左右， 充分振蕩，使油脂均勻分布，在酒精燈火焰旁倒平板，每組兩個(gè)平板。  （2）標(biāo)記：用記號(hào)筆在在

8、平板底部劃成四部分，并標(biāo)好需要接種的菌的編號(hào)。（3）接種：在無菌操作臺(tái)上將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌分別劃十 字線接種于平板相對(duì)應(yīng)部分的中心，如圖2所示。  （4）培養(yǎng)：將平板倒置，在28溫箱中培養(yǎng)兩天。 （5）觀察：取出平板，觀察菌苔顏色，如果出現(xiàn)紅斑點(diǎn)，說明脂肪水解，為陽性反應(yīng)。記錄 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3. 葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn) （1） 培養(yǎng)基的配制：按照糖發(fā)酵培養(yǎng)基配置葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至試管中，先將德漢氏 小管中注滿培養(yǎng)基，再把德漢氏小管倒置放入試管中，注意不要讓德漢氏小管中進(jìn)入空 氣，每組3只試管，滅菌。 （2） 接種：待培

9、養(yǎng)基冷卻至常溫時(shí)，在無菌操作臺(tái)上，取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管2支分別接 入大腸桿菌和普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣 泡，第3支不接種，作為對(duì)照組。在各試管外壁上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上分別標(biāo)明發(fā)酵 培養(yǎng)基的名稱和所接種的細(xì)菌菌名。  （3） 培養(yǎng)：把接種后的試管在試管架上放好，將其放入培養(yǎng)箱中于28下培養(yǎng)兩天。 （4）觀察：觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4. 乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（1） 培養(yǎng)基的配制：按照糖發(fā)酵培養(yǎng)基配置乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至試管中，用膠頭滴管往 德漢氏小管中注滿培養(yǎng)基，再把德漢氏小管倒置放入試管中，注意不要讓

10、德漢氏小管中 進(jìn)入空氣，每組五只試管，滅菌。 （2） 接種：待培養(yǎng)基冷卻至常溫時(shí)，在無菌操作臺(tái)上，取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管2支分別接入 大腸桿菌和普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣泡。在 試管外壁上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱和所接種的細(xì)菌菌名。  （3） 培養(yǎng)：把接種后的試管在試管架上放好，將其放入培養(yǎng)箱中于28下培養(yǎng)兩天。 （4） 觀察：觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5. 吲哚實(shí)驗(yàn)（1） 培養(yǎng)基的配制：按照蛋白胨水培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝至試管中，每組3只，高壓 滅菌鍋滅菌 （2） 接種

11、：待培養(yǎng)基冷卻后，在無菌操作臺(tái)上將大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌分別接入2支蛋白胨 水培養(yǎng)基，剩余一只試管不接種，作為空白對(duì)照，貼好標(biāo)簽。 （3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上放好，將其放入培養(yǎng)箱中于28下培養(yǎng)兩天。 （4）觀察：往培養(yǎng)后的蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)加入3-4滴乙醚，搖動(dòng)數(shù)次，靜置1min，待乙醚上升后，沿試管避徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽性反應(yīng)。觀察加入試劑后試管內(nèi)的顏色反應(yīng)并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。6. 甲基紅實(shí)驗(yàn)（1） 培養(yǎng)基的配制：按照葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝至試管中，每組3只 試管 ，高壓滅菌鍋滅菌。（2） 接種：待培養(yǎng)

12、基冷卻后，在無菌操作臺(tái)上將大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌分別接入2支葡萄糖 蛋白胨水培養(yǎng)基，剩余一只試管不接種，作為空白對(duì)照，貼好標(biāo)簽。 （3） 培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28下培養(yǎng) 兩天。 （4） 觀察：培養(yǎng)兩天后后，將每支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)物內(nèi)加入2滴甲基紅試劑，培 養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽性，變?yōu)辄S色者為陰性。觀察試管內(nèi)的顏色變化，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】 表1.淀粉水解試驗(yàn)結(jié)果(“+”表示陽性，“”表示陰性)菌種陰/陽性結(jié)論大腸桿菌-不可以水解淀粉枯草芽孢桿菌+可以水解淀粉普通變形桿菌-不可以水解淀粉銅綠假單胞菌-不可以水解淀粉 表2

13、. 油脂水解試驗(yàn)結(jié)果(“+”表示陽性，“”表示陰性)菌種陰/陽性結(jié)論大腸桿菌-不可以水解油脂枯草芽孢桿菌-不可以水解油脂普通變形桿菌-不可以水解油脂銅綠假單胞菌+可以水解油脂 表3. 葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌普通變形桿菌空白顏色黃色黃色紫色是否產(chǎn)氣是是否陰/陽性+-結(jié)論大腸桿菌能分解葡萄糖，同時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣普通變形桿菌能分解葡萄糖，同時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣對(duì)照組 表4. 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌普通變形桿菌空白顏色黃色紫色紫色是否產(chǎn)氣是否否陰/陽性+-結(jié)論大腸桿菌能分解乳糖，同時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣普通變形桿菌不能分解

14、乳糖對(duì)照組 表5.吲哚試驗(yàn)結(jié)果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌是否產(chǎn)生紅色環(huán)狀物是否陰/陽性+-結(jié)論大腸桿菌可以分解色氨酸生成吲哚產(chǎn)氣腸桿菌不能分解色氨酸生成吲哚 表6. 甲基紅試驗(yàn)結(jié)果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌顏色變紅變黃陰/陽性+-結(jié)論大腸桿菌在培養(yǎng)期仍維持酸性PH產(chǎn)氣腸桿菌將有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為非酸性末端產(chǎn)物【實(shí)驗(yàn)小結(jié)】本次實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容包括：用淀粉培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和普通變形桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，并用盧戈氏碘液檢驗(yàn)菌種是否具有產(chǎn)生淀粉酶，利用淀粉的能力；再用油脂培養(yǎng)基對(duì)這四種菌進(jìn)行培養(yǎng)，用中性紅指示劑檢驗(yàn)其是否會(huì)產(chǎn)生脂肪

15、酶；用糖發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌和普通變形桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，利用1.6%溴甲酚紫乙醇溶液和德漢氏小管檢驗(yàn)其是否能利用糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；用蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌，用乙醚和吲哚檢驗(yàn)其能否產(chǎn)生色氨酸；用葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌，用甲基紅指示劑檢驗(yàn)其能否利用葡萄糖產(chǎn)有機(jī)酸。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容較多，且用到的試管，平板和菌種較多，因此實(shí)驗(yàn)中要及時(shí)貼好標(biāo)簽，做好標(biāo)記，以免混淆。同時(shí)，通過這次實(shí)驗(yàn)掌握了幾種常用的生理生化實(shí)驗(yàn)方法，相信對(duì)以后的實(shí)驗(yàn)會(huì)有很大幫助，并掌握了多種培養(yǎng)基制備的方法以及點(diǎn)種與十字接種兩種接種方法：點(diǎn)種時(shí)接種面積要小，使菌在小范圍內(nèi)生長(zhǎng)，以便于觀察；十字接種時(shí)盡量將菌

16、接種在該部分的中央?yún)^(qū)域，在本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行十字接種時(shí)，由于劃線時(shí)沒有看清接種環(huán)和培養(yǎng)基之間的距離，導(dǎo)致將固體培養(yǎng)基表面劃破，在今后的實(shí)驗(yàn)中，要在接種操作時(shí)更小心仔細(xì)些?！舅伎寂c討論】1、 你怎么樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內(nèi)酶？答：淀粉是大分子物質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞十分困難，甚至需要觸及高耗能的胞吞作用。因而通過胞外酶的作用，將淀粉水解為葡萄糖后運(yùn)入細(xì)胞，較方便高效。實(shí)驗(yàn)中菌苔周圍出現(xiàn)透明圈，說明培養(yǎng)基內(nèi)淀粉被水解，可推測(cè)是細(xì)菌細(xì)菌將淀粉酶分泌到胞外所致，因此為胞外酶。2、 不利用碘液，你怎樣證明淀粉水解的存在？答：淀粉水解后產(chǎn)生葡萄糖，因此可以用斐林試劑驗(yàn)證淀粉是否被分解。呈陽性者則說明產(chǎn)生了葡萄糖，淀粉

17、被水解；陰性則說明淀粉未被水解。3、 假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發(fā)酵實(shí)驗(yàn)應(yīng)該出現(xiàn)什么結(jié)果？答：有氧代謝葡萄糖產(chǎn)生CO2，但CO2微溶于水且碳酸酸性較弱，因此試管中顏色不變化，仍為紫色。但由于產(chǎn)生了CO2，因此德漢氏小管中有氣柱。4、 討論IMViC試驗(yàn)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上的意義。答：可以鑒別某些疾病是由大腸桿菌還是產(chǎn)氣腸桿菌引起的。5、 解釋在細(xì)菌培養(yǎng)中吲哚檢測(cè)的化學(xué)原理，為什么在這個(gè)試驗(yàn)中用吲哚的存在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸？答：有些細(xì)菌產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對(duì)二甲基氨基甲醛結(jié)合，形成紅色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲

18、哚的能力，因此吲哚試驗(yàn)可以作為一個(gè)生物化學(xué)檢測(cè)的指標(biāo)。 因?yàn)楸崾巧矬w呼吸作用的產(chǎn)物，無論是有氧還是無氧，都會(huì)產(chǎn)生丙酮酸，因而無法作為色氨酸酶活性的指示劑進(jìn)行區(qū)分。同時(shí)吲哚能通過有明顯顏色變化的化學(xué)反應(yīng)觀測(cè)到，而丙酮酸不能，所以試驗(yàn)中用是否有吲哚產(chǎn)生作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸。6、 為什么大腸桿菌是甲基紅反應(yīng)陽性,而產(chǎn)氣腸桿菌為陰性？答：當(dāng)細(xì)菌代謝糖產(chǎn)生酸時(shí)，培養(yǎng)基就會(huì)變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色（PH6.3）轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（PH4.2），即甲基紅反應(yīng)。而大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有機(jī)酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)的后期仍能維持酸性PH4，而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機(jī)酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大約6。因此，大腸桿菌為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。 【附錄】培養(yǎng)基配方一、淀粉培養(yǎng)基蛋白胨10gNaCl5g牛肉膏5g可溶性淀粉2g蒸餾水1000ml瓊脂15-20g121滅菌20min.2、 油脂培養(yǎng)基蛋白胨10g牛肉膏5gNaCl5g香油或花生油10g1.6中性紅水溶液1ml瓊脂15-20ml蒸餾水1000mlPH7.2121S滅菌20min注：1、不能使用變質(zhì)油。2、油和瓊脂及水先加熱。3、調(diào)好PH后，