臨床微生物學(xué)概論060312研究生大課5院

1、 臨臨 床床 微微 生生 物物 學(xué)學(xué) 概概 論論復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所朱德妹 教授主要內(nèi)容臨床微生物學(xué)概論細菌的耐藥性及耐藥機制主要細菌的耐藥性變遷及實驗室診斷細菌耐藥性監(jiān)測細菌耐藥性的防治臨床常見的致病菌g（）：金葡菌，表葡菌，-鏈球菌，-溶鏈（a、b組），肺鏈，腸球菌g（）：需氧球菌： 腦膜炎和淋病奈瑟球菌，卡他莫拉菌需氧桿菌： 不動，假單胞，糞產(chǎn)堿桿菌需氧和兼性厭氧：腸桿菌科細菌，如大腸桿菌，肺 克，傷寒，志賀菌厭氧細菌： 消化鏈球菌，脆弱擬桿菌等簡述抗菌藥物的作用機制細菌對抗菌藥物的耐藥機制細菌耐藥性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)二.細菌耐藥性及耐藥機制dna引導(dǎo)的rna多聚酶鏈霉素慶大霉素、

2、妥布霉素（氨基糖苷類）阿米卡星蛋白合成（trna）莫匹羅星dnarna503050305030核糖體thfadhfapabadna旋轉(zhuǎn)酶（解旋、螺旋）喹諾酮類利福平細胞壁蛋白合成（50s抑制劑）紅霉素氯霉素克林霉素蛋白合成（30s抑制劑）細胞膜多粘菌素氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶細胞壁合成細胞壁合成環(huán)絲氨酸萬古霉素、替考拉寧桿菌肽青霉素類頭孢菌素類拉氧頭孢碳青霉烯類葉酸代謝甲氧芐啶磺胺類藥周質(zhì)空間-內(nèi)酰胺酶氨基糖苷類鈍化酶四環(huán)素大觀霉素細菌模式圖（一）抗菌藥物的作用機制干擾細菌細胞壁的合成，使細菌不能生長繁殖。損傷細菌的細胞膜，破壞其屏障作用。影響細菌細胞蛋白質(zhì)的合成，使細菌喪失生 長繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。破壞

3、核酸的代謝，阻礙遺傳信息的復(fù)制。抑制細菌葉酸代謝等?？咕幬锏闹饕饔冒形患毎诤铣杉毎跐B透性細胞蛋白合成核酸合成葉酸合成-內(nèi)酰胺類多粘菌素類氯霉素利副平磺胺類（smz-tmp）糖肽類兩性霉素b四環(huán)素類灰黃霉素磷霉素制霉菌素紅霉素喹諾酮類環(huán)絲氨酸咪康唑林可霉素類桿菌肽酮康唑氨基苷類褐霉素（二）細菌主要的耐藥機制滅活酶與鈍化酶的產(chǎn)生抗生素滲透屏障作用靶位結(jié)構(gòu)改變細菌代謝狀態(tài)，營養(yǎng)缺陷等細菌菌膜形成耐藥機制1.滅活酶和鈍化酶的產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶氨基糖苷類鈍化酶氯霉素?；D(zhuǎn)移酶mls類抗生素鈍化酶（macrolide-licosamide streptogramin）-內(nèi)酰胺酶分類底物譜f青霉素酶f頭孢

4、菌素酶 廣譜酶：青霉素類、一、二代頭孢菌素 超廣譜酶：三、四代頭孢菌素、碳青霉烯類遺傳學(xué)基礎(chǔ)f質(zhì)粒酶、染色體酶可誘導(dǎo)性f體質(zhì)酶（固有的）、誘導(dǎo)酶-內(nèi)酰胺酶分類ambler abush group 2大多數(shù)為質(zhì)粒酶d 3 可被酶抑制劑抑制ambler cbush group 1染色體介導(dǎo)酶b4對酶抑制劑穩(wěn)定-內(nèi)酰胺酶分類ambler classbush g roup2a2b2b2c2d2e2f2a1c2dd4undeterm inedserineg roup3clase bm etallob lactamaseamp cpcitem1,2shv1esblspse1,3,4oxa1-11pse2頭

5、孢菌素酶碳青霉烯酶金屬酶青霉素酶2be tem shv oxa ctx-m 其他2br tem30- 36 ir-shv2b（esbls）esbls分類來源等電點菌種temtemoniera5.2-6.5大腸桿菌肺炎克雷伯菌shvsulphydryl variable7.0-8.2肺炎克雷伯菌oxaoxacillin5.8-8.1銅綠假單胞菌ctx-mcefotaxime5.5-8.4大腸桿菌肺炎克雷伯菌其它類：其它類：per-1、2、veb等等5.4銅綠、不動、肺克等其他腸桿菌科細菌氨基糖苷飩化酶氨基環(huán)醇環(huán)和多個氨基糖分子，由配糖鍵相連接氨基糖苷飩化酶可以對氨基糖分子的活性基團進行修飾而使之

6、失去抗菌活性不同的氨基糖苷飩化酶可飩化同一種氨基糖苷類；而同一種氨基糖苷飩化酶可飩化不同的氨基糖苷類氨基糖苷類藥物結(jié)構(gòu)1512343624561”2”3”4”5”6”aac（6）aac（3）aac（3”） aph（2）ant(2）氨基糖苷類鈍化酶乙酰轉(zhuǎn)移酶 faac（2） aac（6） aac（3）核苷轉(zhuǎn)移酶 fant（4） ant（3） ant（2） ant（6）磷酸轉(zhuǎn)移酶 faph（3 ） aph（3”） aph（5”）革蘭陽性菌 （雙重功能酶） aac（6）+aph（2）耐藥機制2.抗生素滲透障礙：細胞壁障礙或細胞膜通透性的改變，抗生素?zé)o法進入細胞內(nèi)達到作用靶位而發(fā)揮作用。細胞壁：類脂雙

7、層，脂多糖（lps），阻礙疏水性抗菌藥物進入菌體。細胞外膜：ompf，ompa，ompc孔蛋白丟失或減少，阻礙親水性抗菌藥物進入菌體。細胞內(nèi)膜（胞漿膜）：產(chǎn)生新的能量依賴性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。mexa-mexb-oprm。耐藥機制3.靶位結(jié)構(gòu)改變靶位酶：二氫葉酸合成酶靶位生理功能：細菌形態(tài)和活力靶位結(jié)構(gòu)：mrsa的pbp2，dna旋轉(zhuǎn)酶耐藥機制4.其他細菌代謝狀態(tài)的改變：對氨苯甲酸產(chǎn)量（paba）營養(yǎng)缺陷、l型細菌（無細胞壁）細菌菌膜的形成f抗菌藥物不能透過整個菌膜f菌膜對抗菌藥物的敏感性降低f菌膜內(nèi)的細菌具有獨特的生物學(xué)特征4種主要耐藥機制泵出失活滲透障礙靶位改變x主要耐藥機制抗菌藥物抗菌藥物主要作用

8、主要作用主要耐藥機制主要耐藥機制-內(nèi)酰胺類pbps失活-內(nèi)酰胺酶pbps親和力降低胞壁滲透障礙糖肽類與肽聚糖前體結(jié)合 肽聚糖前體鈍化修飾氨基糖苷類抑制蛋白質(zhì)合成（30s亞基）鈍化酶（乙?；⒘姿峄⒑塑栈┐蟓h(huán)內(nèi)酯類抑制蛋白質(zhì)合成（50s亞基）rrna甲基化、外排泵機制喹諾酮類抑制dna旋轉(zhuǎn)酶（dna合成）靶位酶改變、外排泵機制（三）細菌耐藥性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)染色體介導(dǎo)耐藥質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥1.染色體介導(dǎo)的耐藥性耐藥基因位于染色體，隨細菌分裂傳至后代突變頻率低：105109通常只對1，2種類似藥物耐藥產(chǎn)生或消失和藥物存在無關(guān)耐藥菌生長分裂變慢，競爭力變?nèi)蹙哟我匚?.質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性染色體外的dna耐

9、藥質(zhì)粒：r.plasmid類型： f接合型（conjugative plasmid） 耐藥決定因子耐藥轉(zhuǎn)移因子f非接合型（nonconjugative plasmid） 耐藥決定因子轉(zhuǎn)移方式： f接合型： 接合轉(zhuǎn)移f非接合型：轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式 耐藥基因的轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)化 transformation轉(zhuǎn)導(dǎo) transduction接合 conjugation轉(zhuǎn)座 transposition接合（conjugation）方式：通過耐藥菌性菌毛和敏感菌菌體 的直接溝通，由耐藥菌將耐藥質(zhì)粒邊復(fù)制邊轉(zhuǎn)移給敏感菌。細菌：革蘭陰性菌，特別是腸道細菌。發(fā)生頻率：102108臨床意義：可造成耐藥菌的爆發(fā)流行， 種間

10、，屬間，牲畜與人細菌耐藥性細菌細菌對抗菌藥物耐藥的生物學(xué)表型既可以通過突變成為細菌的特征傳給子代,又可以接受或轉(zhuǎn)移耐藥基因,導(dǎo)致耐藥基因擴散耐藥基因可編碼多種耐藥機制來抵制抗菌藥物新的耐藥細菌新的耐藥細菌突變突變xx抗菌藥物耐藥性的出現(xiàn)敏感細菌耐藥細菌耐藥細菌耐藥基因轉(zhuǎn)移耐藥基因轉(zhuǎn)移抗菌藥物抗菌藥物抗菌藥物均具有選擇耐藥細菌的能力，其廣泛使用可導(dǎo)致選擇性壓力增加。每一種新抗菌藥物使用于臨床后不久就可產(chǎn)生耐藥性抗生素總量的消耗與耐藥性選擇有密切關(guān)系耐藥菌株極少xx耐藥菌株為主耐藥菌株為主抗生素暴露抗生素暴露xxxxxxxxxx抗菌藥物的選擇性壓力三.主要細菌的耐藥性變遷及實驗室診斷細菌耐藥性的現(xiàn)

11、狀和變遷實驗室診斷由病原微生物引起的感染仍然是當(dāng)前人類健康的主要威脅據(jù)1998年who的統(tǒng)計資料，因感染而死亡的人數(shù)占全部死亡人數(shù)的第二位。而在全球因感染死亡人數(shù)中，發(fā)展中國家?guī)缀跽嫉搅?0抗生素的不斷研發(fā)大大地降低了傳染性疾病的發(fā)病率和死亡率，但細菌耐藥性的出現(xiàn)和蔓延卻嚴重地威脅和破壞著人類抗感染治療的效果隨著國際旅游事業(yè)的發(fā)展和經(jīng)濟貿(mào)易的全球化，使耐藥菌株也在國際間廣泛傳播，從而導(dǎo)致細菌對抗生素耐藥現(xiàn)象的全球化1.細菌耐藥性的現(xiàn)狀和耐藥性變遷細菌耐藥性發(fā)生的重要事件 1910 奎寧 1939 磺胺 1941 青霉素 1946 鏈霉素 1957 氯喹 1961 耐甲氧西林金葡菌（mrsa）

12、1977 多重耐藥霍亂弧菌 1982 產(chǎn)esbl 的克雷伯菌 1987 多重耐藥傷寒沙門菌 1989 耐萬古霉素腸球菌（vre） 2002 萬古霉素耐藥金葡菌（vrsa）細菌耐藥性是全球性問題 1982年，esbls在催產(chǎn)克雷伯菌中首次發(fā)現(xiàn)f20世紀末，產(chǎn)生的菌種，酶的品種，地理區(qū)域 1989年，耐萬古霉素腸球菌（vre）f1993年，20倍 90年代：mrsa出現(xiàn)和prsp廣泛流行 1996年：對萬古霉素敏感性降低的金葡菌在日本首次發(fā)現(xiàn) 2002年，美國發(fā)現(xiàn)了vrsa金葡菌金葡菌青霉素耐藥金葡菌青霉素耐藥金葡菌金葡菌耐藥性的進化甲氧西林耐藥金葡菌甲氧西林耐藥金葡菌 (mrsa)甲氧西林甲氧西

13、林1970s青霉素青霉素1950s萬古霉素萬古霉素1990s萬古霉素耐藥腸球菌萬古霉素耐藥腸球菌(vre)1997萬古霉素中度耐藥萬古霉素中度耐藥金葡菌金葡菌(visa) 2002 萬古霉素萬古霉素耐藥耐藥金葡菌金葡菌近年來革蘭陽性菌的變遷主要表現(xiàn)為金葡菌(尤其是mrsa)耐藥株感染的發(fā)生率增多凝固酶陰性葡萄球菌(cns)感染增多耐青霉素肺炎鏈球菌（pisp，prsp）的出現(xiàn)和傳播萬古霉素耐藥腸球菌（vre）耐青霉素和耐頭孢菌素類草綠色鏈球菌上海地區(qū)的細菌耐藥性監(jiān)測資料近年來革蘭陰性菌的變遷主要表現(xiàn)為tem-1流感嗜血桿菌大腸埃希菌對氟喹諾酮類的耐藥率上升快克雷伯菌屬及腸桿菌科細菌中的esbl

14、s腸桿菌屬細菌中，尤其是陰溝腸桿菌中高產(chǎn)ampc 酶非發(fā)酵菌特別是不動桿菌、銅綠假單胞菌中的泛耐藥株嗜麥芽窄食單胞菌、黃桿菌固有耐藥株對碳青霉烯類的耐藥性上海地區(qū)的細菌耐藥性監(jiān)測資料四.抗感染藥物的敏感性試驗與 耐藥細菌的實驗室檢測1.抗感染藥物的敏感性試驗藥敏試驗 測定抗菌藥物在體外抑制病原微生物生長的能力,稱抗菌藥物對細菌的抑菌試驗，或稱細菌對藥物的敏感性試驗。藥敏試驗的目的供臨床醫(yī)師選用抗菌藥物時的參考細菌耐藥性監(jiān)測和耐藥性變遷評價新抗菌藥物的藥效學(xué)特征對細菌耐藥譜分析和分型有助于某些菌種的鑒定作為醫(yī)院內(nèi)感染流行病學(xué)調(diào)查的手段之一藥物敏感性試驗測定的方法稀釋法f試管稀釋法（肉湯稀釋法）f

15、平板稀釋法（瓊脂稀釋法）擴散法（紙片法）fkirby-baure(k-b)法fstockes法e-test稀釋法 原理：以一定濃度的抗菌藥物與含有被測菌株的培養(yǎng)基進行一系列的對倍稀釋經(jīng)培養(yǎng)后，肉眼觀察細菌生長的情況 最低抑菌濃度（mic）：肉眼觀察能抑制細菌生長的最低一管藥物濃度（minimal inhibitory concentration mic）幾個重要的指標(biāo) mic(最低抑菌濃度 minimal inhibitory concentration)f在體外能夠抑制細菌生長的最低藥物濃度 mbc(最低殺菌濃度 minimal bactericidal concentration)f在體外

16、能夠使細菌總數(shù)減少(殺滅)99.9%以上的最低藥物濃度。 mic50、mic90f在一批實驗中能抑制50%或90%受試菌所需的mic。 mbc50 mbc90f在一批實驗中能使50%或90%受試菌的活菌數(shù)減少99.9%所需的mbc。 臨界濃度（breakpoint）f根據(jù)抗菌藥物抑制細菌生長所需要的mic，結(jié)合常用劑量時該藥所能達到的血藥濃度，劃定細菌對各種抗菌藥物敏感或耐藥的界限。擴散法 原理：將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴散，因此敏感細菌在紙片周圍一定距離內(nèi)的生長受到抑制，根據(jù)抑菌圈的大小即可推知該藥物的最低抑菌濃度（mic）。紙片擴散法（k-b）操

17、作步驟紙片法藥敏和mic法的回歸直線圖log2micmic7128最664532低41638抑2412菌01-10.5濃-20.25-30.125度-40.06-50.03-60.0156101418222630343842抑菌圈直徑耐藥中敏高敏100株臨床菌株100對mic和抑菌圈直徑負相關(guān)（r =-0.9）中敏：12-20mme-試驗（e-test）原理：基本同擴散法，即濃度呈連續(xù)梯度的抗菌藥物從塑料紙條中向藥敏瓊脂中擴散，在試條周圍濃度范圍內(nèi)檢測菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。e-test綜合了稀釋法和擴散法的原理和特點，直接定量測出藥物對測試菌的最低抑菌濃度（mic）。e-試驗（

18、e-test）菌液，藥敏平板 同k-b法e-test條寬5mm， 長60mm150mm平皿貼6條90mm平皿貼1條如何閱讀藥敏試驗報告 s 高度敏感 i 中度敏感（中介） r 高度耐藥 臨床意義？高度敏感當(dāng)一種細菌引起的感染，用該種藥物常用劑量治療有效，這種細菌即對該藥高度敏感。即常規(guī)用藥時達到的平均血濃度超過對細菌mic的5倍以上。中度敏感當(dāng)細菌引起的感染，僅在應(yīng)用高劑量抗菌藥物時才有效，或者細菌處于體內(nèi)抗菌藥物濃縮部位，如尿液，膽汁等才被抑制，這種細菌對該藥呈中度敏感。常規(guī)用藥時達到平均血濃度，一般相當(dāng)于或略高于對細菌的mic高度耐藥 藥物對某一細菌的mic高于藥物在血或體液中可能達到的濃

19、度；有時細菌能產(chǎn)生滅活抗菌藥物的酶，則不論其mic值大小如何，仍應(yīng)判定該菌為耐藥。2.耐藥細菌的實驗室檢測和藥敏試驗特點耐甲氧西林葡萄球菌的檢測苯唑西林：1ug/片f金葡菌 11-12mmf凝固酶陰性葡萄球菌 17mm4%nacl- 6ug/ml苯唑西林鹽平板f培養(yǎng)條件：35，24-48小時f結(jié)果：1個菌落生長，判定為甲氧西林耐藥（mr）菌株頭孢西?。?0ug/片f金葡菌 19mmf凝固酶陰性葡萄球菌 24mm分子生物學(xué)方法:pcr擴增meca基因藥敏試驗的特點 -lactamasesmeca抗菌藥物抗菌藥物mssa(甲氧西林敏感金葡菌)/除青霉素外大多敏感mrsa(甲氧西林耐藥金葡菌)大多耐

20、藥（萬古霉素除外）耐萬古霉素腸球菌檢測 萬古霉素紙片擴散法f含量：30ug/片f結(jié)果：透射光，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)薄霧狀或任何其他生長或抑菌圈14mm均表示耐藥f抑菌圈15-16mm為中度敏感，micf抑菌圈17mm判定為敏感 萬古霉素耐藥確證試驗f含6ug/ml萬古霉素的mh平板f1-10ul 0.5 5macfarland standard菌懸液f35 ，24小時，1個菌落生長即判定為耐藥 分子生物學(xué)方法:vana、vanb、vanc 等基因藥敏試驗的特點耐藥基因特性van avan-r、tec-r van bvan-r、tec-svan cvan-i、tec-svre菌株耐萬古霉素腸球菌可測試對

21、氯霉素、紅霉素及利福平的敏感性耐青霉素肺炎鏈球菌的檢測苯唑西林：1ug/片抑菌圈直徑20mm為青霉素敏感株（ mic0.06ug/ml ）抑菌圈直徑19mm可能為青霉素耐藥、中敏或敏感株，必須進行青霉素mic測定。f 0.06ug/ml s（prsp）f0.125-1ug/ml i（pisp）f 2ug/ml r（prsp）藥敏試驗的特點pssp青霉素、阿莫西林等-內(nèi)酰胺類高度敏感對紅霉素、克林霉素、氯霉素耐藥率較高pisp+prsp青霉素耐藥，部分菌株對頭孢曲松等第三代頭孢菌素耐藥；但對萬古霉素、和碳青霉烯類等均呈敏感；對紅霉素、克林霉素、氯霉素耐藥率更高esbl細菌的檢測篩選試驗f頭孢泊肟

22、：10ug/片 22mmf頭孢他啶：30ug/片 22mmf頭孢噻肟：30ug/片 27mmf頭孢曲松：30ug/片 25mmf氨曲南： 30ug/片 27mm任何一種以上藥物進行篩選，出現(xiàn)上述結(jié)果疑為esbl產(chǎn)生株。esbl細菌的檢測確證試驗f頭孢他啶（30ug/片）、頭孢他啶/克拉維酸（30/10ug） f頭孢噻肟(30ug/片)、頭孢噻肟/克拉維酸（ 30/10ug ）上述任何一種組合中復(fù)方制劑的抑菌圈直徑與單藥抑菌圈直徑相比，5mm可判定為esbl產(chǎn)生株。藥敏試驗的特點 esbls菌株主要為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，其他的腸桿菌科細菌和非法酵菌中亦可存在 可水解各種廣譜-內(nèi)酰胺類抗生素

23、包括第三代的頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松以及頭孢吡肟和氨曲南等含氧亞氨基側(cè)鏈的頭孢菌素 多數(shù)可被酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦所抑制 對亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類高度敏感，對頭霉素類、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦等酶抑制劑復(fù)方制劑多數(shù)仍呈敏感 對具非-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的抗菌藥物如氨基糖苷類、氟喹酮類等的耐藥率亦較非產(chǎn)酶株高 ampcesbl水解頭孢西丁水解頭孢西丁 +-水解頭孢曲松等三代頭孢菌素水解頭孢曲松等三代頭孢菌素 + +酶抑制劑抑制酶抑制劑抑制- +鄰氯西林抑制鄰氯西林抑制+- ampc酶的檢測ampc酶和esbl酶的特點產(chǎn)ampc酶菌株主要發(fā)生在腸桿菌屬、普羅威登菌屬、摩

24、根菌屬、沙雷菌屬何家單胞菌屬細菌中對頭霉素類、第三代頭孢菌素和酶抑制劑復(fù)方制劑耐藥，并可同時對氟喹酮類和氨基糖苷類耐藥對第四代頭孢菌素頭孢吡肟和碳青霉烯類敏感如為esbls+ampc酶菌株第四代頭孢菌素頭孢吡肟亦耐藥藥敏試驗的特點抗菌藥物合理應(yīng)用的幾個問題汪復(fù)；中國抗感染化療雜志；2005:5(1):13有關(guān)耐藥細菌感染的抗菌藥物選用有關(guān)耐藥細菌感染的抗菌藥物選用 請閱讀請閱讀五.細菌耐藥性監(jiān)測細菌耐藥性的危害性耐藥菌引起的感染治療無效，發(fā)病率和病死率增加。病程延長，住院天數(shù)增加，床位周轉(zhuǎn)率低?；ㄙM大量的抗菌藥物，使國家藥政開支增加，嚴重影響國民經(jīng)濟發(fā)展。危害人類健康，對嬰幼兒和老年人、免疫機制低下者的生命構(gòu)成威脅。目的和意義將感染性疾病的發(fā)病率和病死率將到最低合理使用抗菌藥物，防止濫用，延緩耐藥性發(fā)生。有助于預(yù)防、控制和遏制本地的、地區(qū)的以及全國的耐藥性發(fā)生發(fā)展。制定修訂經(jīng)驗處理和標(biāo)準化的用藥指南，修訂國家藥典以提供信息。為國家制訂研制抗菌藥物和改造老抗菌藥物提供信息國外動態(tài)世界衛(wèi)生組織（who）60年代f設(shè)有專題組研究細菌耐藥性的防治76年f制訂了標(biāo)準化的藥物敏感性試驗操作方法(紙片法及試驗材料的質(zhì)量標(biāo)準)，組織了一次國際性的協(xié)作。84年fwho西太區(qū)組織了本地區(qū)細菌耐藥性監(jiān)測協(xié)作組