核酸的序列分析PPT課件

1、1 1、末端終止法、末端終止法2 2、化學裂解法、化學裂解法3 3、DNADNA測序自動化測序自動化使用特異性引物使用特異性引物與單鏈模板與單鏈模板DNADNA退退火，在火，在DNADNA聚合酶聚合酶作用下進行延伸作用下進行延伸反應，用反應，用ddNTPddNTP終終止，用止，用PAGEPAGE區(qū)分區(qū)分長度僅相差長度僅相差1 1個核個核苷酸的苷酸的ssDNAssDNA，從，從而完成測序的方而完成測序的方法。法。用化學試劑在用化學試劑在A A、G G、C C、T T處特定的裂解處特定的裂解DNADNA片段，產生一簇片段，產生一簇各種長度的短鏈，各種長度的短鏈，經過經過PAGEPAGE放射自顯放射

2、自顯影可直讀影可直讀DNADNA順序。順序。類似末端終止法，所類似末端終止法，所不同的是用熒光染料不同的是用熒光染料標記，計算機自動讀標記，計算機自動讀出。出。優(yōu)點簡便、迅速、應簡便、迅速、應用廣泛。用廣泛。不需酶促反應，可不需酶促反應，可以對寡核苷酸測序。以對寡核苷酸測序。1 1、高負荷，、高負荷，1 1塊膠可塊膠可測測1616個樣品；個樣品；2 2、機、機讀不需放射自顯影；讀不需放射自顯影；3 3、安全不用同位素；、安全不用同位素；4 4、簡單迅速。、簡單迅速。第1頁/共20頁第2頁/共20頁 測序過程測序過程: :1.1.模板與引物雜交模板與引物雜交2.2.引物的延長和合成阻斷引物的延長

3、和合成阻斷 四個試管分別加入四個試管分別加入 DNADNA聚合酶聚合酶 dNTP dNTP 標記底物標記底物 終止劑不同終止劑不同 ddA ddG ddC ddTddA ddG ddC ddT 四個試管中所有產物是一系列長度只差一個四個試管中所有產物是一系列長度只差一個核苷酸的聚合鏈核苷酸的聚合鏈3.3.電泳電泳4.4.放射自顯影得到直讀圖象放射自顯影得到直讀圖象第3頁/共20頁5-AACTGCTG-3與引物退火5-AACTGCTG-3 5 dNTPddATPdNTPddCTPdNTPddGTPdNTPddTTP5-AACTGCTG-3 AC-55-AACTGCTG-3 C-55-AACTGC

4、TG-3 GAC-55-AACTGCTG-3 TGACGAC-55-AACTGCTG-3 CGAC-55-AACTGCTG-3 CGAC-55-AACTGCTG-3 GACGAC-55-AACTGCTG-3 TTGACGAC-52+5 1+43+67+8ddddddddddddddddAGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53添加 DNA polymerase所有4 dNTPs其中一種標記的ddNTPddTTP ddCTP ddGTP ddATP在四個不同的反應管中各只包含一種ddNTP.第4頁/共20頁AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53TTCGATTCGATT

5、TCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGAT reactionC reactionG reactionA reaction每一管中的復制的序列都停留在每一管中的復制的序列都停留在ddNTPs ddNTPs 處處5第5頁/共20頁第6頁/共20頁反應終止后，四個反應管中的反應混合液分別進行聚丙烯酰胺凝膠反應終止后，四個反應管中的反應混合液分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離電泳分離. .這四個反應管中延伸的寡核苷酸僅相差一個堿基這四個反應管中延伸的寡核苷酸僅相差一個堿基. .電泳結構通過顯色指示電泳結構通過顯色指示. . T C G A3CCTTTAGCT5第7頁/共20頁 法

6、法是是MaxamMaxam和和GilbertGilbert等人等人19771977年創(chuàng)年創(chuàng)建的，用來測定建的，用來測定DNADNA序列。序列?；瘜W法是用化學試劑在化學法是用化學試劑在A A、G G、C C、T T處特定地裂解處特定地裂解DNADNA片段，產生一簇各種片段，產生一簇各種長度的短鏈（等差數列長度的短鏈（等差數列 n=1n=1），經過），經過PAGEPAGE和放射和放射自顯影后，可以直接讀出自顯影后，可以直接讀出DNADNA的順序。的順序。 第8頁/共20頁1 1、用放射性核素標記待測、用放射性核素標記待測DNADNA一側末端一側末端2 2、將標記、將標記DNADNA分為分為G G、

7、A+GA+G、C+TC+T、C 4C 4個反應體系個反應體系3 3、用不同的化學試劑處理不同反應體系，隨機斷、用不同的化學試劑處理不同反應體系，隨機斷裂裂DNADNA片段某種堿基中的任何一個，產生一組一片段某種堿基中的任何一個，產生一組一端為放射線標記的末端，另一端為不同大小的端為放射線標記的末端，另一端為不同大小的DNADNA片段的混合物片段的混合物4 4、電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖、電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出譜，即可讀出DNADNA序列序列第9頁/共20頁反應體系反應體系堿基修飾試劑堿基修飾試劑堿基修飾反應堿基修飾反應 主鏈斷裂試劑主鏈斷裂試劑斷裂點

8、斷裂點G G硫酸二甲酯硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化鳥嘌呤甲基化六氫吡啶六氫吡啶G GG+AG+A甲酸甲酸脫嘌呤作用脫嘌呤作用六氫吡啶六氫吡啶G G和和A AC+TC+T肼肼嘧啶開環(huán)嘧啶開環(huán)六氫吡啶六氫吡啶C C和和T TC C肼（加鹽）肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶六氫吡啶C C第10頁/共20頁 每組測序圖譜為每組測序圖譜為4 4條垂直的階梯帶，該片從膠底部一條垂直的階梯帶，該片從膠底部一個個向頂部讀，個個向頂部讀，G+AG+A和和C+TC+T兩列中含有所有相差一個堿基的兩列中含有所有相差一個堿基的DNADNA片段。如果片段。如果G+AG+A中出現中出現1 1條帶就看條帶就看G G列中是否

9、有同樣大小列中是否有同樣大小的帶，若有即為的帶，若有即為G G堿基，無則為堿基，無則為A A堿基；同理，堿基；同理，C+TC+T中則檢中則檢查查C C列中有無同樣大小條帶，有即為列中有無同樣大小條帶，有即為C C，無則為，無則為T T。 從單塊凝膠上能得到可靠序列數量約為從單塊凝膠上能得到可靠序列數量約為200-300bp200-300bp以內以內第11頁/共20頁第12頁/共20頁 優(yōu)點：優(yōu)點： 1 1、所測序列直接來源于所測、所測序列直接來源于所測 DNA DNA ，避免了，避免了 DNA DNA 復制中錯誤復制中錯誤 dNTP dNTP 的摻入。的摻入。 2 2、可直接對合成的寡核苷酸測

10、序，可分析甲、可直接對合成的寡核苷酸測序，可分析甲基化修飾等，以及研究基化修飾等，以及研究 DNA DNA 的二級結構及蛋的二級結構及蛋白質與白質與 DNA DNA 的相互作用等。的相互作用等。 缺點：缺點： 操作復雜，讀序困難。操作復雜，讀序困難。第13頁/共20頁特點特點原理同末端終止法原理同末端終止法標記物為熒光染料標記物為熒光染料激光掃描自動測序激光掃描自動測序結果清晰、準確、分辨率高結果清晰、準確、分辨率高測序速度快測序速度快 200bp/h200bp/h第14頁/共20頁1 1、標記物不同：手工測序采用放射性核素標記，而自動、標記物不同：手工測序采用放射性核素標記，而自動測序采用測

11、序采用4 4種熒光染料分別標記種熒光染料分別標記ddNTPddNTP或標記引物或標記引物2 2、加樣方式不同：手工測序，一個樣品的、加樣方式不同：手工測序，一個樣品的4 4個測序反應個測序反應物分別在不同泳道進行，而自動測序可在一個泳道內物分別在不同泳道進行，而自動測序可在一個泳道內電泳，提高電泳分析的效率電泳，提高電泳分析的效率3 3、檢測手段不同：手工測序采用放射自顯影，從、檢測手段不同：手工測序采用放射自顯影，從4 4種寡種寡聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出DNADNA序列，而自動測序序列，而自動測序則采用激光掃描器同步掃描，計算機進行閱讀和編輯則采用激光掃描器同步掃

12、描，計算機進行閱讀和編輯第15頁/共20頁 DNA DNA序列測定的自動化序列測定的自動化 1. DNA測序步驟與自動化測序步驟與自動化 1）模板制備）模板制備 可自動化可自動化 2）定序反應）定序反應 可自動化可自動化 3）凝膠電泳）凝膠電泳 自動化有一定困難：制膠，點樣，電泳，凝膠干自動化有一定困難：制膠，點樣，電泳，凝膠干燥，放射自顯影。燥，放射自顯影。 4）核苷酸序列閱讀與計算機輸入）核苷酸序列閱讀與計算機輸入 可自動化可自動化 2.自動測序儀自動測序儀 Conney等人于等人于1987年設計了不同熒光染料標記引物，然后年設計了不同熒光染料標記引物，然后做鏈終止測序，用激光掃描閱讀序列

13、。做鏈終止測序，用激光掃描閱讀序列。 紅色紅色引物引物+T反應系統(tǒng)（引物反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黃色黃色引物引物+G反應系統(tǒng)（引物反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddGTP） 綠色綠色引物引物+A反應系統(tǒng)（引物反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddATP） 蘭色蘭色引物引物+C反應系統(tǒng)（引物反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddCTP）第16頁/共20頁第17頁/共20頁目前市場上已經有各種型號的目前市場上已經有各種型號的DNADNA自動測序儀可供選購。自動測序儀可供選購。 第18頁/共20頁“分子生物學研究方法分子生物學研究方法”思考題：思考題：1 1、常用的核酸的凝膠電泳是哪兩種？它們分辨、常用的核酸的凝膠電泳是哪兩種？它們分辨DNADNA片段的范圍有何不同？片段的范圍有何不同？2 2、電泳操作的基本程序有哪些？、電泳操作的基本程序有哪些？3 3、核酸的分子雜交的概念？、核酸的分子雜交的概念？ Southern Southern 印跡法、印