神經(jīng)系統(tǒng)生理實驗講義

1、一、坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本制作實驗?zāi)康?、熟悉并掌握蟾蜍或蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本的制作方法。2、熟悉并掌握生理學實驗常用器械的使用和基本操作技術(shù)。實驗原理坐骨神經(jīng)和腓腸肌屬于可興奮組織，給坐骨神經(jīng)一個適宜的刺激可產(chǎn)生一可傳導的動作電位，引起其所支配肌肉（腓腸?。┑氖湛s。將蟾蜍或青蛙的坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本置于任氏液中，其活性可以在幾個小時內(nèi)保持不變。故制備蟾蜍或青蛙的坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本，可用于研究觀察組織的興奮和興奮性、傳導性以及刺激與肌肉收縮等基本生理現(xiàn)象和過程。故制備坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本是生理實驗中必須掌握的一項基本技能。實驗對象蟾蜍或蛙。蟾蜍和青蛙是兩棲類動物，兩棲動物一些基本生命活動和生

2、理機能與溫血動物相似，而其離體組織、器官保持活性所需條件比較簡單，易于控制和掌握，所以生理實驗中常選用蟾蜍或青蛙的離體組織或器官作為實驗標本。實驗器材和藥品蛙類手術(shù)器材一套蛙板、固定釘、粗剪刀、手術(shù)剪、眼科剪、眼科鑷、刺蛙針根、玻璃分針根、鋅銅弓；滴管、培養(yǎng)皿（120mm）、燒杯（250ml）、廢物盤、任氏液實驗步驟1、破壞腦脊髓取蟾蜍一只，自來水沖洗干凈。左手握住蟾蜍，食指按壓吻端，拇指按壓背部，使其頭部盡量前俯。右手持刺蛙針從相當于枕骨大孔處（用刺蛙針從兩眼中間開始沿著脊柱方向下劃，觸到凹陷處既是枕骨大孔處，它位于蛙的顱骨和脊柱中間）垂直刺入，然后向前通過枕骨大孔刺入顱腔，左右攪動充分搗毀

3、腦組織。接著將刺蛙針抽回至進針處（即枕骨大孔處，注意勿全部拔出刺蛙針），再向后刺入錐管，反復(fù)提插搗毀脊髓。此時如蟾蜍四肢松軟，呼吸消失，表明腦和脊髓已被完全損壞，否則應(yīng)按上法重復(fù)進行。2、剪除軀干上部及內(nèi)臟左手提住蟾蜍脊柱，右手持粗剪刀在骶髂關(guān)節(jié)水平面（第4腰椎平面）以上0.51.0 cm處剪斷脊柱。左手握住蟾蜍的后肢，用拇指壓住骶骨，使蟾蜍頭與內(nèi)臟自然下垂，右手持粗剪刀，沿著脊柱兩側(cè)剪除內(nèi)臟幾頭胸部，留下后肢、骶骨、脊柱以及緊貼在脊柱兩側(cè)的坐骨神經(jīng)。剪除過程中注意勿損傷坐骨神經(jīng)。3、剝皮左手捏住脊柱斷端（注意不要觸及坐骨神經(jīng)），右手捏住皮膚邊緣，用力向下剝掉去除全部后肢的皮膚。把去除了皮膚的

4、標本放在盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。將已使用過的剪刀、鑷子、蛙板等手術(shù)器械洗凈。再進行下面步驟。4、分離兩腿，制作坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本4.1 分離兩腿用鑷子夾住脊柱將標本提起，背面朝上，兩腿下垂，剪去向上突起的尾骨（注意勿損傷坐骨神經(jīng)）。然后沿正中線用粗剪刀從脊柱和恥骨聯(lián)合中央處剪開，分離兩腿。將分離的兩條腿仍浸于盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。4.2 游離坐骨神經(jīng)取一腿置于蛙板上的玻璃板上。將標本腹面朝上放置，用固定針將標本固定，使其盡量展開。用玻璃針沿脊柱旁向下游離坐骨神經(jīng)，用玻璃分針沿坐骨神經(jīng)溝縱向分離暴露坐骨神經(jīng)，將神經(jīng)一直游離至腘窩，用眼科剪剪去其游離的分支。4.3 制備坐骨神經(jīng)小腿標本將游離干凈的

5、坐骨神經(jīng)從脊柱根部剪斷（需連有23節(jié)脊椎骨），將其搭于腓腸肌上，從膝關(guān)節(jié)周圍剪掉大腿肌肉，并用粗剪刀將其股骨刮干凈，然后再股骨下1/3處剪斷，完成就是坐骨神經(jīng)-小腿標本的制備。4.4 制備神經(jīng)-腓腸肌標本將上述坐骨神經(jīng)-小腿標本在腓腸肌肌腱處穿線結(jié)扎后于結(jié)扎處遠端剪斷肌腱。游離腓腸肌至膝關(guān)節(jié)處，然后從膝關(guān)節(jié)下方將小腿其余部分剪掉，這樣就制得一個具有股骨的坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本。將制備好的標本置于任氏液中。5、檢查標本的興奮性用經(jīng)任氏液潤濕的鋅銅弓輕輕接觸坐骨神經(jīng)，觀察腓腸肌收縮情況。注意事項1、腦脊髓破壞要徹底。2、操作過程中，勿污染、壓榨、損傷、過度牽拉神經(jīng)和肌肉。勿用金屬器械觸碰神經(jīng)肌肉。3

6、、分離肌肉時，注意按層次進行。4、保持神經(jīng)、肌肉的濕潤。5、制備標本的過程中，不要使動物的皮膚分泌物和血液等接觸神經(jīng)和肌肉。思考題1、為何不能用金屬器械接觸神經(jīng)肌肉？2、用鋅銅弓接觸坐骨神經(jīng)可觀察到什么現(xiàn)象？為什么？3、思考如何根據(jù)自己實驗總結(jié)出來的經(jīng)驗改進制備標本的方法。二、神經(jīng)干動作電位、興奮傳導速度的測定實驗?zāi)康?、學習生理信號采集系統(tǒng)的使用方法。2、掌握離體神經(jīng)干動作電位的細胞外記錄方法。學習分析、判斷和測量動作電位。3、了解測定神經(jīng)干興奮性傳導速度及其不應(yīng)期的基本方法。實驗原理具有興奮性的組織和細胞，并不是對任何程度的刺激都能表現(xiàn)興奮或出現(xiàn)動作電位。刺激要引起組織細胞發(fā)生興奮，必須使

7、以下三個參數(shù)達到某一臨界值：刺激的強度、刺激的時間以及刺激強度對時間的變化率（即強度對時間的微分）。神經(jīng)纖維受足夠強度的刺激后，其膜電位發(fā)生變化產(chǎn)生動作電位，是神經(jīng)纖維興奮的標志。在刺激時間不變的情況下，剛能引起興奮的刺激強度稱為閾刺激或閾強度，簡稱閾值。強度小于閾值的刺激，稱為閾下刺激；閾下刺激不能引起興奮和動作電位，但并非對組織細胞不產(chǎn)生任何影響。興奮性和閾強度間具有反變關(guān)系。單根神經(jīng)的動作電位是“全或無”的，神經(jīng)干由粗細不等、興奮性不同的纖維組成，其動作電位是復(fù)合動作電位，動作電位幅度在一定范圍內(nèi)隨刺激強度的增大而增大。動作電位可沿細胞膜做不衰減的傳導。因此，在神經(jīng)干的一端給予刺激，在另

8、一端可記錄到神經(jīng)干的復(fù)合動作電位。記錄的方法不同，記錄到的動作電位也有雙相和單相之分。神經(jīng)纖維的功能是傳導興奮，神經(jīng)纖維的速度因其直徑大小、有無髓鞘而不同，可用電生理的方法進行測量。傳導速度可由測定神經(jīng)沖動所經(jīng)過的路程和耗費的時間來計算。單獨測量從刺激偽跡到動作電位出現(xiàn)時間不能準確地計算出傳導速度，因為這段時間包含著刺激神經(jīng)纖維產(chǎn)生動作電位所需的時間以及動作電位傳導到記錄電極的時間，因此可采用兩次測量的方法來計算。神經(jīng)纖維在一次興奮過程中，其興奮性可發(fā)生周期性變化，包括絕對不應(yīng)期、相對不應(yīng)期、超常期和低常期。實驗對象蟾蜍或蛙。實驗器材和藥品 蛙類手術(shù)器材一套蛙板、固定釘、粗剪刀、手術(shù)剪、眼科剪

9、、眼科鑷、刺蛙針根、玻璃分針根、鋅銅弓；滴管、培養(yǎng)皿（120mm）、燒杯（250ml）、廢物盤、任氏液、BL-420S生物信號采集系統(tǒng)及刺激器、神經(jīng)標本屏蔽盒。實驗步驟1、制備坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本2、連接儀器裝置將標本屏蔽盒上的r1、r2分別與引導電極正負極相連，引導電極的另一接口與電腦BL-420S系統(tǒng)的面板CH1接口相連；將標本屏蔽盒上的r3、r4分別與另一引導電極正負極相連，引導電極的另一接口與電腦BL-420S系統(tǒng)的前面板CH2接口相連。兩個引導電極的地線同時接標本盒的接地連接處。S1、s2與刺激電極相連。刺激電極插頭與電腦BL-420S系統(tǒng)的前面板刺激接口相連。3、連接標本將神經(jīng)標本

10、的離體端置于離體神經(jīng)標本盒中的電極上。神經(jīng)的中樞端放在刺激電極上，外周端放在記錄電極上（r1、r2、r3、r4）。4、使用BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)4.1 神經(jīng)干動作電位選擇“實驗項目”菜單中的“肌肉神經(jīng)實驗”菜單項，以彈出“肌肉神經(jīng)實驗”子菜單。在“肌肉神經(jīng)實驗”子菜單中選擇“神經(jīng)干動作電位的引導”實驗?zāi)K。根據(jù)信號窗口顯示的動作電位波形，再適當調(diào)節(jié)實驗參數(shù)以獲得最佳的實驗效果。（以上步驟可由下面6步代替：a.選擇“輸入信號”菜單中的“1通道”菜單項，以彈出“1通道”子菜單；b.在“1通道”子菜單中選擇“動作電位”信號；c.基本參數(shù)設(shè)置：增益：100；高頻濾波：10kHz；交流（AC）：

11、0.01s輸入；d.在“設(shè)置刺激器參數(shù)”對話框中調(diào)節(jié)實驗參數(shù)，可參考以下：模式：粗電壓；方式：單刺激；延時：5ms；波寬：0.05ms；刺激強度調(diào)至最??；e.單擊工具條上的“開始”命令按鈕啟動波形；f.單擊刺激器調(diào)節(jié)區(qū)上的“啟動刺激”命令按鈕，從而觸發(fā)產(chǎn)生動作電位，從小到大逐漸增加刺激強度，觀察波形的變化。）4.2 神經(jīng)興奮傳導速度的測定選擇“實驗項目”菜單中的“肌肉神經(jīng)實驗”菜單項，以彈出“肌肉神經(jīng)實驗”子菜單。在“肌肉神經(jīng)實驗”子菜單中選擇“神經(jīng)干興奮傳導速度的測定”實驗?zāi)K。根據(jù)信號窗口顯示的動作電位波形，再適當調(diào)節(jié)實驗參數(shù)以獲得最佳的實驗效果。（以上步驟可由下面步驟代替：a.選擇“輸入

12、信號”菜單中的“1通道”菜單項，以彈出“1通道”子菜單；b.在“1通道”子菜單中選擇“動作電位”信號；c.選擇“輸入信號”菜單中的“2通道”菜單項，以彈出“2通道”子菜單；d.在“2通道”子菜單中選擇“動作電位”信號；e.基本參數(shù)設(shè)置：增益：100；高頻濾波：10kHz；交流（AC）：0.01s輸入；f.在“設(shè)置刺激器參數(shù)”對話框中調(diào)節(jié)實驗參數(shù)，模式：粗電壓；方式：單刺激；延時：5ms；波寬：0.05ms；強度：1-4V；g.單擊工具條上的“開始”命令按鈕啟動波形；h.單擊刺激器調(diào)節(jié)區(qū)上的“啟動刺激”命令按鈕，從而觸發(fā)出波形。）傳導速度的計算：記錄r1和r2兩電極引導的最大動作電位，測量此時動

13、作電位的潛伏期（從刺激偽跡起始點到動作電位的起始點間的時間），用t1表示。記錄r3和r4兩電極引導的最大動作電位，測量此時動作電位的潛伏期，用t2表示。（t2-t1）為動作電位由r1傳r3所需時間（在此處用兩個電位峰值間的距離較為準確，因為動作電位的起始點有時難以確定），用t表示（單位：ms）。并測量r1和r3之間神經(jīng)標本的實際距離d（單位：mm）。根據(jù)公式計算：神經(jīng)傳導速度（m/s）：=距離（d）/時間（t），即v=d/t。注意事項1、剝制神經(jīng)標本時要細致，須將神經(jīng)周圍的結(jié)締組織去干凈，避免與金屬接觸和損傷神經(jīng)標本。2、經(jīng)常用任氏液保持神經(jīng)標本濕潤。3、應(yīng)使神經(jīng)與每只電極密切接觸，同時注意保護電極不要短路，神經(jīng)不可折疊。4、當電刺激神經(jīng)時，刺激電流逸散而通過引導電極記錄下來就成為刺激偽跡，它可作刺激的時間標志。如果刺激電極與引導電極之間的距離太近，往往有可能發(fā)生刺激偽跡和動作電位的波形融合而產(chǎn)生畸變。因此，必須注意檢查刺激電極與引導電極之間的距