gfp基因的克隆與表達

1、基因工程實驗設(shè)計題目：綠色熒光蛋白基因(gfp) 的克隆及表達專業(yè)：生工1001姓名：劉會淼2013年 3月13實驗目的：研究綠色熒光蛋白（ Greed Fluorescent Protein ， GFP）基因的基因克隆及在大腸桿菌中的表達。實驗方法 ; 通過分別將 DH-5 (pEGFP-N3) 和 DH-5 (pET-28a)提取質(zhì)粒、酶切并連接形成重組質(zhì)粒 pET-28a-GFP，將重組質(zhì)粒導入 E.coli DH-5 感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化 ,通過限制性核酸內(nèi)切酶 Not I 與 Bam H1 和 PCR 對所建質(zhì)粒進行分析鑒定后 , 通過轉(zhuǎn)化的方法把含綠色熒光蛋白（ GFP）外源基因轉(zhuǎn)

2、入大腸桿菌體 BL-21 內(nèi)進行表達，再用 IPTG 誘導 GFP 基因表達，如果可以看到顯現(xiàn)綠色，判斷 GFP 基因在大腸桿菌中成功表達。1.材料與方法：1.1.1實驗材料克隆菌 E.coli DH-5a 、表達菌 BL-21 為本實驗室收藏菌種，質(zhì)粒pET-28a 和 pEGFP-N3 ，引物，限制性內(nèi)切酶Bam H1 、 Not 1.1.2儀器設(shè)備Eppendof 離心機、電泳儀、電子天平、臺式離心機、控溫磁力攪拌器、調(diào)溫電熱套pH 計、冰箱、臺式冷凍恒溫振蕩器、紫外燈、生物潔凈工作臺、電熱恒溫水溫箱、瓊脂糖凝膠電泳電泳裝置、凝膠成像分析系統(tǒng)、酒精燈、培養(yǎng)皿、移液槍、槍頭、接種環(huán)、酒精棉

3、球、滅菌槍頭、平板封口膜、離心管1.1.3試劑及溶液分裝后于121 高壓滅菌 20 min 。（ LB 固體培養(yǎng)基是在液體LB 中加瓊脂粉至1 %）；溶液50 mL葡萄糖50 mmol/LTris-Cl (pH 8.0)25 mmol/LEDTA (pH 8.0)10 mmol/L121高壓滅菌15 min 后置于 04 貯存；溶液100 mLNaOH0.2 mol/LSDS1% (W/V)用時由母液2 mol/L NaOH 、 10%(W/V) SDS 稀釋現(xiàn)配；溶液 100 mLKOAc (5 mol/L)60 mL冰乙酸11.5 mLH O28.5 mL2121 高壓滅菌15 min 后

4、置于 04 貯存；氯仿；瓊脂糖；滅菌的去離子水；10×酶切緩沖液； TaqDNA 聚合酶； TaqDNA 聚合酶緩沖。滅菌的 0.1 mol/L CaCl 2 標準相對分子質(zhì)量的DNA ；溴乙錠（ EB）儲存液0.5 g/mL ；LB/Kan，（ 50 g/mL ）固體培養(yǎng)基； IPTG 配成濃度為 400 mM 水溶液，-20 保存?zhèn)溆茫?卡那霉素（ Kan）配成濃度為 100 ug/mL 水溶液， -20 保存?zhèn)溆茫?70%乙醇：用新開裝的乙醇和滅菌無離子水配成，放在04 ；無水乙醇：放在 04 ； RNase 母液：將 RNase 溶于 10 mmol/LTris·

5、Cl(pH 7.5) 、 15 mmol/LNaCl 配成的試劑中，配成10 mg/mL 的溶液，在100 加熱15 min ，使可能溶有的DNase失活，然后緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于20 ；1.2 方法：1.2.1 大腸桿菌DH-5 (pEGFP-N3) 染色體 DNA 的提取1.2.2、實驗目的：掌握酚氯仿法提取的原理和操作。1.2.3 ，器材 ：，微量移液器、高速離心機、1.5ml 管、吸頭、烘箱、水浴鍋、1.5ml管架、膠頭滴管、冰箱，消化緩沖液 : CTAB/NaCl 溶液： 4.1g NaCl 溶解于 80ml H2 O, 緩慢加入 10g CTAB, 加水至 100ml

6、；其它試劑：氯仿 :異戊醇 (24:1) ，酚 :氯仿 : 異戊醇 (25:24:1) ，異丙醇， 70% 乙醇， TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml 或粉劑 )， 5mol/L NaCl 。1.2.4 實驗原理生物的大部分或幾乎全部都集中在細胞核或類核中。DNA 在體內(nèi)通常都與蛋白質(zhì)結(jié)合， 蛋白質(zhì)對DNA 制品的污染常影響到以后的DNA 操作過程， 因此需把蛋白質(zhì)除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿對蛋白質(zhì)有極強的變性作用，而對DNA 無影響。經(jīng)苯酚、氯仿抽提后，蛋白質(zhì)變性而被離心沉降到酚相與水相的界面，DNA 則留在水相，少量的或與 DNA 緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)可用蛋白酶予以

7、去除。DNA 制品中少量的RNA 無影響，必要時可加入不含DNase 的 RNase 去除 RNA 污染。1.2.5、實驗步驟1. 100ml 細菌過夜培養(yǎng)液, 5000rpm 離心 10 分鐘 , 去上清液。2. 加9.5ml TE懸浮沉淀 , 并加0.5ml 10% SDS, 50l20mg/ml( 或 1mg 干粉)蛋白酶 K, 混勻 , 37保溫 1 小時。3. 加 1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。4. 加 1.5ml CTAB/NaCl 溶液 , 混勻 , 65保溫 20 分鐘。5. 用等體積酚 :氯仿 :異戊醇 (25:24:1) 抽提 , 5000rpm 離心 10

8、分鐘 , 將上清液移至干凈離心管。6. 用等體積氯仿 :異戊醇 (24:1) 抽提 , 取上清液移至干凈管中。7、加 1/10 體積 3mol/L NaAc ，及 . 倍體積預冷（）無水乙醇，混勻。 沉淀 min 。 12000rpm15min ，棄上清8、加 70%乙醇 1ml ，輕輕混勻，12000rpm15min ，棄上清。9、管放置于烘箱中烘干。10、加 ul TE 或 ddH2O 溶解。11、瓊脂糖凝膠電泳檢測注意，實驗室中一般用的1.5ml 的 EP 管，可根據(jù)自己需要按比例調(diào)節(jié)加樣量。DH-5 (pET-28a)的載體質(zhì)粒也可根據(jù)同樣方法提取。1.3.1擴增1.3.2 實驗目的、

9、學習擴增的基本原理。、掌握技術(shù)的常規(guī)操作。、了解擴增的參數(shù)設(shè)計。1.3.3 實驗原理、聚合酶鏈反應 (Polymerase chain reaction ， PCR)：利用核酸變、復性的性質(zhì)，以待擴增的為模板，在體外由引物介導的酶促合成特異片段的過程。、反應體系引物、 dNTP 、 Mg 、模板、Taq DNA 聚合酶，Buffer 。、循環(huán)參數(shù) 9 5min 9 30s 5 30s 72 30s goto times 72 10min1.3.4 器材1，微量移液取樣器，移液器吸頭，0.2ml PCR 微量離心管， PCR 儀，臺式離心機，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，紫外凝膠成像系統(tǒng)2， Taq DN

10、A 聚合酶， PCR 緩沖液，MgCl2 ， dNTP ，引物，模板，ddH2O ，TBE 電泳緩沖液， EB, 加樣緩沖液3，引物：1.3.5 實驗步驟、在 0.2ml PCR 微量離心管中配制dd water10× PCR buffer （不含 MgCl2 ）25mM MgCl210mmol/L dNTP30ul反應體系。10.5ul3ul2ul1ul10 mol/L10 mol/L引物引物121ul1ul模板1ulTaq 酶0.5ul總體積20ul、在離心機中混勻。、管放入儀中，按照原理中的條件設(shè)置程序，進行反應。、 PCR結(jié)束后，取3ul PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測1.

11、4 凝膠電泳法回收目的DNA 及其體外連接1.4.1、實驗目的1. 學習和掌握從瓊脂糖凝膠中回收DNA 片段的方法。2. 掌握 DNA 體外連接的方法。1.4.2，實驗原理1， DNA 分子在瓊脂糖凝膠中的電泳速率與以下因素有關(guān)：DNA 分子大小DNA 分子構(gòu)象瓊脂糖凝膠濃度電泳所用電壓電泳緩沖液2.理純化利用硅膠膜在高鹽濃度時能特異性吸附DNA 。DNA，而在低鹽濃度時可使DNA被洗脫的原3. Taq 酶參與 PCR開發(fā)的 pMD18-T反應中， 產(chǎn)物雙鏈核酸中的3端各多連接一個脫氧腺苷酸A ，與商業(yè)載體可在DNA 連接酶作用下，按照堿基配對形成環(huán)狀的完整質(zhì)粒。1.4.3，儀器1，凝膠電泳系

12、統(tǒng)，刀片，紫外儀，酒精燈，1.5ml EP管， 1.5ml EP管架， 65 水浴鍋2，PCR 產(chǎn)物， 1× TBE ，加樣緩沖液，TakaRa膠回收試劑盒，TA 克隆試劑盒， DL2000marker1.4.4，實驗步驟1， 2%瓊脂糖凝膠電泳2，在紫外燈下用干凈的手術(shù)刀割下含有目的DNA 瓊脂糖塊裝在1.5ml 的 EP 管中稱量減 1 克即為凝膠塊重量3，加入 5 個凝膠體積量的DR- Buffer4，混勻65加熱融化凝膠塊5，加入 DR- Buffer 量的 1/2 體積的 DR- Buffer, 當目的片段小于400bp 再加入終濃度為 20% 的異丙醇6，將上述溶液sho

13、rt 后轉(zhuǎn)移至spin coloumn 中 12000rpm, 1min棄濾液7，加入 500ul RinseA 12000rpm 30s棄濾液8，加入 700ul RinseB 12000rpm 30s 棄濾液9，同 810，將 spin coloumn 安置于新的1.5ml EP 管中在 spin coloumn 膜中央加25ulElutionBuffer放入烘箱1min 12000rpm 1min保存 1.5ml EP 管 1%膠檢測11，鏈接反應（冰上操作）在一支 0.2 ml EP 管中加入以下試劑：純化的目的DNA 片段4.5ulVector0.5ul連接液5ul混勻16連接過夜1

14、.5 DH-5 和 BL-21 感受態(tài)細胞的制備1)將 04 保存的 DH-5 和 BL-21 菌種分別接種在LB 液體培養(yǎng)基中37 下 250 r/min 過夜培養(yǎng) 16 h 。2) 將分別接種過夜菌： LB 按 1:50 的比例接種于 2 mL 的 LB 液體培養(yǎng)基中， 37 活化培養(yǎng)2 3 h至OD=0.3 0.5 。3) 取 1.5 mL 菌液轉(zhuǎn)入 EP管中，置于冰上 10 min, 然后于 4 下 5000 r/min 離心 5 min 。棄上清液， 沉淀加入 0.1 mL 預冷的 0.1 mol/L CaCl 2 緩和懸菌。 冰上放置 15-30 min 后，4 下 5000 r/

15、min 離心 10 min 。4) 棄上清液， 沉淀用 0.1 mL 預冷的 0.1 mol/L CaCl 2（含 15%甘油）緩和懸菌， 放在 20 冰箱內(nèi)保存。1.6 感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化1) 取制備好的感受態(tài)細胞 100 l，冰上解凍，均勻懸浮。2)加入 2 l酶連產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上靜置10-30 min 。3) 42 水浴中熱擊 70 sec后，冰上放置 2 min 。4) 加入 200 l LB 液體培養(yǎng)基， 37 ， 50-100 rpm 振蕩培養(yǎng) 1 h。5) 取 200 l懸浮細胞涂布在含合適抗生素的 LB 固體培養(yǎng)基上， 用涂布器均勻涂布， 平皿正放靜置 1-2 h后，封口膜封

16、好平皿，37 培養(yǎng)倒置12-16 h。1.7 堿法提質(zhì)粒1) 用滅菌吸頭挑取單菌落，浸沒于2 mL 含有抗生素的 LB 液體培養(yǎng)基中， 37 , 180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。2)取 1.5 ml 培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機于4 、 11000 r/min離心 1 分鐘，吸棄上清。3) 向離心管中加入 150 l 用冰預冷的溶液，用微量移液器吹打重懸沉淀。4)加入 200l新配制的溶液，蓋緊管口，快速顛倒離心管5 次，冰上放置5 分鐘。5)加入 150l用冰預冷的溶液，輕輕混勻，冰上放置 35 分鐘。6) 用微量離心機于 4 、 11000 r/min 離心 5 分鐘，吸取上清轉(zhuǎn)移

17、到另一離心管。7)加等體積氯仿400l 抽提，振蕩混勻，用微量離心機于4 、 11000 rpm離心 2 分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。8)吸取上清液300l，向上清中加入2 倍體積的無水乙醇，混勻后，于室溫放置2 分鐘；用微量離心機于4 、 11000 rpm離心 5 分鐘，棄上清。9) 用 70%乙醇洗滌 2 次，再次 4 、 11000 rpm 離心 5 分鐘，沉淀于空氣中干燥。向已干燥的離心管內(nèi)加20l 超純水溶解質(zhì)粒DNA，加入2l 10 mg/ml RNA酶， 37處理1 小時后于 -20貯存。1.8 酶切鑒定1)取提取的質(zhì)粒8l于另一微量離心管中，加入2l Bam H I 和

18、Not I的酶切混合液，輕彈管外混勻反應物。2) 離心，使溶液聚集在管底部。3) 37 ，酶切反應。1.9 瓊脂糖凝膠電泳1)稱取 0.8 g 瓊脂糖，放入到錐形瓶中，加入100 mL 1×TAE 緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全融化，冷卻至60 左右。2)輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻30 分鐘以上。3)將膠板除去封膠帶，加電泳緩沖液至電泳槽中，加液量要使液面沒過膠面1-1.5 毫米，輕輕拔除梳子。4) 吸取 10 l 的質(zhì)粒與 2 l 的上樣液混勻，吸取混合液將加入加樣孔。5)接通電泳槽與電泳儀的電源，設(shè)置電泳數(shù)據(jù)U=100 V, I=30 mA 。6)當溴酚藍

19、染料移動到距凝膠前沿1-2 cm 處，停止電泳。7) 在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果。2.0 PCR-聚合酶鏈式反應1) 將 PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反應體系各成分PCR 反應體系各成分的量模板 DNA0.1lP1(20 mM)0.2lP2(20 mM)0.2ldNTPs(10 mM)0.4lTaq 酶 (5 U/ l)0.2l10×PCR buffer2lddH O16.9l2Total20l2) 將 PCR管放入 PCR儀中，設(shè)定 PCR儀的循環(huán)參數(shù)。預變性95 3 min ，變性 95 30 s，退火 60-55 30 s，延伸 72 1 min 10個循環(huán)，每個循環(huán)降0.5 。變性 95 30 s，退火55 30 s，延伸72 1 min 20 個循環(huán)， 7