中藥中重金屬鎘酶聯(lián)免疫檢測方法

1、發(fā)明專利申請公開說明書發(fā)明名稱定量檢測中藥中重金屬鎘離子含量試劑盒及其檢測方法摘要本發(fā)明屬于免疫學分析技術(shù)領(lǐng)域的一種定量檢測重金屬鎘離子含量的試劑盒及其檢測方法，適用于中藥中重金屬鎘離子殘留的檢測。本試劑盒以高特異性重金屬鎘離子多抗為檢測抗體，采用間接競爭ELISA技術(shù)，測定的基礎(chǔ)是標記免疫反應。其試劑盒包括試劑組和包被板。本發(fā)明靈敏度高，準確性好，結(jié)果穩(wěn)定。檢測方法操作簡單，價格低廉，具有良好的社會效益和經(jīng)濟效益。權(quán)利要求書1. 一種采用間接競爭酶聯(lián)免疫技術(shù)定量檢測中藥中重金屬鎘離子含量的試劑盒，其特征在于：該試劑盒由試劑組和包被板構(gòu)成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測中藥中重金屬鎘離子含

2、量的試劑盒，其特征在于：所述的試劑組為：（1）濃縮PBS緩沖液：40mM 磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，使用時用雙蒸水5倍稀釋； （2）底物A：含過氧化氫脲的乙酸鈉緩沖溶液； （3）底物B：3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的二甲基亞砜溶液； （4）濃縮洗滌液：含1% 吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，使用時用雙蒸水5倍稀釋； （5) 終止液：1.25M的硫酸； （6）重金屬鎘離子標準溶液：將Cd離子與螯合劑EDTA（摩爾比是1：1）充分螯合成500PPM的標準品，使用時用PBS緩沖溶液稀釋成1PPM后，再按1：5稀釋6個梯度。（7）抗體：用PBS將抗體稀釋10000倍；（8）山羊抗兔：將羊抗兔用

3、PBS稀釋20000倍；3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測中藥中重金屬鎘離子含量的試劑盒，其特征在于：包被板為96孔或48孔酶標板，是由Cd-ITCBE-BSA包被抗原包被于酶標板上，然后以每孔100L包被于酶標板中，4過夜，棄去包被溶液后用洗滌液洗板三次，加入200L凍干液封閉1小時，洗滌液洗板四次凍干后真空包裝，于4保存。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的定量檢測中藥中重金屬鎘離子含量的試劑盒，其特征在于：多克隆抗體是選用雄性大耳兔進行五次免疫后，由兔子耳緣靜脈取血進行效價和特異性測定，篩選出具有高效價和特異性的抗血清，然后用Sepharose 4B-Protein A柱親和層析法純化得到的抗體。

4、5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的定量檢測中藥中重金屬鎘離子含量的試劑盒，其特征在于：凍干液為含BSA的Tris-HCl緩沖溶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的定量檢測中藥中重金屬鎘離子含量的試劑盒，其特征在于：包被抗原是按下述方法制備的：取等摩爾的Cd離子與螯合劑ITCBE混合反應,調(diào)節(jié)pH值至7.4.在25下,使用磁力攪拌器攪拌24h,制備得到半抗原。將半抗原與一定量的載體蛋白BSA混合，調(diào)節(jié)PH至9.0.在25下，使用磁力攪拌器攪拌24h后，用5mmol/L的HEPES緩沖溶液透析三天。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測中藥中重金屬鎘離子含量的試劑盒的檢測方法包括以下步驟：說明書定量檢測中藥中重金屬

5、鎘離子含量試劑盒及其檢測方法技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明屬于免疫學分析技術(shù)領(lǐng)域的一種定量檢測重金屬鎘離子含量的試劑盒及其檢測方法，涉及到有機化學合成、免疫化學、生物化學等技術(shù)，適用于中藥中重金屬鎘離子殘留的快速檢測。背景技術(shù)鎘（Cadmium，Cd），第 5 周期，IIB 族，原子序數(shù) 48，相對原子質(zhì)量為112.4。鎘是一種稀有的重金屬元素，與氧、氯、硫等化學元素形成無機化合物。鎘主要以鎘鹽的形式存在。鎘鹽多為無色，但硫化物為黃色或橙色。不同形式鎘的其毒性是不同的。越易溶于水的鎘鹽，對動植物和人體的毒性越高。20 世紀 50 年代日本爆發(fā)了由鎘引起的“骨痛病”事件，此后，類似事件經(jīng)常發(fā)生。1972 年，

6、FAO/WHO 把鎘列為第三位優(yōu)先研究的食品污染物，后美國毒物管理委員會(ATSDR)將其列為第六位危及人類健康的有毒物質(zhì)。鎘在腎臟的一般蓄積量與中毒閾值很接近，安全系數(shù)很低。它的生物半衰期長，排泄緩慢，少量鎘持續(xù)進入體內(nèi)可因長期蓄積而造成各組織器官不同程度的損傷，而且還有致癌、致畸、致突變作用。檢測控制人體對鎘的攝入，是預防和減少鎘對人體危害的重要措施。目前，鎘與健康的研究課題，已經(jīng)在世界上引起廣泛的關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測方法雖然能夠準確測定鎘的含量，但需要專門的儀器設(shè)備，步驟繁瑣，檢測成本高，耗時長，樣品需要經(jīng)過復雜的預處理，需要專門的技術(shù)人員來完成，難以滿足對環(huán)境及市場產(chǎn)品現(xiàn)場快速檢測的要求。

7、重金屬離子免疫檢測是一種新型的檢測方法，與傳統(tǒng)檢測方法相比,具有省時、省力、費用低廉、便于攜帶、易于操作等優(yōu)點。且可以用于重金屬的快速檢測和常規(guī)檢測，發(fā)展和普及應用潛力很大。酶聯(lián)免疫法（Enzyme -linked immunosorbent assay, ELISA）是將重金屬鎘離子與螯合劑反應作為半抗原，通過一定途徑與生物大分子（如蛋白質(zhì)等）載體以共價鍵相偶聯(lián)制備人工抗原，用制備的人工抗原免疫動物，連接在載體上的金屬螯合劑復合物便成為抗原決定簇，被免疫動物產(chǎn)生對該重金屬金屬離子具有特異性的抗體，在此抗體上連接上標記物（酶、熒光物質(zhì)、放射性同位素等），利用抗原抗體特異性反應和抗體上標記物的放

8、大作用， 對樣本中微量重金屬離子殘留物進行定性、定量檢測。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是要克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一個可以定量檢測中藥中重金屬鎘離子含量的試劑盒及檢測方法。該檢測方法的靈敏度可達 g/kg級別。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種采用間接競爭ELISA法技術(shù)定量檢測中藥中重金屬鎘離子含量的試劑盒，其特征在于：該試劑盒由試劑組和96孔包被板構(gòu)成。（1）濃縮PBS緩沖液：40mM 磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，使用時用雙蒸水5倍稀釋； （2）底物A：含過氧化氫脲的乙酸鈉緩沖溶液； （3）底物B：3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的二甲基亞砜溶液； （4）濃縮洗滌液：含1% 吐溫-20

9、的磷酸鹽緩沖溶液，使用時用雙蒸水5倍稀釋； （5) 終止液：1.25M的硫酸； （6）重金屬鎘離子標準溶液：將Cd離子與螯合劑EDTA（摩爾比是1：1）充分螯合成500PPM的標準品，使用時用PBS緩沖溶液稀釋成1PPM后，再按1：5稀釋6個梯度。（7）抗體：用PBS將抗體稀釋10000倍；（8）山羊抗兔：將羊抗兔用PBS稀釋20000倍；上述的包被板為96孔或48孔酶標板，是由Cd-ITCBE-BSA包被抗原包被于酶標板上，然后以每孔100L包被于酶標板中，4過夜，棄去包被溶液后用洗滌液洗板三次，加入200L凍干液封閉1小時，洗滌液洗板四次凍干后真空包裝，于4保存。凍干液為含BSA的Tris

10、-HCl緩沖溶液。上述多克隆抗體是選用雄性大耳兔進行五次免疫后，由兔子耳緣靜脈取血進行效價和特異性測定，篩選出具有高效價和特異性的抗血清，然后用Sepharose 4B-Protein A柱親和層析法純化得到的抗體。上述包被抗原是按下述方法制備的：取等摩爾的Cd離子與螯合劑ITCBE混合反應,調(diào)節(jié)pH值至7.4.在25下,使用磁力攪拌器攪拌24h,制備得到半抗原。將半抗原與一定量的載體蛋白BSA混合，調(diào)節(jié)PH至9.0.在25下，使用磁力攪拌器攪拌24h后，用5mmol/L的HEPES緩沖溶液透析三天。一種定量檢測中藥中重金屬鎘離子含量的試劑盒及其檢測方法包括以下幾個步驟：（1）室溫下中藥的前處

11、理；（2）檢測前，將試劑盒打開，所有試劑和標本都必須在室溫下平衡1-2小時；（3）抗體用PBS緩沖溶液稀釋1萬倍，在包被板上對重金屬鎘離子標準溶液及待測樣品進行雙孔平行加樣（各100µL/孔），同時加入稀釋后的抗體（100µL/孔），空白加200L PBS，搖床上孵育1小時；（4）洗板4次后，每孔加入100L的山羊抗兔，搖床上孵育30min。（5）洗板5次后，每孔中加入體積比為14.6:0.45的底物顯色液A液和液混合液，37顯色20分鐘；（6）加終止液，混勻，在雙波長方式(450-650 nm)下用酶標儀讀取OD值。本發(fā)明的優(yōu)點是：1. 本發(fā)明具有高特異性、靈敏、準確、快

12、速、簡單、廉價，適用范圍廣。可適用于大多數(shù)中藥的檢測，特別是對于成分復雜的中藥，重復性好。并且抗體靈敏度高，制備的抗體和包被抗原穩(wěn)定，具有保藏時間長的優(yōu)點。2. 本發(fā)明提供的快速檢測方法簡便、高效，完成全部檢測工作只需2-3小時，而且精確度能達到90%以上，適合目前現(xiàn)場快速檢測的要求。由于抗體和包被抗原的穩(wěn)定性好，為大規(guī)模樣品的集中檢測提供了極大的方便。3. 本發(fā)明成本低、檢測效率高、可信度好、操作簡便，具有極大的社會效益和經(jīng)濟效益，是一種新型的具有良好應用前景的中藥中重金屬鎘離子殘留檢測的試劑盒。附圖說明圖一為本發(fā)明重金屬鎘離子標準曲線。具體實施方式本發(fā)明通過以下實施例進一步詳述，下述實施例

13、是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。中藥中重金屬鎘離子檢測試劑盒由盒體、包被板及托架構(gòu)成。一種采用間接競爭ELISA法技術(shù)定量檢測中藥中重金屬鎘離子含量的試劑盒的檢測方法包括以下步驟：1. 室溫下樣品的前處理；2. 所有試劑和標品都必須在室溫下平衡1-2小時；3. 抗體用PBS緩沖溶液稀釋1萬倍，在包被板上對重金屬鎘離子標準溶液及待測樣品進行雙孔平行加樣（各100µL/孔），同時加入稀釋后的抗體（100µL/孔），空白加200L PBS，搖床上孵育1小時；4.洗板4次后，每孔加入100L的山羊抗兔，搖床上孵育30min。5.洗板5次后，每孔中加

14、入體積比14.6：0.45為底物顯色液A液和液混合液，37顯色20分鐘；6.加終止液，混勻，在雙波長方式(450-650 nm)下用酶標儀讀取OD值。下面通過兩例來對本發(fā)明的效果進行敘述。（1）檢測中藥白芷中重金屬鎘離子的含量：1. 樣品的前處理：2.打開試劑盒取出包被板，分別將100µL重金屬鎘離子梯度稀釋的標準溶液和100µL樣本提取液雙孔平行加入到包被板中，然后再在標準溶液和樣品提取液中均加入100µL 1萬倍稀釋的抗體溶液，37反應1h；3. 洗板4次后，每孔加入100L的山羊抗兔，搖床上孵育30min。4. 用洗滌液洗板5次，在每孔中加入底物A和B液的混合液150µL，37顯色20min;5. 向各微孔中加入50µL終止液進行終止反應。在雙波長方式下（450-650 nm）用酶標儀讀取OD值，繪制標準曲線圖，對照西維因標準曲線圖得到樣品提取液中西維因的含量。6. 結(jié)果計算1) 抑制率計算公式 (A)IC（%）=1-（A樣品-A空白）/（A對照-A空白）×100.（A）式中： IC(%)重金屬螯合物對抗原抗體結(jié)合反應的抑制率；A 450nm吸光值與650nm吸光值的差值；A樣品重金屬螯合物標準溶液或樣液的平均吸光度值；A空白不加入抗體及重金屬螯合物