絡(luò)氣郁滯證大鼠動物模型的建立和評價

1、絡(luò)氣郁滯證大鼠動物模型的建立和評價                 作者：吳相春，來靜，吳以嶺，賈振華，王洪濤，張秋艷【摘要】   目的建立絡(luò)氣郁滯證大鼠動物模型并進行評價。方法對大鼠慢性束縛6周建立絡(luò)氣郁滯證模型，觀察模型大鼠的精神、飲食量、體質(zhì)量、蔗糖水?dāng)z取量，血清皮質(zhì)酮(CORT)、血漿內(nèi)皮素(ET)，血清5羥色胺(5-HT)、NO以及主動脈內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果絡(luò)氣郁滯證模型表現(xiàn)為精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，攝食量減少，體質(zhì)量增長

2、緩慢，蔗糖水?dāng)z取量、攝食量及體重均明顯低于對照組(P0.05或P0.01);模型組大鼠血漿ET升高、血清CORT升高，5-HT、NO降低(P0.05或P0.01);內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。結(jié)論利用慢性束縛法6周，通過觀測大鼠體質(zhì)量、攝食量、蔗糖水?dāng)z取量、CORT、ET、NO、5-HT的變化，初步建立絡(luò)氣郁滯證大鼠動物模型，制作方法簡單，評價指標(biāo)客觀，為脈絡(luò)血管系統(tǒng)病的研究提供良好的實驗基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】   絡(luò)氣郁滯證; 動物模型Abstract：ObjectiveTo establish and evaluate the rat animal model with colla

3、teral qi stasis. MethodsTo establish animal model with collateral qi stasis in 6 weeks by chronic constraint. To observe the changes of consciousness, appetite, body wght, the intake of cane sugar water, and the levels of CORT, ET, NO, 5-HT. The ultramicrostructure change of aorta was observed by tr

4、ansmission electron microscope. ResultsThe animal model rats showed deprementia, dull,no appetite，increasing slow of body wght，the cane sugar water intake was lowered significantly (P0.01 or P0.05), the levels of CORT,HCY,ET were increased significantly(P0.01 or P0.05)，and the levels of 5-HT,NO were

5、 lowered significantly (P0.01 or P0.05). The ultramicrostructure of aorta changed obviously.ConclusionThe animal model with collateral qi stasis is established with chronic constraint. The method has been succeed through observation the changes of body weight, cane sugar water intake, appetite, CORT

6、，ET，NO，5-HT, and ultramicrostructure of aorta. The method is easy and the evaluated indexes are objective, which provide the good experiment foundation for the study of vessel-collateral and vascular system disorders.Key words：Stasis of collateral qi; Animal model絡(luò)氣郁滯、絡(luò)氣虛滯引起的絡(luò)脈自穩(wěn)狀態(tài)功能異常與血管內(nèi)皮功能障礙具有內(nèi)在一

7、致性，均為“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”的始動因素并貫穿病變?nèi)^程，成為運用絡(luò)病理論研究血管病變的切入點。高同型半胱氨酸血癥是內(nèi)皮功能障礙的獨立危險因素，而應(yīng)激是引起高同型半胱氨酸血癥的主要原因。我們以慢性束縛法建立絡(luò)氣郁滯證大鼠動物模型，進行絡(luò)氣郁滯證候的研究。 1 材料與儀器 1.1 動物及分組健康雄性Wistar大鼠20只，體質(zhì)量200230 g，購于北京維通利華實驗動物中心，大鼠5只/籠，飼養(yǎng)在河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理實驗室，按體重隨機分為兩組，即正常對照組和絡(luò)氣郁滯模型組。正常飼料飲食。1.2 儀器束縛盒：參照朱清靜等 、唐已婷等方法選擇合適的大鼠固定盒，該筒呈管狀，長約25 cm，筒口外徑7

8、cm，內(nèi)徑5 cm，筒內(nèi)前端置一直徑小于筒的內(nèi)徑，并可以前后調(diào)節(jié)的圓嘴的塑料口，其口為通氣口，后端為開關(guān)閘門。尾懸掛架由大鼠實驗架改裝而成。 2 方法 2.1 動物造模方法絡(luò)氣郁滯模型組：參照吳淑慶等4，5的方法，實驗開始時即給予束縛法，將大鼠放入束縛盒內(nèi)，調(diào)節(jié)前端活動部位到合適的位置，使大鼠不產(chǎn)生強烈反抗的緊張程度。每天 6 h(9:0015:00)，連續(xù)6周。2.2 觀察指標(biāo)2.2.1 行為學(xué)觀察 一般情況的監(jiān)測：稱每日攝食量，最后 計算 總攝食量;每周記錄體質(zhì)量1次;觀察模型動物精神、活動情況等。 尾懸掛：參照唐已婷等的方法，于實驗?zāi)y定不動時間、掙扎次數(shù)。1%蔗糖水?dāng)z取量測定：參照熊振

9、芳等、金光亮等的方法，在實驗前先對所有的大鼠進行1%蔗糖水?dāng)z取訓(xùn)練，即先用蔗糖水喂養(yǎng)48 h，隨后斷水24 h，再于晨89時的1 h內(nèi)測量每只大鼠攝取蔗糖水的量，以此作為每只大鼠蔗糖水?dāng)z取量的基線，在實驗?zāi)┯诔?9時測1h內(nèi)的蔗糖水?dāng)z取量。2.2.2 內(nèi)皮功能的檢測采用硝酸還原酶法檢測血清NO含量，試劑盒由南京建成生物試劑公司提供。放免法檢測血漿ET含量，試劑盒由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供。2.2.3 神經(jīng)遞質(zhì)的測定放免法測定皮質(zhì)酮(CORT)，試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供;酶法測定五羥色胺(5-HT)，試劑盒由RapidBio Lab. California USA提供。2.2.

10、4 循環(huán)酶法測定血清同型半胱氨酸(HCY)試劑盒由北京九強生物技術(shù)有限公司提供。2.2.5 主動脈組織內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)實驗結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸總動脈取血后，仔細分離并截取一小段胸主動脈，迅速浸入電鏡液中，修成1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，置4%戊二醛固定液中4保存(由河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)院電鏡室協(xié)助完成)。2.3 學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用±s表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計包進行t檢驗分析。         3 結(jié)果 3.1 大鼠行為學(xué)結(jié)果3.1.1 精神初期絡(luò)氣郁滯模型

11、組大鼠表現(xiàn)為打斗、撕咬、尖叫等情緒過激行為，隨著造模時間的推移，上述過激行為逐漸減少，精神萎靡，胡須下垂，貼邊，扎堆，反應(yīng)遲鈍，毛色失去光澤。3.1.2 日攝食量和總攝食量的變化分別選擇第10，30，40天的日攝食量和總攝食量進行比較，絡(luò)氣郁滯組低于正常對照組，具有顯著性差異(P0.05或P0.01)。見表1。表1 兩組大鼠攝食量的比較與正常組比較，*P0.05，*P0.053.1.3 兩組大鼠體質(zhì)量變化兩組大鼠體質(zhì)量在實驗前未見有明顯差異;在實驗?zāi)?，絡(luò)氣郁滯組(317.18 ±28.69)g 低于對照組(361.80 ±31.33)g，有顯著性差異(P0.01)。3.1.

12、4 1 %蔗糖水?dāng)z取量的變化實驗前兩組1%蔗糖水?dāng)z取量無明顯差異;實驗?zāi)┙j(luò)氣郁滯組較正常組顯著降低，有顯著性差異(P0.01)。見表2。表2 實驗前后兩組蔗糖水?dāng)z取量的變化比較與正常組比較，*P0.01;n=103.1.5 尾懸掛實驗絡(luò)氣郁滯組較對照組不動時間明顯增加，掙扎次數(shù)明顯減少，具有顯著性差異(P0.01)。見表3。表3 兩組之間大鼠尾懸掛實驗比較與正常組比較，*P0.01;n=103.2 血清HCY的變化絡(luò)氣郁滯組血清HCY水平(12.72±1.33)mol/L較正常組(10.18±1.68 )mol/L顯著增高，具有學(xué)差異(P0.01)。3.3 大鼠血清5-HT

13、、CORT的變化絡(luò)氣郁滯組5-HT較正常組明顯下降，CORT明顯增高，有顯著性差異(P0.01)。見表4。表4 兩組之間5-HT、CORT的變化比較與正常組比較，*P0.01;n=103.4 大鼠內(nèi)皮功能的變化絡(luò)氣郁滯組較正常組ET增高、NO降低(P0.05或P0.01)。見表5。表5 兩組間ET、NO比較與正常組比較，*P0.05，*P0.05;n=103.5 主動脈超微結(jié)構(gòu)改變正常對照組血管內(nèi)皮細胞形態(tài)規(guī)則，連接緊密，基底膜完整，細胞核及細胞器存在，線粒體結(jié)構(gòu)無異常。絡(luò)氣郁滯組，內(nèi)皮細胞線粒體大部分嵴和部分膜融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，脫顆粒明顯，吞飲小泡數(shù)量明顯減少。 4 討論 大量研究

14、資料表明，應(yīng)激在心血管發(fā)病機制中起著重要作用。高同型半胱氨酸血癥是內(nèi)皮功能障礙的獨立危險因素，而應(yīng)激是引起高同型半胱氨酸血癥的重要原因，Allan等用模擬應(yīng)激的束縛應(yīng)激持續(xù)1 h可顯著升高大鼠血漿Hcy水平，但游泳和冷刺激雖然都能導(dǎo)致HPA軸的激活，但不能升高大鼠血漿Hcy的水平。有研究證實知識分子血漿同型半胱氨酸水平普遍增高10。本研究采用慢性束縛應(yīng)激方法建立絡(luò)氣郁滯證動物模型，結(jié)果顯示，絡(luò)氣郁滯證大鼠日攝食量明顯減少，體質(zhì)量增長緩慢，尾懸掛實驗不動時間延長，掙扎次數(shù)減少，蔗糖水?dāng)z取量減少;模型大鼠應(yīng)激激素CORT水平升高，使HPA軸興奮;模型大鼠5-HT降低;ET增高，NO明顯下降，血清H

15、CY增高，主動脈組織內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。表明慢性束縛可明顯影響動物的攝食量、體質(zhì)量及行為學(xué)的改變，損傷血管內(nèi)皮功能，顯示出絡(luò)氣郁滯證候因素可以造成血管內(nèi)皮的損傷，是導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙的重要危險因素，在血管病變發(fā)生 過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)合相關(guān)疾病(內(nèi)皮功能障礙)和相關(guān)證(絡(luò)氣郁滯)的 認識，初步建立了基本符合中醫(yī)絡(luò)病理論的絡(luò)氣郁滯證大鼠動物模型，以攝食量、體質(zhì)量、蔗糖水?dāng)z取量、尾懸掛試驗、CORT、5-HT、 ET、NO等作為評價指標(biāo)，制作方法簡單，評價指標(biāo)客觀，為脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病的研究提供實驗基礎(chǔ)。【 參考 文獻 】 吳以嶺. “脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”新概念及其 治療 探討J.

16、 疑難病雜志, 2005, 4(5):285.朱清靜, 羅欣拉, 熊振芳. 柴胡疏肝散對慢性束縛應(yīng)激性肝郁證大鼠下丘腦垂體腎上腺軸的調(diào)節(jié)作用J.湖北中醫(yī)雜志, 2003, 25(13):7.唐已婷, 陳家旭. 三種中藥復(fù)方對慢性束縛應(yīng)激大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸的調(diào)節(jié)J.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2002, 25(3):23.吳淑慶, 錢令嘉. 應(yīng)激大鼠血漿同型半胱氨酸水平的變化及其對心功能的影響J. 中國 危重病急救, 2001, 13( 3):137.吳淑慶, 錢令嘉. 應(yīng)激對同型半胱氨酸代謝的負性調(diào)節(jié)J.生 報, 2004, 56( 4)：521.熊振芳，朱清靜.柴胡疏肝散對慢性束縛應(yīng)激性肝郁證大鼠的影響J.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2004，12(4)：220.金光亮, 南 睿. 郭霞珍. 慢性應(yīng)激肝郁證大鼠模型的建立J. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2003, 26( 2):18.劉 衛(wèi), 錢令嘉. 同型半胱氨酸與抑郁J.國際精神病學(xué)雜志, 2006,