子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型再評(píng)價(jià)

1、 子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型再評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜異位癥 （內(nèi)異癥） 是指有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外的身體其他部位的疾病。是一種激素依賴(lài)性、 出血性、 炎癥性、 遺傳性疾病， 臨床癥狀可表現(xiàn)為盆腔痛、 月經(jīng)失調(diào)、 不孕、 盆腔包塊等 1。自1860年首次報(bào)道該病以來(lái)， 其發(fā)病機(jī)理至今尚未完全明了， 它仍是令婦科專(zhuān)家們 “迷惑的疾病” 。根據(jù)近年來(lái)的研究顯示， 內(nèi)分泌異常改變有利于子宮內(nèi)膜移位種植， 未成熟卵泡黃素化可能是發(fā)生內(nèi)異癥的病因之一?；颊叱０橛屑?xì)胞和體液免疫功能的異常， 有部分免疫球蛋白與補(bǔ)體的變化及細(xì)胞免疫反應(yīng)異常， 患者的血中與腹腔液中可發(fā)現(xiàn)多種自身抗體。加強(qiáng)對(duì)本病的基礎(chǔ)

2、研究， 特別是建立理想的動(dòng)物模型模擬人類(lèi)內(nèi)異癥， 以便進(jìn)行反復(fù)的、 可控的實(shí)驗(yàn)， 在動(dòng)物身上進(jìn)行病因病理、 藥物治療等的研究， 才能有助于盡快地攻克此病。 文獻(xiàn)一 子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型的構(gòu)建1、材料與方法1. 1標(biāo)本來(lái)源2002 年 4月至 2002年 7 月因 EM 入我院婦產(chǎn)科行腹腔鏡診治的患者 8 例。 術(shù)后病理均證實(shí)為 EM, 取其在位內(nèi)膜及腹腔內(nèi)膜異位囊腫壁。1. 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1SCID 小鼠, 雌性, 8 周齡, 體重 20 25g,46只, 由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 SPF(specific -pathogen free) 條件飼養(yǎng)。1. 3方法1. 3. 1 標(biāo)本處理

3、 標(biāo)本置入盛有 4ml DMEM 培養(yǎng)液(含100U/ml 青霉素, 100U/ml鏈霉素) 無(wú)菌瓶后, 置于冰壺, 快速送入實(shí)驗(yàn)室接種( 1h 內(nèi), 否則影響接種成功率) 1。 標(biāo)本用0. 1mol/L 的無(wú)菌 PBS漂洗 3 次, 盡量洗去血塊和粘液。 然后于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)等量分置, 分裝入盛有 D MEM 液的無(wú)菌管內(nèi), 準(zhǔn)備接種。1. 3. 2動(dòng)物處理用 1%的戊巴比妥鈉約 0. 07ml 腹腔注射麻醉 SCID 小鼠, 待小鼠麻醉后固定于操作板上, 腹部酒精消毒備皮, 夾起腹部皮膚, 用無(wú)菌小彎剪剪開(kāi) 0. 5cm 長(zhǎng)的小口,將已備標(biāo)本種植于皮下, 無(wú)菌絲線縫合及紗布包裹。 種植后第

4、2天, 于小鼠腿部肌肉注射 0. 02 ml( 1mg/ml)苯甲酸雌二醇, 以促進(jìn)種植內(nèi)膜的生長(zhǎng) 2。1. 3. 3動(dòng)物分組將在位內(nèi)膜種植于 SCID 小鼠腹部皮下,為在位內(nèi)膜組, 再分為 2 周組、4 周組、6 周組、8 周組, 每組10只 。取 SCID 小鼠 6 只將巧克力囊壁種植于其腹部皮下,為異位內(nèi)膜組。2 結(jié) 果2. 1 種植成功率 除去非手術(shù)原因死去的小鼠外 ,44 只成活小鼠病灶均種植成功 ,成功率為 100%。2. 2 在位內(nèi)膜組 分別于 2周 、 4 周、 6 周、 8 周從小鼠的腹部皮下取出病灶, 常規(guī)石蠟包埋 ,HE染色, 可見(jiàn)明顯的腺體和間質(zhì) 。由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)

5、生鑒定為子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì) 。光鏡下 ,各組間形態(tài)學(xué)無(wú)明顯差異。2. 3 異位內(nèi)膜組 種植巧克力囊壁的病灶 ,HE 染色切片未見(jiàn)腺體和間質(zhì), 卻見(jiàn)豐富的纖維結(jié)締組織 ,經(jīng)病理科醫(yī)生鑒定可能為卵巢的纖維組織。文獻(xiàn)二 自體移植法復(fù)制大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型*實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1.普通級(jí)雌性成熟未交配過(guò)的 SD 大鼠 30 只, 體重180- 220 g.2. 造模方法12.1 篩選合格大鼠 所有雌性大鼠每日進(jìn)行陰道細(xì)胞涂片檢查, 選擇動(dòng)情周期 4- 5 d 的大鼠, 隨機(jī)分為模型組及假手術(shù)組。在第三個(gè)動(dòng)情周期的動(dòng)情期, 將大鼠進(jìn)行自體移植法手術(shù)造模及假手術(shù)。2.2 手術(shù)在無(wú)菌條件下, 以 1% 的戊巴比妥鈉

6、( 40mg/ kg, ip) 麻醉, 然后固定大鼠四肢, 剖腹, 切口長(zhǎng)約1-5 cm, 切取右側(cè)宮角處的一段子宮, 長(zhǎng)約 1 cm, 迅速將其置于生理鹽水中, 將子宮內(nèi)膜與肌層分離, 并剪取兩塊各約 5 mm的內(nèi)膜組織塊, 將上皮層反向?qū)χw壁, 將組織塊四角縫固在腹壁上, 左右各一。右側(cè)宮角斷端吻合結(jié)扎。關(guān)腹前予以慶大霉素生理鹽水溶液沖洗腹腔, 最后縫合各層組織, 普通級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。4周后再次剖腹觀察移植物生長(zhǎng)狀況, 發(fā)現(xiàn)移植物體積增大, 出現(xiàn)液體積聚, 移植物被結(jié)締組織或大網(wǎng)膜覆蓋并有血管形成。同時(shí)切取移植物送檢, 證實(shí)移植物中有子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、 腺體及間質(zhì)的生長(zhǎng), 并有分泌活動(dòng)。說(shuō)明

7、造模成功。2.3 假手術(shù)組處理方法 手術(shù)條件及麻醉、 開(kāi)腹方法均同 EMT 模型組, 開(kāi)腹后將右側(cè)子宮角結(jié)扎, 目的使假手術(shù)組達(dá)到與 EMT 組均為單側(cè)宮角子宮的生殖環(huán)境。同樣以慶大霉素生理鹽水沖洗腹腔, 逐層縫合各層組織。 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均同樣環(huán)境飼養(yǎng)。3 觀測(cè)指標(biāo) 以陰道細(xì)胞涂片法分別觀察兩組大鼠造模后 4周、 8 周性周期的情況, 觀察內(nèi)容包括是否存在動(dòng)情間期、 動(dòng)情前期、 動(dòng)情期、 動(dòng)情后期的周期性變化即是否有排卵跡象、 周期時(shí)間長(zhǎng)短等。于造模后 8 周各組均于動(dòng)情期取 3 只實(shí)驗(yàn)大鼠, 假手術(shù)組取在位子宮內(nèi)膜組織, 模型組取在位及異位內(nèi)膜組織, 均以 75% 乙醇固定, 行石蠟病理切片

8、, 進(jìn)行觀察。結(jié) 果1、子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠性周期的研究 選取性周期規(guī)則且周期時(shí)間為 4- 5 天的大鼠。別進(jìn)行自體移植法造子宮內(nèi)膜異位癥模型及假手術(shù), 兩組動(dòng)物各 13 只, 研究結(jié)果表明, 造模 4 周內(nèi)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠及假手術(shù)大鼠性周期均無(wú)顯著變化。而造模 8 周后再觀察性周期, 此時(shí) EMT 模型組有 2 只大鼠發(fā)生性周期改變, 性周期改變率15-38%, 且兩只失去正常性周期的大鼠均表現(xiàn)為性周期延長(zhǎng), 分別變?yōu)?6 d、 7 d, 仍有動(dòng)情間期、 動(dòng)情前期、 動(dòng)情期、 動(dòng)情后期的變化, 但動(dòng)情間期時(shí)間延長(zhǎng)。而假手術(shù)對(duì)大鼠性周期無(wú)影響, 手術(shù)后 8 周, 13 只大鼠仍保持原性

9、周期。2 子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠動(dòng)情期在位、 異位子宮內(nèi)膜的病理分析 假手術(shù)組 大鼠在位內(nèi)膜組織呈分泌早期改變, 內(nèi)膜較厚, 多數(shù)腺上皮見(jiàn)核下空泡, 間質(zhì)血管較豐富, 間質(zhì)細(xì)胞輕度疏松。同樣是處在動(dòng)情期的 EMT 模型組 大鼠,在位內(nèi)膜發(fā)育相對(duì)略遲于假手術(shù)組, 部分腺上皮見(jiàn)核下空泡, 但仍有少量腺上皮呈假?gòu)?fù)層排列, 間質(zhì)亦相對(duì)較致密。EMT 模型組( 圖 3) 異位內(nèi)膜較薄, 發(fā)育又遲于其在位內(nèi)膜, 腺體呈囊狀, 腺上皮較少, 僅少量見(jiàn)核下空泡, 腺腔內(nèi)有分泌物潴留, 間質(zhì)相對(duì)于在位者致密。文獻(xiàn)三 建立裸鼠皮下熒光子宮內(nèi)膜異位癥模型1 材料和方法 材料： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雌性裸鼠 18 只，6

10、-8 周齡，體質(zhì)量 17-20 g。實(shí)驗(yàn)方法： 動(dòng)物分組：將18只雌性裸鼠隨機(jī)分成3組，第1組6只接受增強(qiáng)型綠色熒光蛋白腺病毒轉(zhuǎn)染的裸鼠子宮內(nèi)膜的種植(簡(jiǎn)稱(chēng)為轉(zhuǎn)染熒光組)，第2組6只接受裸鼠子宮內(nèi)膜的移植作為對(duì)照組， 第3組6只作為供體用于取子宮內(nèi)膜。 子宮內(nèi)膜標(biāo)本處理： 4%水合氯醛以 0.01 mL/g對(duì)裸鼠行腹腔注射麻醉，將其仰臥固定于操作板上，腹部乙醇消毒，自腹中線臍下方做一長(zhǎng)約 2 cm的切口，進(jìn)入腹腔取出供體小鼠子宮，小心剝?nèi)プ訉m肌層，分離出子宮內(nèi)膜，立即用無(wú)菌PBS在培養(yǎng)皿上漂洗數(shù)次，眼科剪剪成1 mm左右大小組織粒置入5 mL離心管，500 r/min，離心5 min后棄上清液

11、，將底層內(nèi)膜組織塊置于24孔板的孔內(nèi)，加入DMEM/F12培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素，10 nmol/L 17-雌二醇、整合了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的復(fù)制缺陷腺病毒顆粒，在37 ，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2環(huán)境下感染16 h后將子宮內(nèi)膜組織收集，用含體積分?jǐn)?shù)為2%胎牛血清的PBS洗3遍后置于300 L含體積分?jǐn)?shù)為2%胎牛血清的PBS中。將組織塊用胰酶消化后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)其轉(zhuǎn)染率及凋亡率。以上手術(shù)過(guò)程均為無(wú)菌操作。 裸鼠熒光子宮內(nèi)膜異位癥模型制作與觀察：將轉(zhuǎn)染16 h裸鼠內(nèi)膜組織塊收集于一1.5 mL Ep管中，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，將1 mm3大小的組織

12、塊5片注射到轉(zhuǎn)染熒光組裸鼠腹部皮下，將沒(méi)有接受增強(qiáng)型綠色熒光蛋白腺病毒轉(zhuǎn)染的子宮內(nèi)膜組織塊注射到對(duì)照組裸鼠腹部皮下，建立對(duì)照組裸鼠模型，種植后每5 d肌肉注射苯甲酸雌二醇2 mg/kg，于裸鼠注射后第 5，10，15，20，25，30天進(jìn)行體視熒光顯微鏡觀察。當(dāng)病灶體外熒光完全不能探測(cè)到時(shí)，頸椎脫臼法處死裸鼠，解剖動(dòng)物獲取病灶進(jìn)行病理組織學(xué)蘇木精-伊紅染色。 主要觀察指標(biāo)：免疫熒光檢測(cè)法比較兩組動(dòng)物病灶熒光信號(hào)、持續(xù)時(shí)間及兩組異位病灶的大體形態(tài)，組織學(xué)表現(xiàn)。 2 結(jié)果 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 12只裸鼠，成功構(gòu)建5個(gè)熒光內(nèi)膜異位癥活體裸鼠模型及5個(gè)非熒光內(nèi)膜異位癥活體裸鼠模型，并進(jìn)入結(jié)果分析

13、，中途無(wú)脫落。 2.2 轉(zhuǎn)染熒光組和對(duì)照組裸鼠皮下內(nèi)異病灶體外形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 12只裸鼠，成模10只，平均每只裸鼠形成二三個(gè)病灶。兩組均能產(chǎn)生典型內(nèi)膜異位癥種植病灶，異位灶主要附著于腹膜處或皮下肌層，外觀表現(xiàn)為透明結(jié)節(jié)狀或囊狀病灶，囊內(nèi)有清亮的液體積聚，可有較豐富的小血管供養(yǎng)病灶，將其表面的皮膚掀開(kāi)后發(fā)現(xiàn)，異位灶和周?chē)M織可有輕微粘連，大體觀察很難判斷和定位的異位病灶在熒光下可以較容易定位。2.3 體視熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察病灶熒光面積和強(qiáng)度均能通過(guò)活體動(dòng)物的皮膚觀察到裸鼠皮下病灶發(fā)出的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白熒光；熒光在1周左右時(shí)最強(qiáng)，此后病灶熒光面積和強(qiáng)度隨種植時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減弱，熒光觀察時(shí)間約4周左

14、右。而對(duì)照組均未檢測(cè)到綠色熒光病灶。2.4 轉(zhuǎn)染熒光組和對(duì)照組裸鼠皮下內(nèi)膜異位病灶經(jīng)蘇木精-伊紅染色后的組織學(xué)表現(xiàn) 兩組裸鼠皮下內(nèi)膜異位病灶經(jīng)蘇木精-伊紅染色，均可見(jiàn)典型的子宮內(nèi)膜腺體和基本結(jié)構(gòu)。 討論與再評(píng)價(jià)1 三種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的比較 大鼠和小鼠均為嚙齒類(lèi)動(dòng)物, 繁殖力強(qiáng), 性周期短而規(guī)律。雌性大鼠對(duì)性激素感受性高, 因而對(duì)移植內(nèi)膜的成活及周期性變化極為有利 ,建立模型多選用 SD大鼠,國(guó)內(nèi)外均有相關(guān)的建模報(bào)道 ,成模率較高, 達(dá) 80% 90%。用小鼠建立 EM動(dòng)物模型時(shí), 使用最多的是免疫缺陷小鼠, 包括裸鼠、 SCID 小鼠 。裸小鼠先天性無(wú)胸腺 ,T 淋巴細(xì)胞功能缺陷 , 細(xì)胞免疫力低下

15、, 但 B細(xì)胞功能基本正常 ,NK 細(xì)胞活性較高 。國(guó)內(nèi)外均已用裸鼠成功建模SCID 小鼠是嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠,為先天性 T 、B 淋巴細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷動(dòng)物,用其進(jìn)行移植后成活率較裸小鼠高。國(guó)外已將SCID小鼠作為人子宮內(nèi)膜組織的受體動(dòng)物。免疫缺陷小鼠能克服異種間的排斥反應(yīng), 接受人類(lèi)正常和腫瘤組織的移植, 且種植后的組織仍保持原有的組織形態(tài)及生化特征 ; 但是由于其免疫功能缺陷 ,不能用來(lái)研究機(jī)體免疫方面的改變,且不能耐受多次手術(shù)和采血檢驗(yàn) 。大鼠和小鼠都是周期性地自發(fā)排卵 ,但是子宮內(nèi)膜不發(fā)生脫落, 不能自發(fā)性發(fā)EM。2、三種建模方法比較 異體移植與自體移植文獻(xiàn)一與三是異體種植: 異體移

16、植是將人子宮內(nèi)膜組織種植到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)。21文獻(xiàn)一中SCID小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立方法 腹腔注射法的成功率為 96 . 5%100%,種植物保持原組織學(xué)的基本特征 , 它可在小鼠體內(nèi)存活10 周。皮下種植法:其種植的成功率及種植物的組織形態(tài)學(xué)同腹腔注射法。腹腔雖更能代表子宮內(nèi)膜異位癥的臨床好發(fā)部位, 但觀察及測(cè)量病灶有一定難度 ,須采用較精密的儀器 。皮下種植法則可直接觀察種植物的大小 ,有直觀且操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用腹部皮下移植法 ,選取異位癥患者分泌期在位內(nèi)膜種植于 SCID 小鼠腹部皮下 , 于 2 周 、4周 、 6 周、 8 周取出種植物, 經(jīng) HE 染色, 光鏡下可見(jiàn)明顯

17、的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì) ,隨著種植時(shí)間延長(zhǎng) ,內(nèi)膜腺體和間質(zhì)的結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變 。種植巧克力囊壁的病灶,HE 染色未見(jiàn)腺體和間質(zhì), 卻見(jiàn)豐富的纖維結(jié)締組織 。原因可能與選材有關(guān), 所選人的異位病灶中已有壞死表現(xiàn), 而與其相連未剝凈的卵巢組織活性仍好 ,因此為卵巢纖維組織種植成功 。在巧克力囊壁中,因反復(fù)出血導(dǎo)致異位內(nèi)膜細(xì)胞活力減低,增殖能力差 ,種植不易成活 ,即使成活也以纖維結(jié)締組織占優(yōu)勢(shì), 因而作為建立異位癥動(dòng)物模型的標(biāo)本來(lái)源 ,在 SCID 小鼠身上種植并生長(zhǎng)有難度。國(guó)外有用小刀刮取巧克力囊內(nèi)壁的異位組織種植于裸鼠腹部皮下,異位組織成活并保持了內(nèi)膜腺體和間質(zhì)特性的報(bào)道。由此可見(jiàn) , 異位組織

18、種植成功與否關(guān)鍵在于取材 。2.2文獻(xiàn)三建模法傳統(tǒng)的動(dòng)物模型常需階段性的解剖動(dòng)物獲取病灶進(jìn)行研究，因而難以無(wú)創(chuàng)而連續(xù)的評(píng)價(jià)藥物對(duì)內(nèi)膜異位病灶的影響。針對(duì)這一不足，有學(xué)者應(yīng)用磁共振成像及核素顯像等影像學(xué)等手段對(duì)病灶部位進(jìn)行檢測(cè)，還有學(xué)者利用綠色熒光蛋白技術(shù)，構(gòu)建出可無(wú)創(chuàng)觀察的改良內(nèi)異癥動(dòng)物模型。 綠色熒光蛋白是一種在海洋生物水母中發(fā)現(xiàn)的，能在多種生物體內(nèi)表達(dá)并發(fā)出明亮綠色熒光的蛋白質(zhì)。能在活細(xì)胞中直觀地觀察其表達(dá)，性質(zhì)十分穩(wěn)定。將其作為細(xì)胞的標(biāo)記物，具有檢測(cè)方便、表達(dá)穩(wěn)定、無(wú)毒害性和不影響細(xì)胞功能等優(yōu)點(diǎn)。不需要做任何預(yù)處理就可以用儀器直接檢測(cè)到熒光，對(duì)活的細(xì)胞、組織、器官進(jìn)行觀察，又具有動(dòng)態(tài)觀察的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)將裸鼠子宮內(nèi)膜與編碼綠色熒光蛋白的腺病毒孵育，流式細(xì)胞儀測(cè)得腺病毒可轉(zhuǎn)染20%-50%的內(nèi)膜細(xì)胞。將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染的子宮內(nèi)膜小片段注射入同周齡同系裸鼠的皮下，移植1周左右轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的裸鼠異位內(nèi)膜在熒光體視鏡下經(jīng)藍(lán)光激發(fā)出綠色熒光，明顯區(qū)別于周?chē)槐磉_(dá)綠色熒光蛋白的組織，故可以更加靈敏的檢測(cè)并定位內(nèi)膜異位癥病灶，同時(shí)通過(guò)皮膚可以無(wú)創(chuàng)而動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)異位病灶的形成和發(fā)展。結(jié)果顯示病灶熒光面積和強(qiáng)度隨種植時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減弱，于裸鼠移植3周后， 內(nèi)膜異位病灶開(kāi)始有萎縮趨勢(shì)， 組織熒光逐漸減弱，這提示在移植后二三周內(nèi)通過(guò)活體動(dòng)物的皮膚反復(fù)觀察子宮內(nèi)膜異