細(xì)菌檢驗技術(shù)

1、第五章第五章細(xì)菌檢驗技術(shù)細(xì)菌檢驗技術(shù)第一節(jié)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗技術(shù)細(xì)菌形態(tài)檢驗技術(shù)一、細(xì)菌染色標(biāo)本鏡檢（一）染色標(biāo)本檢查的基本程序 1、涂片 2、干燥 3、固定 4、染色 染料種類：堿性染料、酸性染料、中性染 料，堿性染料最常用 （1）單染法 用一種染料進(jìn)行染色，可觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)和排列，但不能用于鑒別細(xì)菌。如：亞甲藍(lán)染色法（2）復(fù)染法 用兩種或兩種以上的染料進(jìn)行染色，不僅可以觀察細(xì)菌的大小、形態(tài)和排列。還可用于鑒別細(xì)菌，又稱為鑒別染色。 鑒別染色革蘭染色 抗酸染色 復(fù)染法的一般步驟 初染媒染脫色復(fù)染5、鏡檢 顯微鏡：光學(xué)顯微鏡 所用放大倍數(shù)：101001000 所用鏡頭：油鏡頭 鏡油：香柏

2、油或石蠟油 香柏油折光率（n1.515）與玻片折光率（n1.52）接近 顯微鏡使用完畢須擦拭鏡頭。（二）革蘭染色法 1、染液組成： 結(jié)晶紫染液、盧戈碘液、95乙醇、稀釋復(fù)紅 2、染色方法、染色方法 標(biāo)本涂片，固定 結(jié)晶紫初染 （1分鐘） 碘液媒染（1分鐘） 95%乙醇脫色（30秒） 復(fù)紅復(fù)染（3-5分鐘） 3、染色結(jié)果 蘭陽性菌（G+）紫色； 革蘭陰性菌 (G-) 紅色。4、染色原理（1）滲透學(xué)說：與肽聚糖結(jié)構(gòu)有關(guān) G菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成一種透性屏障，當(dāng)乙醇脫色時，肽聚糖脫水而孔障縮小，故保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物在細(xì)胞膜上。呈紫色。 G菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮

3、，其脂含量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，復(fù)紅復(fù)染后呈紅色。（2）化學(xué)學(xué)說：與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中核糖核酸鎂鹽有關(guān)（3）等電點(diǎn)學(xué)說：與細(xì)菌所帶電荷有關(guān)5、臨床意義 鑒別細(xì)菌 選擇用藥 理解細(xì)菌的致病作用 6、影響因素 （1）操作因素涂片的厚薄脫色時間的長短 （2）染液因素盧戈碘液放置時間過長 95乙醇揮發(fā)結(jié)晶紫與草酸銨混合時間太長 （3）細(xì)菌因素： 細(xì)菌種類、 細(xì)菌菌齡（三）抗酸染色法用于鑒別抗酸桿菌和非抗酸桿菌步驟：1、苯酚復(fù)紅加溫染色 2、鹽酸酒精脫色 3、亞甲藍(lán)復(fù)染結(jié)果：抗酸桿菌為紅色 非抗酸桿菌為藍(lán)色（四）其他染色法 1、特殊結(jié)構(gòu)染色法2、負(fù)染色法3、熒光染色二、細(xì)菌不

4、染色標(biāo)本鏡檢二、細(xì)菌不染色標(biāo)本鏡檢 應(yīng)用：主要用于觀察活菌的動力和運(yùn)動方應(yīng)用：主要用于觀察活菌的動力和運(yùn)動方式式 常用方法：壓滴法、懸滴法、暗視野映光常用方法：壓滴法、懸滴法、暗視野映光法法壓滴法載玻片載玻片細(xì)菌懸液細(xì)菌懸液蓋玻片蓋玻片懸滴法鏡檢鏡檢3、暗視野聚光法、暗視野聚光法4、相差顯微鏡檢查法、相差顯微鏡檢查法（二）影響因素（二）影響因素1、操作因素、操作因素2、玻片因素、玻片因素3、光線強(qiáng)度、光線強(qiáng)度第二節(jié)第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)一、基本條件一、基本條件（一）接種環(huán)與接種針（一）接種環(huán)與接種針 用于取菌、接種及分離細(xì)菌的器具用于取菌、接種及分離細(xì)菌的器具 1、接種針用

5、于挑去單個菌落、穿刺接種及、接種針用于挑去單個菌落、穿刺接種及斜面接種斜面接種 2、接種環(huán)用于劃線分離培養(yǎng)、純種接種、接種環(huán)用于劃線分離培養(yǎng)、純種接種、挑取菌落和菌液以及制備細(xì)菌涂片。挑取菌落和菌液以及制備細(xì)菌涂片。3、接種前后都應(yīng)對接種環(huán)和接種針進(jìn)行滅菌、接種前后都應(yīng)對接種環(huán)和接種針進(jìn)行滅菌（二）紅外接種環(huán)滅菌器（二）紅外接種環(huán)滅菌器 利用紅外線產(chǎn)熱進(jìn)行滅菌利用紅外線產(chǎn)熱進(jìn)行滅菌（三）培養(yǎng)皿（三）培養(yǎng)皿 制備固體培養(yǎng)基常用的器皿，用于細(xì)菌的制備固體培養(yǎng)基常用的器皿，用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)。分離培養(yǎng)。附：微生物檢驗常用玻璃儀器的準(zhǔn)備附：微生物檢驗常用玻璃儀器的準(zhǔn)備 1、玻璃器材的種類及用途、玻璃器

6、材的種類及用途2、玻璃器皿滅菌前的準(zhǔn)備、玻璃器皿滅菌前的準(zhǔn)備 玻璃器皿在清洗、干燥后必須經(jīng)正確的包玻璃器皿在清洗、干燥后必須經(jīng)正確的包裹和加塞后才能進(jìn)行滅菌處理。裹和加塞后才能進(jìn)行滅菌處理。 3、玻璃器材的清洗、玻璃器材的清洗新購置的玻璃器材：新購置的玻璃器材：12鹽酸浸泡鹽酸浸泡清水清水清洗清洗用過的無污染器皿：洗滌劑洗刷用過的無污染器皿：洗滌劑洗刷清水清洗清水清洗 細(xì)菌污染的器材：消毒滅菌后再洗刷細(xì)菌污染的器材：消毒滅菌后再洗刷盛培養(yǎng)基試管和平皿：高壓滅菌盛培養(yǎng)基試管和平皿：高壓滅菌趁熱倒出趁熱倒出洗滌劑洗刷洗滌劑洗刷清水沖洗清水沖洗吸管：吸管：3來蘇浸泡來蘇浸泡清水沖洗清水沖洗玻片和蓋玻

7、片：玻片和蓋玻片：3來蘇和清潔液浸泡來蘇和清潔液浸泡清水清水沖洗；染色后的玻片，應(yīng)肥皂水煮沸沖洗；染色后的玻片，應(yīng)肥皂水煮沸10min再洗再洗滌滌含油脂的器皿：單獨(dú)滅菌含油脂的器皿：單獨(dú)滅菌（四）培養(yǎng)箱（四）培養(yǎng)箱 1、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱 2、二氧化碳培養(yǎng)箱、二氧化碳培養(yǎng)箱 3、厭氧培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)箱（五）培養(yǎng)基（五）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基：是指人工配制的適合細(xì)菌生長繁培養(yǎng)基：是指人工配制的適合細(xì)菌生長繁殖的綜合營養(yǎng)基質(zhì)。殖的綜合營養(yǎng)基質(zhì)。 1、培養(yǎng)基的成分及作用、培養(yǎng)基的成分及作用 營養(yǎng)物質(zhì)：肉浸液、牛肉膏、糖醇類、血營養(yǎng)物質(zhì)：肉浸液、牛肉膏、糖醇類、血液、雞蛋和動物血清、生長因子、無機(jī)

8、鹽液、雞蛋和動物血清、生長因子、無機(jī)鹽 水水 凝固劑：瓊脂、明膠凝固劑：瓊脂、明膠 抑制劑抑制劑 指示劑指示劑2、培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)基的種類（1）按培養(yǎng)基的物理性狀分類）按培養(yǎng)基的物理性狀分類 液體培養(yǎng)基：不含凝固劑，用于增菌和接液體培養(yǎng)基：不含凝固劑，用于增菌和接種純種細(xì)菌。種純種細(xì)菌。 半固體培養(yǎng)基：含半固體培養(yǎng)基：含0.30.5瓊脂，用于瓊脂，用于觀察細(xì)菌的動力。觀察細(xì)菌的動力。 固體培養(yǎng)基：含固體培養(yǎng)基：含22.5瓊脂，多用于瓊脂，多用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)。細(xì)菌的分離培養(yǎng)。（2）按培養(yǎng)基的用途分類）按培養(yǎng)基的用途分類 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基：培養(yǎng)營養(yǎng)要求不高的細(xì)菌，：培養(yǎng)營養(yǎng)要求不高的細(xì)菌，

9、如普通平板如普通平板 營養(yǎng)培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)基：能滿足營養(yǎng)需求較高細(xì)菌的：能滿足營養(yǎng)需求較高細(xì)菌的生長，如血平板生長，如血平板 鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基：含有某些特定的底物，用于：含有某些特定的底物，用于鑒別細(xì)菌，如克氏雙糖培養(yǎng)基（鑒別細(xì)菌，如克氏雙糖培養(yǎng)基（KIA） 選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：具有選擇性抑制作用，用于：具有選擇性抑制作用，用于選擇性的培養(yǎng)目的菌，如選擇性的培養(yǎng)目的菌，如SS平板平板 增菌培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)基：促進(jìn)目的菌的生長，適用于：促進(jìn)目的菌的生長，適用于含菌量較少的標(biāo)本，如葡萄糖肉湯。含菌量較少的標(biāo)本，如葡萄糖肉湯。 厭氧培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)厭氧菌：用于培養(yǎng)厭氧菌3、培養(yǎng)基制備的一

10、般程序調(diào)配調(diào)配溶化溶化矯正矯正pH過濾澄清過濾澄清分裝分裝滅菌滅菌檢定檢定培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基滅菌 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：121高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌15分鐘分鐘 含糖培養(yǎng)基：含糖培養(yǎng)基：113 滅菌滅菌15分鐘分鐘 雞蛋、血清培養(yǎng)基：間歇滅菌雞蛋、血清培養(yǎng)基：間歇滅菌3天天3次次 不耐高溫的液體成分：濾過除菌不耐高溫的液體成分：濾過除菌保存保存二、細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)二、細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)（一）無菌技術(shù)（一）無菌技術(shù)1、細(xì)菌檢驗的操作需在無菌室或超凈工作臺、細(xì)菌檢驗的操作需在無菌室或超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。內(nèi)進(jìn)行。2、無菌室、超凈工作臺使用前后需進(jìn)行消毒。、無菌室、超凈工作臺使用前后需進(jìn)行消毒。3、

11、細(xì)菌檢驗使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌、細(xì)菌檢驗使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌4、無菌試管、燒瓶、吸管的使用、無菌試管、燒瓶、吸管的使用5、標(biāo)本的采集、標(biāo)本的采集6、廢棄物的處理、廢棄物的處理8、個人防護(hù)、個人防護(hù)（二）細(xì)菌接種與分離技術(shù)（二）細(xì)菌接種與分離技術(shù)1、細(xì)菌接種的基本程序、細(xì)菌接種的基本程序滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)沾取標(biāo)本沾取標(biāo)本接種接種滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染環(huán)境殺滅接種環(huán)沾染的細(xì)菌，以免污染環(huán)境2、細(xì)菌接種法、細(xì)菌接種法（1）平板劃線接種法）平板劃線接種法： 目的：使混合的細(xì)菌呈單個分散生長，

12、形成目的：使混合的細(xì)菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌。單個菌落，以便獲得純菌。 方法：方法： 1）分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本）分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本 2）連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本）連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)連續(xù)劃線法（2）液體培養(yǎng)基接種法）液體培養(yǎng)基接種法（3）穿刺接種法）穿刺接種法 :用于觀察細(xì)菌動力用于觀察細(xì)菌動力（4）斜面接種法）斜面接種法 （5）傾注培養(yǎng)法）傾注培養(yǎng)法:用于細(xì)菌計數(shù)用于細(xì)菌計數(shù)（6）涂布接種法

13、：見于藥敏試驗）涂布接種法：見于藥敏試驗（三）細(xì)菌的培養(yǎng)方法（三）細(xì)菌的培養(yǎng)方法 一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)溫度：35（采用恒溫培養(yǎng)箱）（采用恒溫培養(yǎng)箱）培養(yǎng)時間：培養(yǎng)時間：1824h 二氧化碳培養(yǎng)法：燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)二氧化碳培養(yǎng)法：燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱、化學(xué)法箱、化學(xué)法 厭氧培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧厭氧培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等三、細(xì)菌的生長現(xiàn)象三、細(xì)菌的生長現(xiàn)象（一）細(xì)菌在（一）細(xì)菌在液體液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象 混濁混濁 沉淀：多見于鏈狀排列的細(xì)菌沉淀：多見于鏈

14、狀排列的細(xì)菌 菌膜：多見于厭氧菌菌膜：多見于厭氧菌細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象（二）細(xì)菌在（二）細(xì)菌在半固體半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象 有鞭毛細(xì)菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外有鞭毛細(xì)菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外擴(kuò)散生長，穿刺線邊緣模糊。擴(kuò)散生長，穿刺線邊緣模糊。 無鞭毛細(xì)菌：只沿穿刺線生長，穿刺線邊無鞭毛細(xì)菌：只沿穿刺線生長，穿刺線邊緣清晰。緣清晰。細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有動力有動力 現(xiàn)象現(xiàn)象無動力無動力 現(xiàn)象現(xiàn)象（三）細(xì)菌在（三）細(xì)菌在固體固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象 菌落菌落定義：指單個細(xì)菌在平板培

15、養(yǎng)基上生長繁殖，形定義：指單個細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單一肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。成單一肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。菌落特征：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透菌落特征：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性明度、濕潤度、黏度、溶血性菌落類型：光滑型（菌落類型：光滑型（S）、粗糙型（）、粗糙型（R）、黏液型）、黏液型（M） 菌苔：指多個菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物。菌苔：指多個菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物。菌 落菌落與菌苔第三節(jié)第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)細(xì)菌生化鑒定技術(shù) 細(xì)菌的生化反應(yīng)：細(xì)菌具有各自獨(dú)特的酶系細(xì)菌的生化反應(yīng)：細(xì)菌具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而在代謝過程中對底物的分解能

16、力不統(tǒng)，因而在代謝過程中對底物的分解能力不同，所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，這些代謝產(chǎn)同，所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，這些代謝產(chǎn)物各具有不同的生物化學(xué)特點(diǎn)，利用生物化物各具有不同的生物化學(xué)特點(diǎn)，利用生物化學(xué)的方法來檢驗這些代謝產(chǎn)物，可用于鑒別學(xué)的方法來檢驗這些代謝產(chǎn)物，可用于鑒別和鑒定細(xì)菌，這種用生化反應(yīng)測定方法稱為和鑒定細(xì)菌，這種用生化反應(yīng)測定方法稱為細(xì)菌的生化反應(yīng)。細(xì)菌的生化反應(yīng)。一、碳水化合物的代謝試驗 糖發(fā)酵試驗糖發(fā)酵試驗 葡萄糖氧化發(fā)酵試驗（葡萄糖氧化發(fā)酵試驗（O/F試驗）試驗） 甲基紅試驗甲基紅試驗 V-P試驗試驗 七葉苷水解試驗七葉苷水解試驗 半乳糖苷滲透酶試驗半乳糖苷滲透酶試驗（一）糖發(fā)

17、酵試驗 原理：不同細(xì)菌可分解不同的糖原理：不同細(xì)菌可分解不同的糖 多糖多糖單糖單糖丙酮酸丙酮酸酸性產(chǎn)物酸性產(chǎn)物(或產(chǎn)酸產(chǎn)氣或產(chǎn)酸產(chǎn)氣)pH 指示劑呈酸指示劑呈酸性變色性變色(若產(chǎn)氣者有氣泡出現(xiàn)若產(chǎn)氣者有氣泡出現(xiàn)) 培養(yǎng)基：糖發(fā)酵管、半固體發(fā)酵管、微培養(yǎng)基：糖發(fā)酵管、半固體發(fā)酵管、微量發(fā)酵管量發(fā)酵管 試劑：酚紅、溴甲酚紫等試劑：酚紅、溴甲酚紫等 結(jié)果結(jié)果:培養(yǎng)基呈酸性變色（紅培養(yǎng)基呈酸性變色（紅 黃）黃） 應(yīng)用：觀察細(xì)菌對糖的分解情況，常用應(yīng)用：觀察細(xì)菌對糖的分解情況，常用于腸道桿菌的鑒定于腸道桿菌的鑒定糖發(fā)酵試驗結(jié)果判斷反應(yīng)現(xiàn)象反應(yīng)現(xiàn)象結(jié)果描述結(jié)果描述酸性酸性變色變色、有氣泡、有氣泡分解分解糖

18、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣酸性酸性變色變色、無氣泡、無氣泡分解分解糖產(chǎn)酸、不產(chǎn)糖產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣氣培養(yǎng)基不變色培養(yǎng)基不變色不分解不分解糖糖糖發(fā)酵試驗（二）葡萄糖氧化（二）葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗發(fā)酵試驗 1、原理：細(xì)菌分解葡萄糖的過程中對氧的、原理：細(xì)菌分解葡萄糖的過程中對氧的需求不同，分為氧化、發(fā)酵和產(chǎn)堿三型需求不同，分為氧化、發(fā)酵和產(chǎn)堿三型 單糖單糖丙酮酸丙酮酸酸性產(chǎn)物酸性產(chǎn)物pH 指示劑呈酸性變色指示劑呈酸性變色 2、培養(yǎng)基：、培養(yǎng)基：HL葡萄糖培養(yǎng)基葡萄糖培養(yǎng)基 3、試劑：石蠟、試劑：石蠟 4、結(jié)果：兩管均不變色：產(chǎn)堿型、結(jié)果：兩管均不變色：產(chǎn)堿型 石蠟管變色：發(fā)酵型石蠟管變色：發(fā)酵型 非石蠟管變

19、色：氧化型非石蠟管變色：氧化型 5、應(yīng)用：腸桿菌和非發(fā)酵菌的鑒別、應(yīng)用：腸桿菌和非發(fā)酵菌的鑒別（三）甲基紅試驗（三）甲基紅試驗 原理：細(xì)菌分解糖，產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步生原理：細(xì)菌分解糖，產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步生成大量混合酸，使培養(yǎng)基成大量混合酸，使培養(yǎng)基pH維持在維持在4.4以下，以下，加入甲基紅（加入甲基紅（4.4-5.4）后，使甲基紅呈現(xiàn)紅）后，使甲基紅呈現(xiàn)紅色反應(yīng)。此為甲基紅試驗色反應(yīng)。此為甲基紅試驗陽性。陽性。 培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水 試劑：甲基紅試劑試劑：甲基紅試劑 結(jié)果：加入試劑后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)結(jié)果：加入試劑后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色紅色：+ 培養(yǎng)基不變色：培養(yǎng)基不變色： 應(yīng)

20、用：是腸道桿菌常用的生化反應(yīng)試驗，主應(yīng)用：是腸道桿菌常用的生化反應(yīng)試驗，主要用于區(qū)別大腸肝菌和產(chǎn)氣腸桿菌要用于區(qū)別大腸肝菌和產(chǎn)氣腸桿菌葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸大量混合酸大量混合酸pH降至降至4.4以下以下甲基紅試劑甲基紅試劑培養(yǎng)基培養(yǎng)基變紅變紅甲基紅試驗甲基紅試驗甲基紅試驗（四）伏普試驗（四）伏普試驗（V-P試驗）試驗） 原理：細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)生丙酮酸，丙酮原理：細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧生成乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中乙酸脫羧生成乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中乙酰甲基甲醇被氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白酰甲基甲醇被氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的精氨酸所含的胍基結(jié)合，生成紅色化胨中的精氨

21、酸所含的胍基結(jié)合，生成紅色化合物。合物。 培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水 結(jié)果：加入試劑后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)結(jié)果：加入試劑后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色紅色：+ 培養(yǎng)基不變色：培養(yǎng)基不變色： 應(yīng)用：是腸道桿菌常用的生化反應(yīng)試驗，主應(yīng)用：是腸道桿菌常用的生化反應(yīng)試驗，主要用于區(qū)別大腸肝菌和產(chǎn)氣腸桿菌要用于區(qū)別大腸肝菌和產(chǎn)氣腸桿菌葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇二乙酰二乙酰V-P試劑試劑培養(yǎng)基培養(yǎng)基變紅變紅VP試驗試驗脫酸脫酸葡萄糖發(fā)酵形成丙酮酸后的不同代謝途徑葡萄糖發(fā)酵形成丙酮酸后的不同代謝途徑葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸大量混合酸大量混合酸pH降至降至4.4以下以下甲基紅試劑甲基紅試劑

22、培養(yǎng)基培養(yǎng)基變紅變紅乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇二乙酰二乙酰V-P試劑試劑培養(yǎng)基培養(yǎng)基變紅變紅脫酸脫酸（五）（五）B-半乳糖苷酶試驗半乳糖苷酶試驗1、原理：有些細(xì)菌產(chǎn)生的、原理：有些細(xì)菌產(chǎn)生的B-半乳糖苷酶可分半乳糖苷酶可分 解鄰硝基酚解鄰硝基酚B-半乳糖苷（半乳糖苷（ONPG）產(chǎn)生鄰）產(chǎn)生鄰硝基苯酚（黃色）硝基苯酚（黃色）2、培養(yǎng)基：、培養(yǎng)基：1%乳糖肉湯瓊脂乳糖肉湯瓊脂3、試劑：甲苯、試劑：甲苯、 ONPG4、結(jié)果：加入、結(jié)果：加入ONPG后，菌懸液黃色：后，菌懸液黃色：+ 菌懸液無色：菌懸液無色：-5、應(yīng)用：遲緩發(fā)酵乳糖細(xì)菌的快速檢測、應(yīng)用：遲緩發(fā)酵乳糖細(xì)菌的快速檢測（六）七葉苷水解試驗（六

23、）七葉苷水解試驗1、原理：某些細(xì)菌可以分解七葉苷、原理：某些細(xì)菌可以分解七葉苷 七葉苷七葉苷 葡萄糖葡萄糖+七葉素七葉素 黑色沉淀黑色沉淀2、培養(yǎng)基：七葉苷培養(yǎng)基、培養(yǎng)基：七葉苷培養(yǎng)基3、結(jié)果：、結(jié)果： 培養(yǎng)基黑色：培養(yǎng)基黑色：+ 培養(yǎng)基不變色：培養(yǎng)基不變色：-4、應(yīng)用：、應(yīng)用：D群鏈球菌和其他鏈球菌的鑒別群鏈球菌和其他鏈球菌的鑒別Fe2+二、蛋白質(zhì)類代謝試驗 靛基質(zhì)試驗 硫化氫試驗 尿素酶試驗 苯丙氨酸脫氨試驗 氨基酸脫羧酶試驗（一）靛基質(zhì)試驗 原理：細(xì)菌產(chǎn)生色氨酸酶，可分解蛋白胨中原理：細(xì)菌產(chǎn)生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚），靛基質(zhì)與的色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚），靛基

24、質(zhì)與試劑對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛試劑對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基質(zhì)?；|(zhì)。 培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨水 試劑：靛基質(zhì)試劑（含對二甲基氨基苯甲醛）試劑：靛基質(zhì)試劑（含對二甲基氨基苯甲醛） 結(jié)果：結(jié)果：加入試劑后，培養(yǎng)基出現(xiàn)紅色液面：加入試劑后，培養(yǎng)基出現(xiàn)紅色液面：+ 培養(yǎng)基液面為黃色：培養(yǎng)基液面為黃色： 應(yīng)用：用于腸道桿菌的鑒定應(yīng)用：用于腸道桿菌的鑒定靛基質(zhì)試驗原理靛基質(zhì)試驗原理色氨酸酶色氨酸酶色氨酸色氨酸 靛基質(zhì)靛基質(zhì)（吲哚）（吲哚） 玫瑰靛基質(zhì)玫瑰靛基質(zhì)（玫瑰吲哚）（玫瑰吲哚）對二甲基氨基苯甲醛對二甲基氨基苯甲醛靛基質(zhì)試驗靛基質(zhì)試驗（二）硫化氫試驗（二）硫化氫試驗 原

25、理：細(xì)菌分解蛋白質(zhì)中的含硫氨基酸，原理：細(xì)菌分解蛋白質(zhì)中的含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鐵鹽或生成硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鐵鹽或鉛鹽結(jié)合生成黑色絡(luò)合物。鉛鹽結(jié)合生成黑色絡(luò)合物。 培養(yǎng)基：含硫酸亞鐵或醋酸鉛的培養(yǎng)基培養(yǎng)基：含硫酸亞鐵或醋酸鉛的培養(yǎng)基 結(jié)果：培養(yǎng)基變黑：陽性結(jié)果：培養(yǎng)基變黑：陽性 不變黑：陰性不變黑：陰性 應(yīng)用：常用于腸道桿菌的鑒定應(yīng)用：常用于腸道桿菌的鑒定（三）尿素酶試驗（三）尿素酶試驗 原理：產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌，能水解尿素生原理：產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌，能水解尿素生成氨和成氨和CO2，氨使培養(yǎng)基呈堿性變色。，氨使培養(yǎng)基呈堿性變色。 培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基 試劑：

26、酚紅指示劑試劑：酚紅指示劑 結(jié)果：培養(yǎng)基變紅：結(jié)果：培養(yǎng)基變紅：+ 培養(yǎng)基不變色培養(yǎng)基不變色 應(yīng)用：腸桿菌科屬間鑒定應(yīng)用：腸桿菌科屬間鑒定尿素酶試驗原理尿素尿素尿素酶尿素酶氨氨+CO2培養(yǎng)基培養(yǎng)基pH升高升高酚紅呈堿性變色（紅）酚紅呈堿性變色（紅）(四四)苯丙氨酸脫氨實(shí)驗苯丙氨酸脫氨實(shí)驗 原理：細(xì)菌的具有的苯丙氨酸脫氨酶，可原理：細(xì)菌的具有的苯丙氨酸脫氨酶，可使培養(yǎng)基中的苯丙氨酸脫氨，形成苯丙酮使培養(yǎng)基中的苯丙氨酸脫氨，形成苯丙酮酸，后者與三氯化鐵作用，形成綠色化合酸，后者與三氯化鐵作用，形成綠色化合物。物。 培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂 試劑：試劑：10三氯化鐵三氯化鐵 結(jié)果：加

27、入試劑后培養(yǎng)基呈現(xiàn)綠色為陽性結(jié)果：加入試劑后培養(yǎng)基呈現(xiàn)綠色為陽性 應(yīng)用：多用于腸道桿菌的鑒定應(yīng)用：多用于腸道桿菌的鑒定苯丙氨酸脫氨試驗原理苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸脫氨酶苯丙氨酸脫氨酶苯丙酮酸苯丙酮酸10三氯化鐵三氯化鐵綠色化合物綠色化合物（五）氨基酸脫羧酶試驗（五）氨基酸脫羧酶試驗1、原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，可、原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，可使氨基酸脫羧成胺和二氧化碳，胺溶于水使使氨基酸脫羧成胺和二氧化碳，胺溶于水使培養(yǎng)基顯堿性培養(yǎng)基顯堿性2、培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基、培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基 （糖、氨基酸）（糖、氨基酸）3、指示劑：為溴甲酚紫、指示劑：為溴甲酚紫5.2（黃

28、）（黃）-6.8（紫）（紫）4、結(jié)果：培養(yǎng)基變紫色：、結(jié)果：培養(yǎng)基變紫色：+ 培養(yǎng)基為黃色：培養(yǎng)基為黃色：-5、應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌的鑒別、應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌的鑒別三、碳源利用試驗三、碳源利用試驗（一）枸櫞酸鹽利用試驗（一）枸櫞酸鹽利用試驗 原理：某些細(xì)菌能力利用培養(yǎng)基中的枸櫞酸鹽原理：某些細(xì)菌能力利用培養(yǎng)基中的枸櫞酸鹽作為唯一的碳源，也能利用其中的銨鹽作為唯一的碳源，也能利用其中的銨鹽 作為唯作為唯一氮源，細(xì)菌生長過程中分解枸櫞酸鹽產(chǎn)生碳一氮源，細(xì)菌生長過程中分解枸櫞酸鹽產(chǎn)生碳酸鹽和分解銨鹽生成的氨，使培養(yǎng)基變堿，是酸鹽和分解銨鹽生成的氨，使培養(yǎng)基變堿，是指示劑呈堿性反應(yīng)。指示劑呈堿性反應(yīng)。

29、培養(yǎng)基：枸鹽酸鹽培養(yǎng)基（淡綠色）培養(yǎng)基：枸鹽酸鹽培養(yǎng)基（淡綠色） 試劑：溴麝香草酚藍(lán)（試劑：溴麝香草酚藍(lán)（pH6.0以下呈黃色，以下呈黃色， pH7.6以上呈藍(lán)色）以上呈藍(lán)色） 結(jié)果：結(jié)果： 培養(yǎng)基變藍(lán)：培養(yǎng)基變藍(lán)：+ 培養(yǎng)基不變色：培養(yǎng)基不變色： 應(yīng)用：腸桿菌科屬間鑒別應(yīng)用：腸桿菌科屬間鑒別枸櫞酸鹽利用試驗原理枸櫞酸鹽銨鹽碳酸鹽氨培養(yǎng)基pH升高溴麝香草酚藍(lán) 呈堿性變色培養(yǎng)基變藍(lán)培養(yǎng)基（二）丙二酸鹽利用試驗（二）丙二酸鹽利用試驗1、原理：某些細(xì)菌可利用丙二酸為唯一碳源，、原理：某些細(xì)菌可利用丙二酸為唯一碳源，分解丙二酸為碳酸鈉，碳酸根水解是培養(yǎng)基分解丙二酸為碳酸鈉，碳酸根水解是培養(yǎng)基顯堿性顯堿

30、性2、培養(yǎng)基：丙二酸鈉培養(yǎng)基、培養(yǎng)基：丙二酸鈉培養(yǎng)基3、指示劑：、指示劑：溴麝香草酚藍(lán)（溴麝香草酚藍(lán)（pH6.0以下呈黃以下呈黃 色，色， pH7.6以上呈藍(lán)色）以上呈藍(lán)色）4、結(jié)果：培養(yǎng)基變藍(lán)色：、結(jié)果：培養(yǎng)基變藍(lán)色：+ 培養(yǎng)基不變色：培養(yǎng)基不變色：-5、應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌屬之間的鑒別、應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌屬之間的鑒別四、酶類試驗四、酶類試驗（一）觸酶（過氧化氫酶）試驗（一）觸酶（過氧化氫酶）試驗 1、原理：有的細(xì)菌有觸酶，能催化過氧化、原理：有的細(xì)菌有觸酶，能催化過氧化氫生成水和氧，氧分子，出現(xiàn)氣泡。氫生成水和氧，氧分子，出現(xiàn)氣泡。 2、方法：取細(xì)菌少許，滴加、方法：取細(xì)菌少許，滴加3%試劑

31、試劑滴。滴。、結(jié)果：一分鐘內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡：、結(jié)果：一分鐘內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡：一分鐘內(nèi)不出現(xiàn)氣泡：一分鐘內(nèi)不出現(xiàn)氣泡：、應(yīng)用：用于革蘭陽性球菌的初步分類、應(yīng)用：用于革蘭陽性球菌的初步分類（二）氧化酶（細(xì)胞色素氧化酶）試驗（二）氧化酶（細(xì)胞色素氧化酶）試驗、原理：某些細(xì)菌的氧化酶，可以將二甲、原理：某些細(xì)菌的氧化酶，可以將二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺氧化生成紅基對苯二胺或四甲基對苯二胺氧化生成紅色醌類化合物色醌類化合物、用潔凈濾紙條粘取被檢細(xì)菌菌落，或直、用潔凈濾紙條粘取被檢細(xì)菌菌落，或直接將試劑直接滴在被檢細(xì)菌菌落上接將試劑直接滴在被檢細(xì)菌菌落上、結(jié)果：出現(xiàn)紅色：、結(jié)果：出現(xiàn)紅色：不出現(xiàn)紅色：不出

32、現(xiàn)紅色：、應(yīng)用：用于腸道桿菌科和假單胞菌的鑒、應(yīng)用：用于腸道桿菌科和假單胞菌的鑒別。別。（三）凝固酶試驗（三）凝固酶試驗、原理：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，、原理：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白。蛋白。、方法：、方法：（）玻片法：用于結(jié)合凝固酶試驗（）玻片法：用于結(jié)合凝固酶試驗用未稀釋的兔血漿和生理鹽水各滴載玻片用未稀釋的兔血漿和生理鹽水各滴載玻片兩端。挑少許分別與之混合。兩端。挑少許分別與之混合。（）試管法：用于游離凝固酶試驗（）試管法：用于游離凝固酶試驗取三支潔凈試管，其中一支加入取三支潔凈試管，其中一支加入.:稀釋

33、兔血漿，其余兩支分別加入陰陽稀釋兔血漿，其余兩支分別加入陰陽性對照，各加入性對照，各加入.待檢菌。待檢菌。、結(jié)果：、結(jié)果：出現(xiàn)凝集：出現(xiàn)凝集：不出現(xiàn)凝集：不出現(xiàn)凝集：、應(yīng)用：、應(yīng)用：主要用于葡萄球菌的鑒定主要用于葡萄球菌的鑒定（四）酶試驗（四）酶試驗、原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生酶，能分、原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生酶，能分解，使長鏈變成寡鏈解，使長鏈變成寡鏈長鏈可被酸沉淀，寡鏈可溶于酸。長鏈可被酸沉淀，寡鏈可溶于酸。、培養(yǎng)基：、培養(yǎng)基：DNA瓊脂平板瓊脂平板 3、方法：將細(xì)菌接種在、方法：將細(xì)菌接種在DNA平板，培養(yǎng)后平板，培養(yǎng)后HCl覆蓋平板覆蓋平板 4、結(jié)果：菌落周圍出現(xiàn)透明圈：、結(jié)果：菌落周圍出現(xiàn)透明

34、圈：+ 菌落周圍無變化：菌落周圍無變化：- 5、應(yīng)用：用于葡萄球菌、沙雷菌和變形桿、應(yīng)用：用于葡萄球菌、沙雷菌和變形桿 菌的鑒定。菌的鑒定。（五）硝酸鹽還原試驗（五）硝酸鹽還原試驗1、原理：、原理：2、培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基、培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基3、結(jié)果：試劑出現(xiàn)紅色：、結(jié)果：試劑出現(xiàn)紅色：+ 試劑不出現(xiàn)紅色：試劑不出現(xiàn)紅色：-4、應(yīng)用：用于腸桿菌科細(xì)菌、假單胞菌和厭、應(yīng)用：用于腸桿菌科細(xì)菌、假單胞菌和厭氧菌的鑒別。氧菌的鑒別。硝酸鹽硝酸鹽亞硝酸鹽亞硝酸鹽亞硝酸亞硝酸重氮磺酸重氮磺酸細(xì)菌細(xì)菌醋酸醋酸對氨基苯磺酸對氨基苯磺酸N-a萘胺偶氮苯磺酸（紅色）萘胺偶氮苯磺酸（紅色）a-萘胺萘胺五、其他試驗

35、五、其他試驗（一）復(fù)合生化試驗（一）復(fù)合生化試驗 1、克氏雙糖鐵（、克氏雙糖鐵（KIA）試驗）試驗（1）原理：）原理：KIA中含有牛肉膏、酵母浸膏、中含有牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、乳糖、葡萄糖、枸櫞酸胺鐵、酚蛋白胨、乳糖、葡萄糖、枸櫞酸胺鐵、酚磺酞指示劑。乳糖是葡萄糖的十倍?；翘甘緞Ｈ樘鞘瞧咸烟堑氖?。 1）若細(xì)菌只分解葡萄糖，只能產(chǎn)生少量的）若細(xì)菌只分解葡萄糖，只能產(chǎn)生少量的酸，在培養(yǎng)酸，在培養(yǎng)8-11小時內(nèi)，分解葡萄糖的產(chǎn)小時內(nèi)，分解葡萄糖的產(chǎn)生的酸可使培養(yǎng)基底層和斜面變黃色，生的酸可使培養(yǎng)基底層和斜面變黃色，18-24小時后，斜面所含氨基酸發(fā)生降解，中小時后，斜面所含氨基酸發(fā)生降解，

36、中和斜面的酸，是斜面變紅色（堿色），底和斜面的酸，是斜面變紅色（堿色），底層仍為黃色（酸色）層仍為黃色（酸色）2）若細(xì)菌能分解乳糖，則可以中和斜面的堿，）若細(xì)菌能分解乳糖，則可以中和斜面的堿，使整個培養(yǎng)基呈黃色。使整個培養(yǎng)基呈黃色。3）若細(xì)菌能分解含硫氨基酸，產(chǎn)生）若細(xì)菌能分解含硫氨基酸，產(chǎn)生H2S， H2S與枸櫞酸銨鐵反應(yīng)，產(chǎn)生黑色沉淀。與枸櫞酸銨鐵反應(yīng)，產(chǎn)生黑色沉淀。（2）結(jié)果：）結(jié)果：斜面堿性斜面堿性/底層堿性：不發(fā)酵糖類底層堿性：不發(fā)酵糖類斜面堿性斜面堿性/底層酸性：發(fā)酵葡萄糖底層酸性：發(fā)酵葡萄糖斜面堿性斜面堿性/底層酸性（黑色）：底層酸性（黑色）： 發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)生發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)生H2S斜面酸性斜面酸性/底層酸性：發(fā)酵葡萄糖和乳糖底層酸性：發(fā)酵葡萄糖和乳糖（3）應(yīng)用：用于腸桿