生物固氮作用的分子機(jī)理研究

1、項(xiàng)目名稱：生物固氮作用的分子機(jī)理研究首席科學(xué)家：王憶平 北京大學(xué)起止年限：2010年1月-2014年8月依托部門：教育部一、研究內(nèi)容生物固氮研究的關(guān)鍵科學(xué)問題是獲得最佳生物固氮體系（包括共生固氮、聯(lián)合（內(nèi)生）固氮等）和建立非豆科植物的自主固氮體系，具體包括：（1）闡明根瘤菌共生固氮基因表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，根瘤菌識別、傳遞環(huán)境和植物信號，調(diào)節(jié)自身基因表達(dá)的分子機(jī)理；（2）揭示固氮及氮代謝基因調(diào)控機(jī)理，與碳代謝系統(tǒng)及其基因的調(diào)控偶聯(lián)機(jī)制；（3）闡明共生固氮體系中植物與微生物相互作用的機(jī)理，如植物與微生物相互識別及分子信號的傳導(dǎo)機(jī)制，克服宿主特異性，從而擴(kuò)大根瘤菌的宿主范圍；（4）利用單細(xì)胞真核生物-酵

2、母菌的線粒體遺傳操作系統(tǒng)，探索固氮基因簇向真核生物轉(zhuǎn)化和表達(dá)的機(jī)制，為固氮基因向高等植物轉(zhuǎn)移，建立非豆科植物自主固氮體系的奠定基礎(chǔ)。（5）闡明固氮酶結(jié)構(gòu)、功能和催化機(jī)理。圍繞上述提高生物固氮效率、擴(kuò)大共生固氮植物范圍、建立自主固氮體系的關(guān)鍵問題，主要研究內(nèi)容有：（1）以模式豆科植物共生固氮體系為材料，分離和鑒定參與根瘤菌結(jié)瘤因子信號傳遞的調(diào)控元件及基因，研究和建立根瘤菌與宿主植物共生關(guān)系蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)；通過對豆科植物與根瘤菌、AM真菌共生的異同以及與非豆科植物比較基因組學(xué)研究，揭示非豆科植物中存在哪些與共生相關(guān)基因的功能及調(diào)控機(jī)制，為探索擴(kuò)大根瘤菌寄主范圍和建立非豆科共生固氮途徑可能性提供科

3、學(xué)資料；分離和鑒定LysR、GntR等家簇轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因，闡明根瘤菌主代謝與共生固氮功能的相關(guān)性和調(diào)控機(jī)理；開展根瘤菌群體感應(yīng)系統(tǒng)、型分泌系統(tǒng)及胞外多糖合成基因表達(dá)調(diào)節(jié)的雙組分調(diào)控系統(tǒng)的研究，闡明這些代謝系統(tǒng)在不同環(huán)境條件下的功能和作用機(jī)制，揭示根瘤菌環(huán)境適應(yīng)性與競爭結(jié)瘤之間的相關(guān)性。（2）碳代謝與氮代謝是自然界生命活動的兩大主要代謝作用。固氮基因調(diào)控機(jī)理，以及碳代謝和氮代謝之間的調(diào)控偶聯(lián)途徑已經(jīng)得到了解析，但碳代謝對固氮基因的表達(dá)的抑制機(jī)理與途徑有較大不同。因此，進(jìn)一步解析碳代謝調(diào)控系統(tǒng)對固氮基因的調(diào)控偶聯(lián)機(jī)理將為提高生物固氮效率打下理論基礎(chǔ)；建立酵母菌單細(xì)胞真核生物及其線粒體遺傳操作系

4、統(tǒng)，探索固氮基因簇向真核生物轉(zhuǎn)化的可能和表達(dá)機(jī)制。包括：酵母菌線粒體遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建；線粒體鉬的運(yùn)輸、RNA聚合酶對固氮基因表達(dá)的影響（RNA聚合酶、 s因子、DNA折疊蛋白等）；線粒體呼吸耗氧與固氮酶厭氧的關(guān)系和影響；線粒體與細(xì)胞質(zhì)之間的氨基酸穿梭往返機(jī)制對生物固氮效果的影響等。以上研究是固氮基因向真核生物轉(zhuǎn)移的新的嘗試，為非豆科植物（包括糧食作物）建立自主的生物固氮體系探索新路。（3） 聯(lián)合固氮作用有三個(gè)重要的限制因子，即氧、銨和能量。其中，能量和銨又是導(dǎo)致目前田間聯(lián)合固氮效率低下的最主要限制因子。我們擬利用功能基因組操作平臺，對斯氏假單胞菌和巴西固氮螺菌等聯(lián)合固氮菌和上述主要限制因子，

5、在聯(lián)合固氮微生物功能基因組、聯(lián)合固氮基因表達(dá)調(diào)節(jié)以及固氮酶催化機(jī)制等開展工作。分析鑒定可能參與細(xì)菌氮信號傳導(dǎo)、調(diào)控或保持最佳固氮水平的新基因和新機(jī)制，系統(tǒng)研究聯(lián)合固氮體系形成的分子機(jī)理和聯(lián)合固氮微生物對土壤環(huán)境變化的適應(yīng)能力, 探討提高作物與固氮微生物之間的聯(lián)合固氮效率的策略。（4）在固氮酶還原氮?dú)夂唾|(zhì)子的分子機(jī)制方面，利用生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)化學(xué)理論，分析研究野生型及各突變株固氮酶還原N2和H+的動力學(xué)、EPR、CD波譜等特征。明確N2的絡(luò)合和還原位置及其電子質(zhì)子傳遞通道。二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)：本項(xiàng)目的總體目標(biāo)是借助分子生物學(xué)和現(xiàn)代生物技術(shù)，開展生物固氮作用的分子機(jī)理研究，在分子水平上解析低等固

6、氮微生物與高等植物宿主之間遺傳信息的交流；共生固氮體系的建立；固氮過程中能量及營養(yǎng)物質(zhì)的交換；固氮功能的發(fā)揮等關(guān)鍵科學(xué)問題。為擴(kuò)大根瘤菌宿主植物范圍、提高生物固氮效率，探索非豆科植物共生體系及自主固氮的可能性提供科學(xué)依據(jù)，為生物固氮在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，緩解和減輕農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長期和大量依賴工業(yè)氮肥施用所造成的能源和環(huán)境問題，為保障我國糧食生產(chǎn)安全，農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供新的途徑。五年目標(biāo)：1）建立根瘤菌與宿主植物共生關(guān)系中蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，分離和鑒定參與根瘤形成和發(fā)育功能基因及其調(diào)控蛋白，闡明根瘤菌共生信號在豆科植物中接受、傳遞及其調(diào)控的機(jī)制；建立豆科植物突變體庫，分離和鑒定與共

7、生固氮相關(guān)的突變株；比較豆科植物與根瘤菌或AM真菌共生基因的異同，并比較非豆科植物基因組，闡明非豆科植物中存在哪些與共生固氮相關(guān)的基因及其功能、表達(dá)與調(diào)控機(jī)制。2）通過基因芯片等轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，分離和鑒定LysR和GntR家族轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的下游靶基因，闡明其調(diào)節(jié)共生固氮作用的分子機(jī)理；通過定向缺失突變，分離和鑒定參與根瘤菌細(xì)胞周期調(diào)控以及共生固氮作用的激酶和反應(yīng)蛋白基因，并確定其相互作用網(wǎng)絡(luò)；分離和鑒定參與共生固氮作用的功能基因和調(diào)節(jié)蛋白，闡明根瘤菌共生固氮基因表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，根瘤菌識別、傳遞環(huán)境和植物信號，調(diào)節(jié)自身基因表達(dá)的分子機(jī)理。3）在結(jié)構(gòu)層面和基因組水平揭示固氮及氮代謝基因調(diào)控機(jī)理，與碳

8、代謝系統(tǒng)及其基因的調(diào)控偶聯(lián)機(jī)制，為提高固氮效率奠定理論基礎(chǔ)；在結(jié)構(gòu)層面上解析根瘤菌共生固氮的唯一碳源（能量）供應(yīng)系統(tǒng)（Dct）的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)原理及其調(diào)控機(jī)制，為提高共生固氮效率奠定理論基礎(chǔ)；構(gòu)建單細(xì)胞真核生物-酵母菌的線粒體遺傳操作系統(tǒng)，探索固氮基因簇向真核生物轉(zhuǎn)化和表達(dá)的機(jī)制，為固氮基因向高等植物轉(zhuǎn)移，建立非豆科植物（包括糧食作物）自主固氮體系的奠定基礎(chǔ)。4） 開展聯(lián)合固氮微生物比較基因組、生物固氮體系的進(jìn)化、不同條件下聯(lián)合固氮微生物基因表達(dá)譜的研究，揭示生物固氮進(jìn)化途徑的形成和機(jī)制，分析鑒定可能參與細(xì)菌氮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或保持最佳固氮水平的新基因；系統(tǒng)研究聯(lián)合固氮體系形成的分子機(jī)理，建立穩(wěn)定的聯(lián)合固氮

9、體系，為提高作物與固氮微生物之間的固氮效率提出新策略；5） 分析P-cluster和FeMoco之間螺旋上單個(gè)氨基酸替換后固氮酶結(jié)構(gòu)的變化和可能對電子質(zhì)子傳遞的影響，對固氮酶MoFe蛋白亞單位中FeMo輔因子周圍多肽環(huán)境中保守氨基酸定位誘變并構(gòu)建不同的突變株，明確FeMoco的Fe2和Fe6是否是氮的絡(luò)合和還原位置，及用于氮和質(zhì)子還原的電子質(zhì)子傳遞通道。 6） 分離和鑒定100個(gè)左右在共生固氮系統(tǒng)中參與根瘤形成和發(fā)育、共生固氮作用的功能基因和調(diào)節(jié)蛋白、根瘤菌細(xì)胞周期調(diào)控、LysR和GntR家族調(diào)控子（regulon）的新基因；分離和鑒定30-50個(gè)與共生固氮相關(guān)的突變體；20個(gè)聯(lián)合固

10、氮系統(tǒng)中參與細(xì)菌氮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或保持最佳固氮水平的新基因；在影響因子2以上的國際刊物上發(fā)表論文80篇或達(dá)到相應(yīng)的影響因子總數(shù)的文章數(shù)目。申請國內(nèi)外發(fā)明專利10個(gè)以上。在生物固氮研究領(lǐng)域造就一支高水平的研究隊(duì)伍，培養(yǎng)博士研究生60名以上。三、研究方案1）學(xué)術(shù)思路： 我們的學(xué)術(shù)思路和技術(shù)途經(jīng)是圍繞著生物固氮菌氮碳代謝基因表達(dá)調(diào)控偶聯(lián)機(jī)理、豆科植物與根瘤菌相互作用機(jī)理、根瘤菌固氮系統(tǒng)調(diào)控機(jī)理和固氮菌固氮基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控與固氮酶催化機(jī)制等核心課題，依據(jù)多學(xué)科（生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)）交叉的研究優(yōu)勢，獲得創(chuàng)新成果，促進(jìn)生命科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。同時(shí)提高生物固氮的效率，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展?？傮w研究方案以下圖簡示：2）技術(shù)

11、途徑： 總體研究方案以下圖簡示： 生物固氮作用的分子機(jī)理研究豆科植物共生信號 根瘤菌固氮系統(tǒng) 固氮菌氮碳代謝 聯(lián)合固氮菌固氮基因傳遞及作用機(jī)制 調(diào)控機(jī)理 基因調(diào)控偶聯(lián) 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控與酶催化機(jī)理擴(kuò)大根瘤菌 固氮基因向真核 高效穩(wěn)定的固氮體系的宿主范圍 生物的轉(zhuǎn)移非豆科植物的生物固氮生物固氮創(chuàng)新研究和農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展3) 創(chuàng)新點(diǎn)與特色： 本建議項(xiàng)目是繼2002-2006年“高效生物固氮作用機(jī)理及其在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用”973項(xiàng)目之后，又一次跨學(xué)科、跨系統(tǒng)的全國性大型協(xié)作。我們爭取在以下問題上獲得創(chuàng)新成果：1）本項(xiàng)目四個(gè)課題的研究內(nèi)容都集中在兩條主線上，一個(gè)研究如何提高生物固氮效率；一個(gè)是研究建立共生或自主固氮體

12、系的基本條件。這兩條主線都為最終提高農(nóng)作物產(chǎn)量服務(wù)。2）從豆科植物固氮根瘤形成調(diào)控系統(tǒng)和根瘤菌固氮調(diào)控系統(tǒng)兩個(gè)方面出發(fā)，結(jié)合根瘤菌及其宿主植物基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)平臺，現(xiàn)代分子生物學(xué)、遺傳學(xué)理論和技術(shù)，對共生固氮體系植物和根瘤菌各自基因的表達(dá)和兩者之間分子相互作用機(jī)制研究，具有創(chuàng)新性和特色。3）碳代謝與氮代謝是自然界生命活動的兩大主要代謝作用。本建議項(xiàng)目從揭示存在于微生物體內(nèi)的固氮及氮代謝與碳代謝之間的基因調(diào)控偶聯(lián)及其調(diào)控機(jī)理出發(fā)，進(jìn)而研究固氮過程中能量的供應(yīng)，對提供碳源，提高固氮作用有重要意義。這也是本建議項(xiàng)目的特色和創(chuàng)新點(diǎn)之一； 4）建立酵母菌單細(xì)胞真核生物及其線粒體遺傳操

13、作系統(tǒng)，探索固氮基因簇向真核生物轉(zhuǎn)化的可能和表達(dá)機(jī)制，是固氮基因向真核生物轉(zhuǎn)移的新的嘗試，為非豆科植物（包括糧食作物）建立自主的生物固氮體系探索新路。5）通過對野生和突變固氮酶的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行比較，確定N2和H+在活性中心原子簇上的絡(luò)合與還原位點(diǎn)及其催化機(jī)理，為實(shí)現(xiàn)溫和條件合成氨的設(shè)想創(chuàng)造條件。在學(xué)科發(fā)展方向上具有創(chuàng)新性和特色。4）可行性分析： 我們認(rèn)為上述預(yù)期成果是可以達(dá)到的，理由是：本建議是在“八五”、“九五”、“十五”的“863”計(jì)劃項(xiàng)目“根瘤菌和寄主相互關(guān)系的分子遺傳學(xué)研究”、“重組大豆根瘤菌的研制”、“水稻聯(lián)合固氮菌研究”、“玉米聯(lián)合固氮研究”、 “高效固氮大豆、花生根瘤菌的研制”、

14、“高效固氮大豆、花生根瘤菌的中試研究”、“重組大豆根瘤菌的研制”、“重組固氮菌田間把關(guān)鑒定”、“高效固氮工程菌的構(gòu)建及其應(yīng)用”、“新型高效固氮菌劑的研制”；國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目“我國豆科植物根瘤菌資源調(diào)查和分類”的研究、國家973項(xiàng)目“高效生物固氮作用機(jī)理及其在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用”基礎(chǔ)上提出的。本研究方案將我國的生物固氮資源與生物固氮基礎(chǔ)研究和應(yīng)用基礎(chǔ)研究有機(jī)地結(jié)合起來，使近期和中長期目標(biāo)更加明確、技術(shù)路線更加清晰，具有可行性和創(chuàng)新性。本建議項(xiàng)目將由在固氮微生物及其宿主植物的基因調(diào)控及其分子生物學(xué)、固氮微生物分子生態(tài)學(xué)及其分類、微生物與植物相互作用及其分子生物學(xué)、固氮酶生物化學(xué)及其化學(xué)模擬等研究

15、方面的國內(nèi)優(yōu)勢單位組成，具有很好的研究基礎(chǔ)和成熟的組織管理經(jīng)驗(yàn)。建議參加單位的實(shí)驗(yàn)設(shè)施和裝備良好，其中有國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室5個(gè)和部門重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3個(gè)。建議參加本項(xiàng)目研究任務(wù)的主要單位有北京大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、中山大學(xué)、中科院上海植物生理生態(tài)研究所、中科院植物研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所等國內(nèi)優(yōu)勢單位共37人，其中包括新近引進(jìn)的杰出人才10余人。 多年來，我國生物固氮研究與英國、法國、德國、荷蘭、比利時(shí)、美國、澳大利亞等國家有良好的合作基礎(chǔ)，其中包括政府間科技合作議定書的重點(diǎn)項(xiàng)目，如“中法先進(jìn)研究計(jì)劃”、“中德科技合作項(xiàng)目”、“歐盟合作計(jì)劃項(xiàng)目”、美國洛氏基金“水稻

16、結(jié)瘤固氮國際合作項(xiàng)目”、國際人類前沿科學(xué)基金（HFSPO）：“細(xì)菌中氮同化作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究”等。首次在亞洲召開的國際固氮大會（第十四屆）于2004年在北京由本項(xiàng)目首席科學(xué)家王憶平教授主持大會并獲得圓滿成功，會議進(jìn)一步展示了我國生物固氮研究的成果，并促進(jìn)了我國科學(xué)家與國際同行的合作與交流。各課題間相互關(guān)系1 豆科植物固氮根瘤形成的分子機(jī)理本課題以模式豆科植物共生固氮體系為材料，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與多糖的相互作用，建立根瘤菌與宿主植物共生關(guān)系建立早期蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。分離和鑒定參與根瘤菌結(jié)瘤因子信號傳遞的調(diào)控元件及基因，研究植物響應(yīng)根瘤菌結(jié)瘤因子的作用方式、傳遞途徑及其信號

17、蛋白的調(diào)控機(jī)制。研究豆科植物的長/短距離信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的關(guān)系，闡明根瘤形態(tài)發(fā)生以及根瘤屬性的分子機(jī)制，為提高共生固氮效率和作物產(chǎn)量、以及在非豆科植物建立共生或自主固氮體系奠定細(xì)胞生物學(xué)和形態(tài)發(fā)育的分子基礎(chǔ)。通過對豆科植物與根瘤菌、AM真菌共生的異同以及與非豆科植物比較基因組學(xué)研究，揭示非豆科植物中存在哪些與共生相關(guān)的基因及其調(diào)控機(jī)制，為探索擴(kuò)大根瘤菌宿主范圍和建立非豆科共生固氮途徑可能性提供科學(xué)依據(jù)。主要研究內(nèi)容：1）研究響應(yīng)根瘤菌信號分子的宿主植物苜?；?，及其在根瘤發(fā)育中的信號傳導(dǎo)。研究百脈根突變體rel1和rel3中，小RNA在生長素信號傳導(dǎo)途徑中對于根瘤發(fā)育的調(diào)控作用。通過對根瘤菌與

18、多種豆科宿主植物（苜蓿和百脈根等）互作過程的研究，揭示結(jié)瘤因子在宿主植物中的信號傳導(dǎo)途徑和植物水解酶誘導(dǎo)的結(jié)瘤因子失活機(jī)理。2）利用酵母雙雜交技術(shù)鑒定出與根瘤菌型效應(yīng)因子互作，并決定宿主特異性結(jié)瘤的豆科植物基因（即靶蛋白）。通過構(gòu)建不同轉(zhuǎn)錄水平的轉(zhuǎn)基因植物來研究所克隆基因在共生中的作用。另外，將構(gòu)建可表達(dá)型效應(yīng)子的轉(zhuǎn)基因豆科植物，以此來研究根瘤菌型效應(yīng)子在植物細(xì)胞中的功能（如：引起超敏反應(yīng)；抑制植物防御反應(yīng)等）。此外，應(yīng)用Cre重組酶Lox-P技術(shù)，驗(yàn)證型效應(yīng)子-Cre融合蛋白是否從根瘤菌轉(zhuǎn)移到豆科植物。構(gòu)建表達(dá)啟動子-loxP-報(bào)告基因（編碼葡糖苷酸酶或綠色熒光蛋白）的轉(zhuǎn)基因日本百脈根，接種

19、攜帶型效應(yīng)子-Cre融合蛋白的根瘤菌后，可在顯微鏡下檢測報(bào)告基因的表達(dá)活性。3）通過抑制性減法雜交技術(shù)，DNA微陣列技術(shù)和蛋白質(zhì)組技術(shù)確定被根瘤菌胞外寡聚糖所誘導(dǎo)的豆科植物基因。通過RNA干擾技術(shù)將找到的基因進(jìn)行沉默，從而研究其在共生過程中的功能。通過基因突變方案（獲得基因功能的方法）鑒定百脈根中不需要胞外寡聚糖也可以建立根瘤菌NGR234與豆科植物的固氮結(jié)瘤的突變體。4）在宿主植物與根瘤菌相互作用機(jī)理方面：根瘤菌與宿主植物共生關(guān)系早期蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，根瘤菌結(jié)瘤因子的作用方式、傳遞途徑中的基因（如：COCH、BIO1/ELE1和ELE2基因及其同源基因等）及其調(diào)控機(jī)制。豆科植物與根瘤菌、AM

20、真菌共生的異同比較，以及與非豆科植物比較基因組學(xué)，探討在豆科根系和其他高等植物根系發(fā)育中的功能差異；在水稻中異源表達(dá)豆科植物結(jié)瘤因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因（如LysM受體激酶等）；用結(jié)瘤因子處理轉(zhuǎn)基因水稻以觀測相關(guān)的菌根信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因是否表達(dá)；研究植物與微生物共生所產(chǎn)生的其他特殊根形態(tài)發(fā)育（如菌根）與豆科根瘤形態(tài)發(fā)育分子調(diào)控機(jī)理的異同，揭示非豆科植物中與共生相關(guān)的基因及調(diào)控機(jī)制。5）在豆科植物固氮根瘤形態(tài)發(fā)育與其他不同器官的關(guān)系方面：整合百脈根、蒺藜苜蓿的基因組信息和豌豆EST信息，設(shè)計(jì)芯片，分析野生型和突變體的表達(dá)譜，以及應(yīng)用酵母雙雜交等技術(shù)，尋找與COCH、BIO1/ELE1和ELE2

21、基因相互作用的基因/蛋白，確定COCH、BIO1/ELE1和ELE2基因所參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。探討根瘤及側(cè)根發(fā)育的分子途徑異同；COCH對根瘤屬性（有限和無限型）決定的分子機(jī)理。BIO1/ELE1和ELE2基因所涉及的影響豆科作物整株形態(tài)發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，及其在根瘤形態(tài)發(fā)生的分子決定機(jī)制。預(yù)期研究目標(biāo)：1) 建立根瘤菌與宿主植物共生關(guān)系早期蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，分離和鑒定參與根瘤形成和發(fā)育功能基因及其調(diào)控蛋白20-30個(gè)；確定結(jié)瘤因子信號通路調(diào)控的結(jié)瘤因子失活的分子機(jī)理（反饋調(diào)節(jié)通路），找到抑制結(jié)瘤因子活性的結(jié)瘤因子水解酶基因，研究這些與結(jié)瘤因子相關(guān)的基因在共生結(jié)瘤過程中的作用；確

22、定豆科植物中與根瘤菌型效應(yīng)因子互作的基因，并闡明型效應(yīng)因子被釋放進(jìn)入了豆科宿主的細(xì)胞，及在特異性宿主結(jié)瘤過程中蛋白與蛋白互作的功能，了解型效應(yīng)因子在宿主和非宿主豆科植物細(xì)胞中的分子機(jī)制。確定在豆科植物中對根瘤菌的胞外寡糖的識別和共生作用相關(guān)的基因；了解胞外寡糖在宿主和非宿主豆科植物上的作用和分子機(jī)制。進(jìn)一步闡明根瘤菌共生信號在豆科植物中接受、傳遞及其調(diào)控機(jī)制。為擴(kuò)大根瘤菌宿主植物范圍，探索創(chuàng)建非豆科植物共生固氮體系的可能性提供科學(xué)依據(jù)。2）建立豆科植物與根瘤菌共生固氮突變體庫，分離和鑒定30-50個(gè)與共生固氮相關(guān)的突變體，闡明根瘤形態(tài)發(fā)生以及根瘤屬性的分子機(jī)制，根瘤形成與JA等植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

23、途徑的相關(guān)性。3）通過對豆科植物與根瘤菌、AM真菌共生的異同以及與非豆科植物比較基因組學(xué)研究；通過構(gòu)建對結(jié)瘤因子響應(yīng)的轉(zhuǎn)基因水稻，即擁有功能性的結(jié)瘤因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的水稻，闡明非豆科植物中存在哪些與共生固氮相關(guān)基因的功能及調(diào)控機(jī)制。課題承擔(dān)單位：中山大學(xué)、中科院上海植物生理生態(tài)研究所課題負(fù)責(zé)人：Staehelin C.46博士教授中山大學(xué)主要學(xué)術(shù)骨干：程 奇43博士教授中山大學(xué)謝致平44 博士副教授中山大學(xué)羅 達(dá) 52博士教授中科院上海植物生理生態(tài)所王彥章30博士副研究員中科院上海植物生理生態(tài)所羅 利30博士副研究員中科院上海植物生理生態(tài)所陳愛民40碩士副研究員中科院上海植物生理生態(tài)所經(jīng)費(fèi)比例

24、： 21.67%2 根瘤菌固氮系統(tǒng)調(diào)控的分子機(jī)理借助分子生物學(xué)和現(xiàn)代生物技術(shù)，開展生物固氮作用的分子機(jī)理研究，在分子水平上解決低等微生物與高等植物遺傳信息的交流、共生固氮體系的建立、固氮過程中能量物質(zhì)的交換、及固氮功能的發(fā)揮等科學(xué)問題。為擴(kuò)大根瘤菌宿主植物范圍、提高生物固氮效率，探索建立非豆科植物共生體系及自主固氮提供科學(xué)依據(jù)，為其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，以緩解農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長期和大量施用工業(yè)氮肥而導(dǎo)致的能源、環(huán)境問題，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供新的途徑。主要研究內(nèi)容：1）苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）LysR和GntR轉(zhuǎn)錄因子家族中共生固氮必需基因的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)理

25、。雙組份系統(tǒng)（組氨酸激酶和反應(yīng)蛋白）調(diào)節(jié)根瘤菌細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的分子機(jī)理。2）根瘤菌群體感應(yīng)系統(tǒng)、型分泌系統(tǒng)的底物蛋白及胞外多糖合成基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，這些系統(tǒng)在根瘤菌共生固氮過程中作用及其分子機(jī)理。3）類菌體及其與宿主方控制類菌體分化、固氮、衰老的功能基因組，dmtH，opa22, lpsH對華癸中生根瘤菌類菌體分化和根瘤發(fā)育的調(diào)控作用。4）根瘤菌生物多樣性及其環(huán)境與固氮作用的關(guān)系、新功能基因的發(fā)掘。預(yù)期研究目標(biāo)：1) 建立類菌體分化與固氮根瘤發(fā)育過程中根瘤菌與宿主植物間蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，分離和鑒定根瘤菌-宿主共生體系雙方控制類菌體分化、共生固氮和根瘤衰老的功能基因、調(diào)控蛋白及信號分子20

26、-30個(gè)，闡明各功能基因的結(jié)構(gòu)與功能及其調(diào)控機(jī)制。為揭示根瘤菌與宿主植物在共生中、晚期相互作用的分子機(jī)制提供科學(xué)資料。2) 建立根瘤菌“組學(xué)”研究平臺，在自生和共生條件下開展根瘤菌共生固氮基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組學(xué)的研究，分離和鑒定LysR、GntR等家簇轉(zhuǎn)錄因子及靶基因30-50個(gè)，闡明根瘤菌代謝與共生固氮功能的相關(guān)性和調(diào)控機(jī)理，為改造和提高共生固氮效率奠定理論基礎(chǔ)。3) 分離根瘤菌群體感應(yīng)系統(tǒng)、型分泌效應(yīng)子及胞外多糖等與共生相關(guān)基因20-30個(gè)，闡明這些基因在不同環(huán)境條件下的功能和作用機(jī)制，揭示根瘤菌環(huán)境適應(yīng)性與競爭結(jié)瘤之間的相關(guān)性，為生物固氮在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐

27、。課題承擔(dān)單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：張忠明54碩士教授華中農(nóng)業(yè)大學(xué)主要學(xué)術(shù)骨干： 李友國42博士教授華中農(nóng)業(yè)大學(xué)朱 輝32博士講師華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李一星30博士講師華中農(nóng)業(yè)大學(xué)朱 軍40博士教授 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)鐘增濤35博士副教授南京農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭會明27碩士講師南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王 卉29博士講師南京農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)費(fèi)比例：21.67%3 固氮菌氮、碳代謝基因表達(dá)的調(diào)控偶聯(lián)及固氮基因向真核生物的轉(zhuǎn)移長期以來，微生物體內(nèi)碳代謝與固氮及氮代謝之間的調(diào)控偶聯(lián)一直不清。然而，生物固氮是一個(gè)高耗能的過程，可供固氮微生物使用的植物光合作用產(chǎn)物（碳水化合物）的質(zhì)和量是限制其固氮效率的主要瓶頸。如何提供更多能源

28、是提高共生固氮效率的關(guān)鍵。實(shí)為提高共生固氮效率的必由之路。目前已經(jīng)有可能進(jìn)行這方面的研究，但當(dāng)前國際上尚未見有開展這方面的研究報(bào)道。主要研究內(nèi)容：1）在結(jié)構(gòu)層面和基因組水平，研究固氮及氮代謝基因調(diào)控機(jī)理，研究與碳代謝系統(tǒng)及其基因的調(diào)控偶聯(lián)機(jī)制。在固氮及氮代謝基因調(diào)控機(jī)理方面，擬從s54-RNA聚合酶、AAA+家族激活蛋白、DNA彎曲蛋白及其靶位點(diǎn)這些主要元件出發(fā)，研究s54-RNA聚合酶激活復(fù)合體的組裝機(jī)制，及其在結(jié)構(gòu)特征與功能實(shí)現(xiàn)之間的相互關(guān)系；在與碳代謝系統(tǒng)及其基因的調(diào)控偶聯(lián)機(jī)制方面，前期工作解析了碳代謝與氮代謝之間的調(diào)控偶聯(lián)關(guān)系，因此本課題的研究內(nèi)容是碳代謝與固氮之間的調(diào)控偶聯(lián)關(guān)系及其調(diào)

29、控機(jī)制。2）結(jié)合生物物理、生物化學(xué)和生理學(xué)手段，從蛋白結(jié)構(gòu)入手，對DCT系統(tǒng)上游的信號接收、轉(zhuǎn)導(dǎo)，直至下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制做深入的研究。研究DCT系統(tǒng)可能存在的一個(gè)“雙通路”感應(yīng)機(jī)制，即DctB對四碳二羧酸的感應(yīng)可能是直接與間接兩種機(jī)制并存的。而且，DctA與DctB的相互作用很可能更深層次地參與了DCT系統(tǒng)的調(diào)控。3）固氮基因向單細(xì)胞真核生物酵母菌、衣藻轉(zhuǎn)移和表達(dá)研究：酵母線粒體遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建；鉬運(yùn)輸（molybdenum transport）系統(tǒng)的構(gòu)建；研究RNA聚合酶對固氮基因表達(dá)的影響（RNA聚合酶類型、s因子種類、DNA折疊蛋白種類等）；線粒體呼吸耗氧與固氮酶厭氧的關(guān)系；探索線粒體

30、及葉綠體與細(xì)胞質(zhì)之間的氨基酸穿梭往返機(jī)制對生物固氮效果的影響。4）藍(lán)藻固氮細(xì)胞分化及其調(diào)控機(jī)制及光合與固氮的偶聯(lián)機(jī)制研究。5）根瘤菌促進(jìn)水稻生長及兩者相互作用機(jī)理研究：根瘤菌接種水稻后成為內(nèi)生菌分布在植物全身，并能提高光合作用，促進(jìn)生長。蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明有光合作用和能量等相關(guān)的一些蛋白（如Rubisco活化酶和PSII光合放氧蛋白）表達(dá)顯著上調(diào)。基于這個(gè)基礎(chǔ)，需深入研究根瘤菌因子與水稻相關(guān)基因的相互作用及其機(jī)理，為根瘤菌在非豆科植物上的廣泛應(yīng)用奠定理論依據(jù)。主要研究目標(biāo)：1）在結(jié)構(gòu)層面上，在基因組水平揭示固氮及氮代謝基因調(diào)控機(jī)理，揭示與碳代謝系統(tǒng)及其基因的調(diào)控偶聯(lián)機(jī)制，不僅對生物固氮調(diào)控有重

31、要意義，也將對基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)研究有重要貢獻(xiàn)為提高固氮效率奠定理論基礎(chǔ)。2）在結(jié)構(gòu)層面上解析根瘤菌共生固氮的唯一碳源（能量）供應(yīng)系統(tǒng)Dct系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)原理及其調(diào)控機(jī)制，為提高共生固氮效率奠定理論基礎(chǔ)。3）通過建立和操作單細(xì)胞真核生物酵母菌線粒體、衣藻葉綠體遺傳操作系統(tǒng)，探索固氮基因簇向真核生物轉(zhuǎn)化和表達(dá)的機(jī)制，進(jìn)行固氮基因向真核生物橫向轉(zhuǎn)移的有益嘗試，為建立非豆科植物（包括糧食作物）自主固氮體系進(jìn)行探索。4）在分子水平解析藍(lán)藻固氮細(xì)胞分化及其調(diào)控機(jī)制；根瘤菌作為內(nèi)生菌對水稻具有促生作用的原理。課題承擔(dān)單位：北京大學(xué)、中國科學(xué)院植物研究所課題負(fù)責(zé)人：王憶平49博士教授北京大學(xué)主要學(xué)術(shù)骨干：趙

32、進(jìn)東53博士院士北京大學(xué)蘇曉東45博士教授北京大學(xué)張曉東42博士教授北京大學(xué)梁宇和38博士副教授北京大學(xué)田哲賢 38博士講師北京大學(xué)文 津42碩士講師北京大學(xué)沈世華46博士研究員中國科學(xué)院植物研究所陳 暉48博士研究員中國科學(xué)院植物研究所唐明娟37博士助研究員中國科學(xué)院植物研究所楊明峰 38博士助研究員中國科學(xué)院植物研究所經(jīng)費(fèi)比例：28.33%4 聯(lián)合固氮菌固氮基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控與酶催化分子機(jī)理聯(lián)合固氮作用有三個(gè)重要的限制因子，即氧(失活)、銨(抑制)和能量(限制)。其中，能量限制和銨抑制又是導(dǎo)致目前田間聯(lián)合固氮效率低下的最主要限制因子。我們擬利用功能基因組、基因芯片、蛋白質(zhì)相互作用組等技術(shù)平臺，針

33、對斯氏假單胞菌A1501和巴西固氮螺菌等模式聯(lián)合固氮菌和上述主要限制因子，在聯(lián)合固氮微生物功能基因組、聯(lián)合固氮基因表達(dá)調(diào)節(jié)以及固氮酶催化機(jī)制等開展研究工作。主要研究內(nèi)容：1）開展聯(lián)合固氮微生物比較基因組合生物固氮體系進(jìn)化研究，對生物固氮體系的不同進(jìn)化類型進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的系統(tǒng)分析，揭示生物固氮進(jìn)化途徑、動力和機(jī)制。在建立全基因組和芯片平臺的基礎(chǔ)上，比較在不同條件下聯(lián)合固氮微生物基因表達(dá)譜及其差異，研究聯(lián)合固氮基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。分析鑒定可能參與細(xì)菌氮信號傳導(dǎo)、調(diào)控或保持最佳固氮水平的新基因和新機(jī)制。2）充分利用我國聯(lián)合固氮微生物資源優(yōu)勢，研究環(huán)境脅迫因子（如氧敏感、氨阻遏、溫度效應(yīng)等）對聯(lián)合固氮微

34、生物根際競爭和固氮效率的影響，系統(tǒng)研究了聯(lián)合固氮體系形成的分子機(jī)理，研究聯(lián)合固氮微生物對土壤環(huán)境變化的適應(yīng)能力,探討提高作物與固氮微生物之間的聯(lián)合固氮效率的策略，利用基因工程技術(shù)改造固氮微生物，為探討穩(wěn)定聯(lián)合固氮體系建立的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。3）在固氮酶還原氮?dú)夂唾|(zhì)子的分子機(jī)制方面，利用生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)化學(xué)理論，分析預(yù)測P-cluster和FeMoco之間的螺旋上單個(gè)氨基酸替換后固氮酶結(jié)構(gòu)的變化和可能對電子質(zhì)子傳遞的影響。采用分子生物學(xué)技術(shù)對固氮酶MoFe蛋白亞單位中FeMo輔因子（FeMoco）周圍多肽環(huán)境中保守氨基酸及與FeMoco Mo端相連的高檸檬酸的定位誘變，構(gòu)建不同的突變

35、株，研究這些突變株催化N2、H+ 和C2H2還原的性質(zhì)。分別研究野生型及各突變株固氮酶還原N2和H+的動力學(xué)、EPR、CD波譜、核磁、振動光譜、穆斯堡爾光譜、時(shí)間分析光譜等特征，研究固氮酶催化活性中心結(jié)合、催化底物分子的作用機(jī)理，探明底物在活性中心上存在遷移的可能性，明確N2的絡(luò)合和還原是否在FeMo-co 中心硫原子（S2B）的Fe2和Fe6上，以及N2和H+還原的兩條電子質(zhì)子傳遞通道。主要研究目標(biāo)：1） 開展聯(lián)合固氮微生物比較基因組和生物固氮體系進(jìn)化研究以及在不同條件下聯(lián)合固氮微生物基因表達(dá)譜研究，揭示生物固氮進(jìn)化途徑、動力和機(jī)制，分析鑒定可能參與細(xì)菌氮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控或保持最佳固氮水平的新

36、基因15-20個(gè)。2） 系統(tǒng)研究聯(lián)合固氮體系形成的分子機(jī)理，探討提高作物與固氮微生物之間的聯(lián)合固氮效率的新策略3-5種，為探討穩(wěn)定聯(lián)合固氮體系建立的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。 3） 分析預(yù)測P-cluster和FeMoco之間螺旋上單個(gè)氨基酸替換后固氮酶結(jié)構(gòu)的變化和可能對電子質(zhì)子傳遞的影響，對固氮酶MoFe蛋白亞單位中FeMo輔因子周圍多肽環(huán)境中保守氨基酸定位誘變并構(gòu)建不同的突變株5-10株，明確N2的絡(luò)合和還原在靠近FeMoco 中心硫原子的Fe2和Fe6上發(fā)生，以及用于 N2和H+還原的兩條電子質(zhì)子傳遞通道。 課題承擔(dān)單位：中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：燕永亮32博士副研究員中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所主要學(xué)術(shù)骨干：平淑珍49碩士副研究員中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所陳 明46碩士副研究員中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所林 敏46博士研究員中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所徐榮旗44博士博