酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用

1、 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用摘要: 酶聯(lián)免疫吸附是將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合發(fā)展建立的一種免疫分析技術(shù)。文中主要從農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、違禁藥物、轉(zhuǎn)基因食品、病原微生物、生物毒素以及其他成分等幾方面, 對(duì)該技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述, 并提出了存在的問題以及展望。關(guān)鍵詞: 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù); 食品安全檢測(cè); 應(yīng)用Application of ELISA technology on food safety detectionAbstract: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay is an immunoassay tec

2、hnology established on the highly specific-antibody reaction and efficient catalysis is of enzyme. In this paper,the application of ELISA on food safety detection is reviewed, including pesticide residue,animal drug residue,forbidden drugs,genetically modified foods,pathogenic microorganisms,biotoxi

3、n and others,and the existed problems and corresponding methods to solution are proposed.Key word: enzyme-linked immunosorbent assay;food safety detection;application 食品安全問題是全球關(guān)注的焦點(diǎn),它直接影響人類健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展,幾年前的蘇丹紅事件、啤酒甲醛風(fēng)波、人造蜂蜜事件、乃至今年的三鹿奶粉事件都給人們敲響了食品安全的警鐘。如何快速、有效檢測(cè)食品中的污染物殘留,保證食品的安全供應(yīng)是食品檢驗(yàn)中的一個(gè)重點(diǎn)。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELIS

4、A)是在免疫熒光和放射免疫分析技術(shù)基礎(chǔ)上形成的,將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合的一種免疫分析方法1。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、有效、特異性強(qiáng),能廣泛用于臨床標(biāo)本、藥物殘留、轉(zhuǎn)基因食品以及病原微生物檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。本文主要概述了酶聯(lián)免疫吸附法在食品安全檢測(cè)中的研究及應(yīng)用前景。 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,簡(jiǎn)稱ELISA)是一種固相酶免疫分析方法。它始于1971年En-gvall用堿性磷酸酯酶標(biāo)記的免疫球蛋白測(cè)定IgG,隨后這種方法得到迅速發(fā)展和不斷完善。由于ELISA結(jié)合了免疫熒光法和放射免疫法兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),具有選擇性好、

5、靈敏度高、結(jié)果判斷客觀準(zhǔn)確、檢測(cè)速度快、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn),因而彌補(bǔ)了經(jīng)典化學(xué)法和其他儀器法的不足,目前已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域,在食品領(lǐng)域中應(yīng)用相對(duì)較少,但隨著食品安全問題日益受到社會(huì)各界的關(guān)注,它在食品安全分析中的研究和應(yīng)用越來越多。為此本文就ELISA在食品安全分析中的應(yīng)用作以如下評(píng)述,旨在促進(jìn)該技術(shù)在食品安全分析領(lǐng)域中的發(fā)展。1 酶聯(lián)免疫吸附法概述1. 1原理 ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性2。在測(cè)定時(shí),受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的

6、抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析3。1.2ELISA分類ELISA方法的分類至今還沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),最常用的測(cè)定方法有三類:(1) 間接法測(cè)定抗原:(2)雙抗體夾心法測(cè)抗原:(3)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原1.3 與其他檢測(cè)法相比的優(yōu)勢(shì) 目前用于食品安全檢測(cè)的方法有很多，如薄層色譜(TLC)、微生物法、氣相色譜(GC)、質(zhì)譜(MS

7、)、高效液相色譜(HPLC)、和核酸探針技術(shù)等。TLC 必須進(jìn)行較為復(fù)雜的樣品預(yù)處理和抽提，且不能定量，靈敏度低。微生物法不易篩選到特別敏感的菌株，也只能定性不能定量，易受其他抗菌藥物的影響。GC 及 H P L C等雖靈敏度高，但設(shè)備昂貴，樣品預(yù)處理復(fù)雜，檢測(cè)費(fèi)用高，難以推廣使4，核酸探針則在實(shí)驗(yàn)過程中易受到污染。相比之下，ELISA 不僅靈敏度高、干擾小、安全性高、污染少，而且操作簡(jiǎn)便快捷5，這些優(yōu)點(diǎn)使其可在蔬菜產(chǎn)區(qū)、蔬菜批發(fā)市場(chǎng)和海關(guān)配備，工作人員可隨身攜帶或建立固定的食品安全速測(cè)點(diǎn)，隨時(shí)把殘毒超標(biāo)的蔬菜、水果杜絕在食用或海關(guān)出口之前。2 ELISA 在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用2.1 食品中

8、農(nóng)藥殘留的測(cè)定 農(nóng)藥殘留是指農(nóng)藥使用后殘存于食品原料與半成品食品及成品中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物以及雜質(zhì)的總稱。目前, 農(nóng)藥殘留已成為食品中的主要安全問題之一, 也直接影響了我國(guó)農(nóng)副產(chǎn)品出口6。 農(nóng)藥屬于小分子物質(zhì), 是一種半抗原, 無免疫原性。檢測(cè)時(shí)首先要根據(jù)農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)選擇合成路線,人工合成抗原, 然后免疫 BALB/c 小鼠, 利用雜交瘤技 術(shù) 則 可 制 備 出 針 對(duì) 農(nóng) 藥 小 分 子 的 McAb。 由 于McAb 可以大量產(chǎn)生, 質(zhì)地均勻, 適于標(biāo)準(zhǔn)化管理且容易制備試劑盒。 常用的 ELISA 檢測(cè)的農(nóng)藥殘留種類有: 有機(jī)磷農(nóng)藥: 有報(bào)道7采用 ELISA 法檢測(cè)對(duì)乙酰

9、甲胺磷。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥: 駱愛蘭等8以菊酯類農(nóng)藥的通用結(jié)構(gòu)間苯氧基苯甲酸(PBA)為半抗原, 與牛血清蛋白(BSA)結(jié)合制備多種菊酯類農(nóng)藥有特異性的廣譜性抗體, 建立間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 檢測(cè)方法, 對(duì) PBA 最低檢出限達(dá) 0.193 g/mL, 抑制中濃度為 3.707 g/mL,且對(duì)氯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴 氰 菊 酯 均 有 特 異 性 識(shí) 別 。有 機(jī) 氯 類 農(nóng) 藥9:Deschamps 等用毒莠定與 BSA 結(jié)合免疫兔和小鼠,分別制備多克隆抗體和 McAb, 比較兩者的靈敏度和特異性, 兔抗血清的線性范圍為 5-5000 ng/mL, 最低檢出限為 5 ng

10、/mL, 小鼠 McAb 的線性范圍為 1-20 ng/mL, 最低檢出限為 1 ng/mL。2.2 食品中獸藥殘留和違禁藥物的測(cè)定 食品中獸藥殘留主要包括抗生素類、磺胺藥類、呋喃藥類、抗球蟲類、激素藥類和驅(qū)蟲藥類藥物。ELISA 操作簡(jiǎn)便、靈敏, 可使得痕量的藥物殘留分析成為普通實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù), 而且可同時(shí)檢測(cè)數(shù)十個(gè)甚至上百個(gè)樣品, 是十分理想的大批量樣品中藥物殘留的快速篩選手段。目前可供選擇的商品化的ELISA專用試劑盒、酶標(biāo)儀很多, 技術(shù)已相當(dāng)成熟10。瘦肉精是一種被各國(guó)禁止作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑使用的人工合成物質(zhì), 化學(xué)名為鹽酸克倫特羅, 是一種2- 腎上激素受體激動(dòng)劑?；瘜W(xué)性質(zhì)穩(wěn)定, 加熱

11、到170 才能分解, 因此, 一般的烹調(diào)加熱方法不能將豬肉和臟器中殘留的 “瘦肉精”毒性破壞。一旦人食用了含瘦肉精的肉, 會(huì)導(dǎo)致頭痛、頭暈、心悸、四肢麻木等一系列不良反應(yīng), 同時(shí)會(huì)在人體內(nèi)蓄積, 可能最終產(chǎn)生致畸、致癌、致突變作用11。目前國(guó)內(nèi)外已 研 制 出 同 類 多 種 試 劑 盒 用 于 檢 測(cè) ,其大都采用競(jìng)爭(zhēng) ELISA 法, 應(yīng)用于瘦肉精檢測(cè)靈敏度高, 成本低, 前處理簡(jiǎn)單且快速, 適用于現(xiàn)場(chǎng)定性快速檢測(cè)及快速篩選檢驗(yàn)12。己烯雌酚(diethylstilbestrol, DES)為人工合成的二苯乙烯類雌激素藥, 具有很強(qiáng)的副作用, 能夠破壞機(jī)體遺傳物質(zhì), 最終導(dǎo)致基因突變而引發(fā)

12、機(jī)體腫瘤。邴愛英等13利用親和素與生物素之間親和力極強(qiáng), 且具有高度特異性和穩(wěn)定性的原理, 研究建立雙抗體夾心 ELISA 法。用人工合成的己烯雌酚免疫原多次免疫家兔, 獲取高效價(jià)抗體。純化抗體經(jīng)生物素標(biāo)記, 可同辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的親和素特異結(jié)合。采用純化的抗體包被 96 孔板, 形成固相抗體。加入不同濃度的己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品后, 再加入生物素標(biāo)記抗體, 以酶標(biāo)記親和素作為探針, 經(jīng)酶底物顯色反應(yīng)可獲得良好的 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線。該測(cè)定方法最低檢測(cè)限為 0.125 ng/mL, 可定量檢測(cè)范圍為 0.2515.60 ng/mL, 但農(nóng)業(yè)部 動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量中規(guī)定, DES

13、 在所有食品動(dòng)物可食組織中的殘留限量為不得檢出, 因此該方法檢測(cè)靈敏度仍然較低, 需進(jìn)一步改進(jìn)方法, 降低檢測(cè)限。ELISA 法還可檢測(cè)動(dòng)物性食品中的四環(huán)素類抗生素殘留量, 精密度和靈敏度高, 且檢測(cè)速度快等特點(diǎn), 適合進(jìn)行快速檢測(cè)14。2.3 轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因食品的安全性是最近有關(guān)食品安全性研討的熱點(diǎn)。由于其安全性還在爭(zhēng)議之中, 許多國(guó)家都有嚴(yán)格的法規(guī)來管理轉(zhuǎn)基因食品。其中有一條規(guī)定就是要求在轉(zhuǎn)基因食品包裝上貼上標(biāo)簽, 讓消費(fèi)者有知情權(quán)。這就需要對(duì)轉(zhuǎn)基 因食品進(jìn)行檢測(cè)。ELISA 法就是通過檢測(cè)某些特定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)蛋白,以分析食品是否來自轉(zhuǎn)基因生物或者含有轉(zhuǎn)基因成分, 或間接檢測(cè)轉(zhuǎn)基

14、因表達(dá)的目的蛋白質(zhì)15。2.4 食品中病原微生物的檢測(cè) 病原微生物是食品生物性污染的重要因素。常規(guī)的微生物學(xué)檢驗(yàn)通常以分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)來進(jìn)行判斷, 不僅需要大量的手工勞動(dòng),而且檢驗(yàn)周期長(zhǎng)(6-7 d)16。同時(shí)有些細(xì)菌, 如副溶血性弧菌、幽門螺桿菌、大腸桿菌等在低溫貧營(yíng)養(yǎng)的條件下, 可以進(jìn)入 “活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”, 在適當(dāng)狀態(tài)下還可以復(fù)蘇, 仍具有致病力。因此常規(guī)的培養(yǎng)法無法檢測(cè)到處于這種狀態(tài)的細(xì)菌容易造成漏檢。而ELISA 在這方面具有一定的潛力。ELISA 法可用于檢測(cè)食品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、軍團(tuán)菌、大腸桿菌 O- 157 等致病微生物。其中沙門氏菌是食物細(xì)菌性中毒中

15、最常見的致病菌,它嚴(yán)重影響著食品安全。傳統(tǒng)的檢測(cè)法試劑繁雜、檢測(cè)周期長(zhǎng), 不能適應(yīng)實(shí)際需要, 而采用制備單克隆抗體的 ELISA 方法則能方便、快速地篩選出被沙門氏菌污染的食品或飼料17。其基本步驟是首先包被抗沙門氏菌的單克隆抗體, 然后在微孔板內(nèi)加入經(jīng)過前增菌和選擇性增菌的待檢樣品, 樣品中如有沙門氏菌存在, 則與微孔板內(nèi)的特異性抗體結(jié)合形成復(fù)合物。洗滌掉多余的反應(yīng)物, 加入酶標(biāo)抗體,則形成抗體抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物。加入底物, 測(cè)定光密度, 當(dāng)光密度值大于或等于臨界值時(shí), 即可推斷為陽性。2.5 食品中生物毒素的檢測(cè) 生物毒素是其產(chǎn)生菌在適合產(chǎn)毒的條件下所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。在食品加工時(shí)雖然經(jīng)

16、加熱、烹調(diào)等熱處理, 但所產(chǎn)生的毒素結(jié)構(gòu)一般不能被破壞,所以食品中生物毒素也日益受到關(guān)注18。黃曲霉毒素是一種致毒性和致癌性很強(qiáng)的真菌毒素, 各國(guó)都嚴(yán)格限制其在食品中的含量。1977 年, La Well 首次采用了 ELISA 法來檢測(cè)黃曲霉毒素。蔣建云等利用ELISA 法的 AFB1 試劑盒, 通過抗黃曲霉毒素 B1 抗體與酶標(biāo)抗原、待測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)以及酶的催化顯色反應(yīng)相結(jié)合來檢測(cè)黃曲霉毒素 B1 的含量。具有分析速度快, 提取和純化步驟簡(jiǎn)便, 準(zhǔn)確度高、成本低、污染少, 一次可測(cè)定大批量等優(yōu)點(diǎn)19。2.6 食品中其他成分的檢測(cè)2.6.1 過敏性殘留物的檢測(cè) 食物過敏反應(yīng)已成為世界各

17、地普遍存在的一個(gè)嚴(yán)重問題, 引起了人們的廣泛關(guān)注。FAO(1995)報(bào)告的 8 類過敏食物分別是牛奶、雞蛋、魚、甲殼類(蝦、蟹、龍蝦)、花生、大豆、核果類(杏、板栗、腰果等)及小麥。它們中的大多數(shù)過性成分是蛋白質(zhì)。目前已建立的夾心 ELISA 法,用來檢測(cè)花生蛋白過敏物、- 乳球蛋白過敏物、榛實(shí)成分以及雞蛋過敏性蛋白質(zhì)20。2.6.2 功能因子的檢測(cè) 功能因子主要包括活性多糖、多不飽和脂肪酸、肽與蛋白質(zhì)、醇類、卵磷脂、乳酸菌、礦物質(zhì)、膳食纖維等。其通過激活酶的活性或其他途徑, 調(diào)節(jié)人體機(jī)能, 特殊功效主要集中在調(diào)節(jié)血脂、血糖、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、改善睡眠、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、耐缺氧、改善骨質(zhì)疏松、改

18、善視力等方面21。2.6.3 毒品、生物堿的檢測(cè) 目前, 已建立了針對(duì)海洛因、可卡因、嗎啡等毒品的 ELISA 檢測(cè)方法。在食品衛(wèi)生方面, 有些店家在食品中(尤其是火鍋、湯料等)添加罌粟殼(粉), 以招引顧客22。江蘇省微生物研究所針對(duì)罌粟殼中的罌粟堿已建立了 ELISA 檢測(cè)法,利用商品化的試劑盒檢測(cè)更為方便快捷。3 ELISA 存在的問題ELISA 因具特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、價(jià)廉和不需煩瑣的預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn), 已成為現(xiàn)場(chǎng)分析的首選方法23。但其應(yīng)用于食品安全檢測(cè)方面也存在著如下的一些問題: 制備抗體較困難; 對(duì)試劑的選擇性高; 不能同時(shí)分析多種成分; 對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)

19、; 分析低分子量或不穩(wěn)定的化合物有一定的困難; 靈敏度偏低以及難于標(biāo)準(zhǔn)化等24。如應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí), 抗農(nóng)藥抗體對(duì)于結(jié)構(gòu)非相關(guān)的靶抗原(農(nóng)藥)表現(xiàn)極高的特異性, 但某些與檢測(cè)農(nóng)藥結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的農(nóng)藥, 或待檢農(nóng)藥的代謝產(chǎn)物可能與抗待檢農(nóng)藥抗體發(fā)生不同程度的交叉反應(yīng)。如果樣品中存在這些物質(zhì), 將導(dǎo)致定量檢測(cè)準(zhǔn)確度降低, 使該農(nóng)藥的定量檢測(cè)降為半定量或定性檢測(cè)或者出現(xiàn)定性假陽性與假陰性,從而大大影響 ELISA 的可靠性和靈敏度25。 4 展望 ELISA 與其他技術(shù)相比, 具有靈敏度高, 特異性強(qiáng), 儀器設(shè)備要求不高, 測(cè)定成本低, 方法快速、簡(jiǎn)便, 試劑保存時(shí)間較長(zhǎng), 自動(dòng)化程度高, 無放射

20、性同位素污染等優(yōu)勢(shì); 但同時(shí)也存在局限性, 比如不能同時(shí)分析多種成分, 對(duì)試劑的選擇性高, 對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)26。所以未來的發(fā)展趨勢(shì)就在于開發(fā)高度免疫原性的重組抗原, 研究多項(xiàng)標(biāo)記快速測(cè)定方法, 將酶體外定向進(jìn)化應(yīng)用到檢測(cè)中以及研發(fā)種類更多的全自動(dòng)酶聯(lián)免疫測(cè)定儀。這樣將擴(kuò)大檢測(cè)的范圍, 提高檢測(cè)的穩(wěn)定性, 加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)化, 同時(shí)也促進(jìn)了商品化的應(yīng)用27。另外, 還應(yīng)與其他檢測(cè)技術(shù)如色譜、PCR 等結(jié)合起來, 實(shí)現(xiàn)強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合, 優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。在未來食品安全的快速檢測(cè)中發(fā)揮更加突出和重要的作用。參考文獻(xiàn):1 唐英章.現(xiàn)代食品安全檢測(cè)技術(shù)M.北京:科學(xué)出版社,2004:364,380-3

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