DNA電泳常見問題分析講課稿

1、DNA 電泳常見問題分析DNA 電泳常見問題凝膠電泳操作注意事項(xiàng)1、 瓊脂糖：不同廠家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA 的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。2、 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶化的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，以免影響電泳結(jié)果。3、 電泳緩沖液：為保持電泳所需的離子強(qiáng)度和pH，應(yīng)經(jīng)常更新電泳緩沖液 。4、 樣品加入量：一般情況下，0.5cm 寬的梳子可加 0.5 g的 DNA 量,加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及 DNA 中片段的數(shù)量和大小而定.當(dāng)加樣孔大時(shí) ,樣品上樣量應(yīng)相應(yīng)加大 ,否則會(huì)造成條帶淺

2、甚至辨認(rèn)不清 ;反之則應(yīng)適當(dāng)減少加樣量，但是上樣量過多會(huì)造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾或彌散，對(duì)于較大的DNA 此現(xiàn)象更明顯。5、 DNA 樣品中鹽濃度會(huì)影響DNA 的遷移率，平行對(duì)照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。6、 DNA 遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辯范圍廣泛的DNA 分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA 分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段 DNA 的檢測(cè)應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，以提高分辨率。7.選擇的實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，處理時(shí)間不易過長(zhǎng)。8.在加入細(xì)胞裂解緩沖液前，細(xì)胞必須均勻分散，以減少DNA 團(tuán)塊形成 。9. 提取的 DNA 不易

3、溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。10. 電泳檢測(cè)時(shí) DNA 成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。11.分光光度分析 DNA 的 A280/A260 小于 1.8；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下，應(yīng)加入 SDS 至終濃度為 0.5%，并重復(fù)步驟 2 8。12.酚/氯仿 /異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸?。汉邼舛鹊腄NA ，可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量DNA 電泳常見問題分析之一1 請(qǐng)問配制聚丙烯酰胺凝膠電泳膠時(shí)，促凝的是TEMED 還是過硫酸銨？膠聚時(shí)間很長(zhǎng)如何解決？過硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需的自由基，而T

4、EMED 通過催化過硫酸銨形成自由基而加速它倆的聚合。膠聚合時(shí)間長(zhǎng)可能是TEMED 失效了，過硫酸銨固體時(shí)間過久也會(huì)失效的。一個(gè)讓 PAGE 膠很快聚合的方法：不要先配 AP （過硫酸銨）溶液，因?yàn)锳P 很容易變質(zhì)。在保證TEMED 和 AP 質(zhì)量的情況下，每次配膠時(shí)，直接稱一定量的AP 粉劑溶入液體狀態(tài)的PAGE 中，這樣可以保證AP 的催化能力，而且可以多加一點(diǎn)。配25ml 的 PAGE 膠，加 0.03 克 AP 粉劑，最后加入25ulTEMED ， 20 分鐘左右就可以凝固（當(dāng)然這個(gè)時(shí)候拔梳子，會(huì)有少量未凝固的PAGE 在孔里形成絲狀干擾，使加的樣品看起來不太漂亮，但一般不影響跑膠效果

5、和條帶的形狀和位置）。2 DNA 電泳的 MARKER 怎么是扭曲的？1、 配制膠時(shí)的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時(shí)配制的.最好是同時(shí)配制 .電泳時(shí)緩沖液高過液面 12mm 即可。2、 電泳時(shí)電壓過高 ,可以在電泳前 15 分鐘用較低電壓 (3V/cm), 等條帶出孔后比較漂亮了.然后再調(diào)電壓。3、 上樣時(shí)盡量慢慢加樣 ,等樣品自然沉降后再加電壓。3 跑出的 DNA 帶模糊？1、 DNA 降解：避免核酸酶污染。2、 電泳緩沖液陳舊 :電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH 值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、 所用電泳條件不合適 :電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過20V/c

6、m ，溫度 30；巨大 DNA 鏈電泳，溫度應(yīng) 15 ；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。4、 DNA 上樣量過多：減少凝膠中DNA 上樣量。5、 DNA 樣含鹽過高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。6、 有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。7、 DNA 變性：電泳前勿加熱，用20mM NaCl 緩沖液稀釋 DNA 。4 有不規(guī)則 DNA 帶遷移 ?1、 對(duì)于 /Hind III片段 cos 位點(diǎn)復(fù)性：電泳前于65 加熱 DNA 5 分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘。2、 電泳條件不合適：電泳電壓不超過20V/cm ；溫度 30 ；經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、 DNA 變性：以 20mM NaCl

7、Buffer稀釋 DNA ，電泳前勿加熱。5 跑出的 DNA 條帶帶弱或無 DNA 帶？1、 DNA 的上樣量不夠：增加DNA 的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng)降低。2、 DNA 降解：避免 DNA 的核酸酶污染。3、 DNA 走出凝膠：縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度。4、 對(duì)于 EB 染色的 DNA ，所用光源不合適 ?應(yīng)用短波長(zhǎng)（ 254nm ）的紫外光源。6 跑出的 DNA 帶缺失不完整是怎么回事?1、 如果是小 DNA 帶走出凝膠，可以縮短電泳時(shí)間或降低電壓或增強(qiáng)凝膠濃度。2、 分子大小相近的DNA 帶不易分辨 ? 增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度

8、。3、 DNA 變性：電泳前請(qǐng)勿高溫加熱DNA 鏈，以 20mM NaCl Buffer稀釋 DNA 。DNA 鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適? 在脈沖凝膠電泳上分析。7 做 PCR 電泳后跑電泳，目的基因是489BP 的，結(jié)果每次切膠回收后再跑電泳就變成500 多了，快到 600 了？為什么？有時(shí)只靠電泳結(jié)果判斷是不準(zhǔn)確的，同樣的片段每次跑的遠(yuǎn)近會(huì)有不同。有經(jīng)驗(yàn)顯示目的片段是 1300 多，結(jié)果就跑到1000 的 marker 下面去了，后來證實(shí)片段沒有問題。也有做的一個(gè)片段也是這樣，是490BP. 理論上兩個(gè)條帶一樣，可是PCR 結(jié)果顯示就是大小不一致。然后回收以后的檢測(cè)結(jié)果又全部都一樣了，后

9、來又拿去做了下一個(gè)測(cè)序，才知道根本沒有問題。8：為什么 marker 條帶非常模糊，無法辨別具體條帶？A ：出現(xiàn)上述情況，可能有以下幾個(gè)原因：1. marker 條帶出現(xiàn)了降解。請(qǐng)確保在使用過程中避免核酸酶污染； 2. 電泳緩沖液陳舊。電泳緩沖液多次使用后，離子濃度降低， pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果，建議經(jīng)常更換電泳緩沖液； 3. 電泳條件不合適。電泳時(shí)電壓應(yīng)不超過 20V/cm，溫度應(yīng)低于 30 ；4. marker 上樣量過多。 請(qǐng)根據(jù)說明書選用合適上樣量； 5. 凝膠質(zhì)量不好。建議使用質(zhì)量較好的瓊脂糖；此外，凝膠凝固不均勻也會(huì)導(dǎo)致條帶模糊。9：為什么 marker 條帶出

10、現(xiàn)不規(guī)則的條帶（如啞鈴狀等）？A ：出現(xiàn)上述情況，多與以下幾個(gè)原因有關(guān)：1.電泳緩沖液陳舊。老化的電泳緩沖液離子濃度降低， pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果，建議經(jīng)常更換電泳緩沖液；2.電泳條件不合適。電泳時(shí)電壓應(yīng)不超過20V/cm，電壓太高可能也會(huì)導(dǎo)致marker 條帶出現(xiàn)不規(guī)則現(xiàn)象 。此外， 凝膠質(zhì)量差以及凝膠冷卻時(shí)凝固不均勻也會(huì)導(dǎo)致該現(xiàn)象出現(xiàn)。10 為什么marker條帶非常弱或者根本沒有條帶？A ：出現(xiàn)上述情況可能是：1. marker上樣量較低，可適當(dāng)增加上樣量；2.凝膠質(zhì)量較差或凝膠凝固不均勻也會(huì)導(dǎo)致電泳條帶弱或根本沒有條帶；3.電泳時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致marker條帶跑出凝膠，

11、可縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增加凝膠濃度。11：為什么marker缺帶？A ：對(duì)于含有較小片段的marker ，如果出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象，可能是因?yàn)椋?. 小條帶跑出凝膠或分子量大小非常相近的條帶不易辨認(rèn)所致，可適當(dāng)縮短電泳時(shí)間，降低電壓，同時(shí)增加凝膠濃度；2.凝膠中 EB含量過低，導(dǎo)致大片段結(jié)合EB量太少或沒有，在紫外光下亮度太低，可適當(dāng)增加EB用量。問題原因DNA 降解解決辦法避免核酸酶污染電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH 值上電泳緩沖液陳舊升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過 20V/cm ，溫度 30；巨大DNA所用電泳條件不DNA 鏈電泳，合適溫

12、度應(yīng) 15 ；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的帶模糊緩沖能力DNA 上樣量過減少凝膠中 DNA 上樣量多DNA 樣含鹽過電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽高有蛋白污染電泳前酚抽提去除蛋白不規(guī)則DNA帶遷移帶弱或無 DNA帶DNA帶缺失DNA 變性電泳前勿加熱，用 20mM NaCl 緩沖液稀釋 DNA對(duì)于 /Hind III電泳前于 65 加熱 DNA 5 分鐘，然后在冰上冷卻 5片段 cos 位點(diǎn)復(fù)性分鐘電泳條件不合適電泳電壓不超過 20V/cm ；溫度 30 ；經(jīng)常更換電泳緩沖液DNA 變性以 20mM NaCl Buffer稀釋 DNA ，電泳前勿加熱DNA 的上樣量增加 DNA 的上樣量；聚

13、丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳不夠靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng)降低DNA 降解避免 DNA 的核酸酶污染DNA 走出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度對(duì)于 EB 染色的DNA ，所用光源不合應(yīng)用短波長(zhǎng)（ 254nm ）的紫外光源適小 DNA 帶走出縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度凝膠分子大小相近的增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度DNA 帶不易分辨DNA 變性電泳前請(qǐng)勿高溫加熱 DNA 鏈，以 20mM NaClBuffer 稀釋 DNADNA 鏈巨大常規(guī)凝膠電泳不合適在脈沖凝膠電泳上分析問題可能原因解決方法DNA核酸酶污染每次吸取時(shí)更換滅菌槍頭，勿將Marker 降解電泳緩沖液帶入管中；用

14、后密閉 4°C保存保存不當(dāng)4°C 或-20 °C 保存，避免多次反復(fù)凍融；不可加熱DNA瓊脂糖質(zhì)量差使用質(zhì)量可靠的瓊脂糖制膠Marker 無法正電泳緩沖液多次使用后失更換緩沖液確分離效條帶黯淡核酸濃度過低增加上樣量核酸降解使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品DNA 條帶被示蹤染料掩提高上樣量；避免使用與目的片蓋段遷移率相同的示蹤染料條帶模糊電泳緩沖液多次使用后失更換緩沖液或彌散效核酸部分降解使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品核酸樣品純度差，含有酚 /仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、DNA 結(jié)合蛋白或高濃度的鹽鹽份等雜質(zhì)份電壓過低，電泳時(shí)間過長(zhǎng)根據(jù)凝膠大小和電泳緩沖液類型，

15、使用適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳染色時(shí)間過長(zhǎng)或拍照前放電泳結(jié)束后及時(shí)觀察、拍照置過久， DNA 條帶彌散條帶缺失條帶大小不正確DNA 條帶分子量過大分子量接近的 DNA 條帶沒有分開電泳緩沖液使用不當(dāng)電泳時(shí)間過長(zhǎng)或電壓過高， DNA 走出凝膠電極插反， DNA 走出凝膠核酸降解或形成聚合物 DNA酶切 Marker 的cos 位點(diǎn)復(fù)性相同分子量的 DNA 片段由于結(jié)構(gòu)或序列的差異而有不同的遷移率使用脈沖凝膠電泳選擇適當(dāng)?shù)哪z濃度進(jìn)行電泳SD 和 TBE 緩沖液適于分析較小分子量的 DNA 片段，大片段分子不能完全分離； TAE 緩沖液不適于分離很小的 DNA 片段縮短電泳時(shí)間，調(diào)整電壓正確連接電極方向加熱處理或重新制備樣品電泳前 65°C 加熱 5 分鐘，冰上冷卻 5 分鐘以后再上樣判斷 DNA 分子是否有特殊結(jié)構(gòu)，如缺口、超螺旋、二聚體等；富含 AT 堿基的 DNA 遷移率比同分子量富含 GC 堿基的 DNA 片段慢梳子變形，點(diǎn)樣孔不在同使用完好的梳子制膠一水平線上帶型異常不同樣本的上樣條件不同選用相同的上樣緩沖液，上樣量盡可能接近上