蛋白類藥物生產(chǎn)

1、 蛋白類藥物生產(chǎn)工藝 蛋白質(zhì)類藥物是生化藥物中非?；钴S的一個(gè)領(lǐng)域，目前的生化產(chǎn)品主要是從動(dòng)物臟器或組織包括人的血液中分離而得。20世紀(jì)70年代后，人們開始應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)一些蛋白質(zhì)藥物，已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品如胰島素、干擾素、白細(xì)胞介素、生長素、EPO、tPA、TNF等，現(xiàn)正從微生物和動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)轉(zhuǎn)向基因動(dòng)植物發(fā)展。 第一節(jié) 主要蛋白質(zhì)類藥物的制備 蛋白質(zhì)類藥物主要包括蛋白質(zhì)類激素、蛋白質(zhì)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子、血漿蛋白質(zhì)類、黏蛋白、膠原蛋白及蛋白酶抑制劑等，其作用方式包括對機(jī)體各系統(tǒng)和細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)、被動(dòng)免疫、替代療法等。一、蛋白質(zhì)激素類 蛋白質(zhì)類激素主要包括垂體蛋白質(zhì)激素、促性腺激素和其他

2、蛋白質(zhì)激素。其中垂體蛋白質(zhì)激素包括 生長素(GH)、催乳激素(PRL)、促甲狀腺素(TSH)、促卵泡激素(FSH)等。促性腺激素包括人絨毛膜促性腺激素(HCG)、血清促性腺激素( SGH )等。其他蛋白質(zhì)激素包括胰島素、胰抗脂肝素、尿抑胃素等。(一) 生長素(growthhormone，GH)生長素是動(dòng)物腦垂體前葉外側(cè)的特異分泌細(xì)胞分泌的一種促進(jìn)生長的蛋白質(zhì)激素，具有調(diào)節(jié)生長與發(fā)育的功能，對多種人類疾病有很好的療效。人生長素（human growth hormone，hGH）由一條191個(gè)氨基酸的多肽構(gòu)成的一鏈多肽的球形蛋白質(zhì)，分子中含兩條二硫鍵，分子量為21700，等電點(diǎn)4.9，沉降系數(shù)S2

3、0，W 2.179，其活性不需要整個(gè)分子結(jié)構(gòu)，N端1134氨基酸為活性所必需，C端的肽鏈起到保護(hù)作用，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與催乳素近似，故生長素有弱催乳素作用，而催乳素有弱生長素作用。生長素包含大小兩個(gè)環(huán)，以親水球蛋白的形式存在。不同種類動(dòng)物的生長素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與免疫性質(zhì)等都有較大差別。生長素的生產(chǎn)工藝有傳統(tǒng)的方法和基因工程技術(shù)方法。1生長素的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法 傳統(tǒng)方法是從腦垂體前葉分離純化，其生產(chǎn)工藝見圖11-1所示。圖11-1 提取法生產(chǎn)生長素的工藝路線透析內(nèi)液提取硫酸銨pH5.5離心上清夜分級沉淀硫酸銨pH7.5鹽析沉淀垂體前葉透析內(nèi)液溶解除鹽 透析上清夜鹽析沉淀鹽析硫酸銨pH4.0離心除鹽透析Tri

4、s-HCl緩沖液除雜蛋白離心吸附DE-52洗脫Sephadex G-75pH8.5透析硼砂-鹽酸液pH8.7離子層析DE-52pH8.7洗脫硼砂-鹽酸緩沖液生長素洗脫峰組分凍干（-30）除鹽透析腦垂體前處理透析內(nèi)液透析內(nèi)液活性組分傳統(tǒng)的工藝過程如下: 材料獲取 處死動(dòng)物，立即解剖，取出腦垂體，冰上速凍，-20冷凍保存。 預(yù)處理 腦垂體使用前，用蒸餾水沖洗數(shù)次，解凍，剝離前后葉。 勻漿 取動(dòng)物垂體前葉，分割成小塊，加水，用硫酸銨調(diào)pH至5.5，置組織搗碎機(jī)中勻漿。提取 對勻漿以水抽提，10 000rpm離心30min；取沉淀，以pH 4.0的0.1molL硫酸銨溶液抽提，離心（同上），取沉淀，再

5、用pH 5.5的0.25molL的硫酸銨溶液抽提，離心，取上清抽提液。沉淀 調(diào)節(jié)抽提液pH 7.5，加飽和硫酸銨溶液至硫酸銨濃度為lmolL，離心，取上清液。再沉淀 對上清液再加飽和硫酸銨溶液至1.8molL，離心，得沉淀。除鹽 將沉淀溶于少量蒸餾水中，對蒸餾水進(jìn)行透析，得透析內(nèi)液。等電點(diǎn)沉淀 將所得透析內(nèi)液用HCL或NaOH分別依次于pH 4.0和pH 4.9進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀以除去雜蛋白，離心、取上清液。鹽析 調(diào)上清液pH為4.0，加飽和硫酸銨溶液至濃度為1.25molL鹽析，離心，得沉淀物。除鹽 將沉淀物溶于少量蒸餾水中，對含0.1molL氯化鈉的Tris-HCL (pH 8.5) 緩沖溶液

6、進(jìn)行透析，得透析內(nèi)液。凝膠過濾 透析內(nèi)液上Sephades G-75凝膠柱，用含0.1 molL氯化鈉的50mmolL Tris-HCL (pH 8.5 )緩沖溶液進(jìn)行洗脫，分步收集，活性GH存在于第峰中。透析 將活性峰部分對6.5mmolL的硼砂-鹽酸(pH 8.7)緩沖溶液進(jìn)行透析，得透析內(nèi)液。層析 將透析內(nèi)液上DEAE-C(DE-52)柱，用含00.3molL氯化鈉的6.5mmolL硼砂-鹽酸 ( pH 8.0 ) 緩沖溶液進(jìn)行梯度洗脫，合并活性峰，脫鹽，凍干得GH。2人生長素的基因工程法hGH的種屬特異性很強(qiáng)，動(dòng)物生長激素不能用于人，所以開始時(shí)hGH的惟一來源是從人尸體的腦垂體中取得，

7、來源困難，價(jià)格昂貴，應(yīng)用受到限制。目前已利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)出hGH，美國的Genentech公司利用枯草桿菌系統(tǒng)表達(dá)的hGH產(chǎn)量高達(dá)1.5g/L，這也是第一代重組人生長激素，商品名稱為Protropin.生產(chǎn)路線如圖11-2所示對所有的圖，在圖的圖題后添加（引自xxx,200x）。發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)離心G-25色譜Phenyl色譜S-100色譜DEAE色譜生長激素圖11-2 利用基因工程菌生產(chǎn)生長素的工藝路線（）構(gòu)建高效分泌型工程菌粗提（1）工藝過程如下： 工程菌的構(gòu)建利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高效分泌型基因工程菌株，在生長激素的N-端增加分泌信號肽序列，使表達(dá)合成的重組人生長激素結(jié)構(gòu)和天然人生長激

8、素完全一致。 菌種繁殖采用M9培養(yǎng)基，添加CAA(酪蛋白氨基酸)，調(diào)節(jié)pH 至70，置于搖床上，30，進(jìn)行菌種培養(yǎng)繁殖。發(fā)酵 培養(yǎng)基同菌種繁殖培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)過夜，開始進(jìn)行發(fā)酵，時(shí)間一般為1618h，溫度為37，pH7.07.5，溶解氧不能低于20%。補(bǔ)料發(fā)酵 在發(fā)酵進(jìn)行57 h后，需要適量補(bǔ)充葡萄糖、酵母浸出物、氮源、CAA、無機(jī)鹽和微量無素，如PO43-、Fe2- 、Co2- 等離子，通過添加補(bǔ)料，可使菌體生長的對數(shù)期延，發(fā)酵菌體產(chǎn)量增加了一倍。其余的發(fā)酵條件與上述條件相同，菌體生長至穩(wěn)定期放罐。離心將發(fā)酵菌體進(jìn)行凍融破碎，按一定比例，加入預(yù)冷的由10 mmol/L Tris和1mmol/

9、L EDTA組成的緩沖溶液（pH 7.5），80rpm攪拌1h，離心，收集上清液。粗提 在上清液中加入硫酸銨至飽和濃度45%，4放置2h，10000rpm離心30min，收集沉淀。脫鹽沉淀用10 mmol/L Tris和1mmol/LEDTA組成的pH值為8.0的緩沖溶液溶解，用Sephadex -G25脫鹽。純化采用Phenyl-Sepharose，DEAE-Sepharose進(jìn)行色譜，再加入固體硫酸銨達(dá)到飽和濃度45%，沉淀2h，離心，收集沉淀，溶解沉淀，再通過sephacryl S-11HR及DEAE-Sepharose進(jìn)行純化，得到人生長激素原料藥半成品.。（2）質(zhì)量檢驗(yàn)：質(zhì)量必須符合

10、<中華人民共和國藥典>2005年版二部附錄規(guī)定。目前，人和動(dòng)物生長素基因都已在大腸桿菌中表達(dá)成功，重組人生長激素將會(huì)得到大規(guī)模的生產(chǎn)，從而造福人類。 (二) 胰島素 ( insulin ) 胰島素是胰臟中胰島細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，它是促進(jìn)合成代謝的激素，在調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝、脂肪代謝、核蛋白質(zhì)代謝方面都有重要作用，是維持血糖在正常水平的主要激素之一。廣泛存在于人和動(dòng)物的胰臟中，正常人的胰臟約含有200萬個(gè)胰島，占胰臟總質(zhì)量的1.5。胰島由、和三種細(xì)胞組成，其中細(xì)胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，細(xì)胞制造胰島素，細(xì)胞制造生長激素抑制因子。胰島素在細(xì)胞中開始時(shí)是以活性很弱的前體胰島素原存在

11、，進(jìn)而分解為胰島素進(jìn)入血液循環(huán)，能使血糖降低，起到調(diào)節(jié)血糖作用。臨床上主要用于治療胰島素依賴性糖尿病及糖尿病昏迷和酮癥酸中毒、精神分裂癥、休克等。胰島素由A、B兩條鏈組成，A鏈含21個(gè)氨基酸殘基，B鏈含30個(gè)氨基酸殘基，兩鏈之間由兩個(gè)二硫鍵相連，在A鏈內(nèi)部含有一個(gè)二硫鍵。不同種屬動(dòng)物的胰島素分子結(jié)構(gòu)大致相同，主要差別在A鏈二硫橋中間的第8位、9位和10位上的三個(gè)氨基酸及B鏈C末端的一個(gè)氨基酸上，隨種屬而異，但其生理功能是相同的。生產(chǎn)胰島素的方法較多，有傳統(tǒng)的方法和基因工程技術(shù)方法。1動(dòng)物胰臟制胰島素由動(dòng)物胰臟生產(chǎn)胰島素的方法較多，目前被普遍采用的是酸醇法和鋅沉淀法?，F(xiàn)以酸醇法為例，介紹胰島素的

12、生產(chǎn)工藝。其工藝路線如圖11-3所示這個(gè)圖的一些文字不知是對那個(gè)步子說的，我建議將圖中的說明在下面的。堿化液酸化液酸醇提取液胰片凍胰酸化 硫酸pH3.63.8刨碎37，2h提取 乙醇，草酸pH2.53,12±2堿化氨水pH8.08.4鹽析物溶液濃縮液減壓濃縮30以下去脂速熱速冷鹽析氯化鈉pH2.02.5精制品除酸性蛋白水，丙酮，氨水pH4.24.3鋅沉淀氨水，醋酸鋅pH6.0結(jié)晶沉淀濾液除堿性蛋白，結(jié)晶檸檬酸，醋酸鋅，丙酮，氨水pH8.0,5以下過濾后調(diào)pH6.0洗滌，干燥水，丙酮，乙醚圖11-3 酸醇法生產(chǎn)胰島素的工藝路線 （1）工藝過程如下： 提取 凍胰塊用刨胰機(jī)刨碎，加入2.3

13、2.6倍的8688乙醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù))和5草酸，在12±2攪拌提取3h，離心。濾渣再用1倍量6870乙醇和0.4草酸提取2h，離心，合并乙醇提取液。沉淀用于回收胰島素。 堿化、酸化 邊攪拌提取液邊加入濃氨水調(diào)pH 8.08.4 (12±2)，立即過濾，除去堿性蛋白，濾液應(yīng)澄清，并及時(shí)用硫酸酸化至pH 3.63.8，降溫至5，靜置4h以上，使酸性蛋白充分沉淀。 減壓濃縮 吸取上清液至減壓濃縮鍋內(nèi)，下層用帆布過濾，沉淀物棄去，取上清液，30以下減壓蒸去乙醇，濃縮至濃縮液相對密度為1.041.06 (約為原體積的11019為止)。 去脂、鹽析 濃縮液轉(zhuǎn)入去脂鍋內(nèi)，5min內(nèi)加熱至50

14、后，立即用冰鹽水降溫至5，靜置34h，分離下層清液 (脂層用于回收胰島素)。用鹽酸調(diào)pH 2.32.5，于22±2攪拌加入27(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))固體氯化鈉，保溫靜置數(shù)小時(shí)。析出物即為胰島素粗品。 精制 鹽析物按干重計(jì)算，加入7倍量蒸餾水溶解，再加入3倍量的冷丙酮，用4molL氨水調(diào)pH 4.24.3，然后補(bǔ)加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例為73。充分?jǐn)嚢韬?，低?以下放置過夜，次日在低溫下離心分離，取上清夜，在上清夜中加入4molL氨水使pH 6.26.4，加入3.6(體積分?jǐn)?shù))的醋酸鋅溶液(濃度為20)，再用4molL氨水調(diào)節(jié)pH 6.0，低溫放置過夜，次日過濾，分離沉淀。 結(jié)晶 將沉

15、淀用冷丙酮洗滌，得干品，再按干品質(zhì)量每克加冷2檸檬酸50mL、6.5醋酸鋅溶液2mL、丙酮16mL，并用冰水稀釋至100mL，使其充分溶解，5以下，用4molL氨水調(diào)pH 8.0，迅速過濾。濾液立即用10檸檬酸溶液調(diào)pH 6.0，補(bǔ)加丙酮，使整個(gè)溶液體系保持丙酮含量為16。慢速攪拌35h使結(jié)晶析出。在顯微鏡下觀察，外形為正方形或扁斜形六面體結(jié)晶，再轉(zhuǎn)入5左右低溫室放置34d，使結(jié)晶完全。離心收集結(jié)晶，并小心刷去上層灰黃色無定形沉淀，用蒸餾水或醋酸銨緩沖液洗滌，再用丙酮、乙醚脫水，離心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得結(jié)晶胰島素。（2）質(zhì)量檢驗(yàn) 測定胰島素效價(jià)，各國藥典規(guī)定有家兔血糖降低法和

16、小鼠血糖降低法。（3）在整個(gè)生產(chǎn)過程中，為提高胰島素的質(zhì)量和產(chǎn)量，應(yīng)注意以下幾個(gè)方面： 胰臟質(zhì)量是胰島素生產(chǎn)中的關(guān)鍵，在我國是一個(gè)薄弱環(huán)節(jié)。工業(yè)生產(chǎn)用的原料主要是豬、牛的胰臟。不同種類和年齡的動(dòng)物，其胰臟中胰島素量有所差別，牛胰含量一般高于豬胰。采摘胰臟要注意保持腺體組織的完整，避免摘斷，并且離體后要立即深凍，先在-30以下急凍后轉(zhuǎn)入-20保存?zhèn)溆?，如用液氮速凍，效果更好。在胰臟中，胰尾部分胰島素含量較高，如單獨(dú)使用可提高收率10。 濃縮 濃縮工序的條件，對胰島素收率影響很大。如采用離心薄膜蒸發(fā)器，在第一次濃縮后，濃縮液用有機(jī)溶劑去脂，再進(jìn)行第二次濃縮，被濃縮溶液受熱時(shí)間極短，避免了胰島素效價(jià)

17、的損失。 產(chǎn)品純度 在常規(guī)的結(jié)晶胰島素中，除了胰島素主成分外，還含有其他一些雜蛋白抗原成份，如胰島素原、精氨酸胰島素、胰多肽等。因此要對結(jié)晶胰島素進(jìn)一步純化，胰島素原的含量顯著降低。 2人胰島素的制備（1）酶促半合成法 豬與人的胰島素差別僅是B30位上的一個(gè)氨基酸，豬的是丙氨酸，人的則是蘇氨酸。利用胰蛋白酶的轉(zhuǎn)酰胺作用，將豬胰島素轉(zhuǎn)化為人胰島素B30蘇氨酸(丁?；?丁酸，通過硅膠柱層析，然后用三氟乙酸處理，斷裂保護(hù)基團(tuán)，再用離子交換層析純化，得到高純度人胰島素。（2）利用基因工程技術(shù)制備目前，國際上生產(chǎn)醫(yī)用重組人胰島素( recombinant human insulin, rhI)的方法主要

18、有3種:1)用基因工程大腸桿菌( Escherichia coli, E.coli)分別發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素( human insulin, hI)的A、B鏈。然后經(jīng)化學(xué)再氧化法,使兩條鏈在一定條件下重新形成二硫鍵,得到hI。這一方法缺點(diǎn)較多,目前已較少使用。2)用基因工程E. coli發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素原( human proinsulin, hP I) ,后經(jīng)加工形成h I。這種方法，E. coli系統(tǒng)表達(dá)量高,但缺點(diǎn)是不利于表達(dá)hI這樣的小蛋白,產(chǎn)物易降解,故常采用融和蛋白形式將hPI連接在一個(gè)較大的蛋白質(zhì)后,表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)過一系列復(fù)雜的后加工才能形成有活性的hI。3)通過基因工程酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)

19、hP I,經(jīng)后加工形成hI。酵母系統(tǒng)下游后加工比細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)簡單,但缺點(diǎn)是生產(chǎn)慢,生產(chǎn)周期長,且重組蛋白分泌量少(150 mg/L) ,產(chǎn)量低。工藝生產(chǎn)過程見圖11-4。 菌種RRhP I/pQE-40 E.coli M15菌株 培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成為：5g/L 胰蛋白胨,2g/L谷氨酸,7g/L酵母浸膏,0.5 g/L硫酸銨, 2.5 g/L葡萄糖, 2.7 g/L甘油,100mg/L 氨芐青霉素, 50mg/L卡那霉素, pH 7.2。 一次發(fā)酵將10 ml經(jīng)過活化的RRhP I/ pQE-40 E.coliM15轉(zhuǎn)移至100 ml培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng), 活化菌種。 發(fā)酵罐培養(yǎng)將一次發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至含

20、有1.5 L 培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速為300 r/min,通氣量為11. 511.8) ,一段時(shí)間后加入一定量新鮮的培養(yǎng)基并用NaOH 調(diào)節(jié)pH。在對數(shù)生長中期加入0.5mmol /L IPTG并升溫誘導(dǎo)RRhPI表達(dá)4 h,轉(zhuǎn)速隨即調(diào)為400500 r /min,增大通氣量至11.812.0,繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后,收集菌體。 包涵體的收集和洗滌將收集的濕菌體凍存于-20,然后懸浮于緩沖液A(50 mmol/L Tris-HCl, 0. 5 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl, 5%甘油, 0.10.5 mmol/LDTT,pH7.9) ( 56 ml/g濕菌)中

21、,加入溶菌酶( 5 mg/g濕菌體) ,室溫或37振蕩2 h。冰浴超聲10 s×30次,其間每次間隔20 s,功率為200W。10條件下1000 g離心5 min去除細(xì)胞碎片。上清液中的包涵體( Inclusion body, IB)在4 條件下27000 g離心15 min收集,然后用含2 mol/L 尿素的緩沖液A充分懸浮,室溫靜置30 min后4 條件下17000 g離心15 min,收集沉淀。沉淀再用含2%脫氧膽酸鈉的緩沖液A充分懸浮, 4 條件下17000 g離心15min,收集沉淀。最后沉淀用10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.3洗滌兩次(4,17000 g離

22、心15 min ) 。 RRhPI的初步純化將收集的IB用含有0.1%0.3%-巰基乙醇的緩沖液B( 30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L尿素, pH 8.0)溶解,上于已用緩沖液B平衡的DEAE-Sepharose FF柱,用合適的氯化鈉梯度洗脫,收集含RRhPI的洗脫液。 RRhPI的重組復(fù)性將初步純化后的RRhPI通過Sephadex G-25脫尿素,轉(zhuǎn)換緩沖液為不同pH的50 mmol/L Gly-NaOH重組液,或含有適量GSSG的Gly-NaOH緩沖液中,使蛋白終濃度為0.10.6 mg/ml,收集趨于正確折疊的RRhPI單體組分,加入適量GSH 和GSSG,4放

23、置24 h。 酶切轉(zhuǎn)化向RRhPI復(fù)性液中加入一定量的胰蛋白酶和羧肽酶, 37酶切一段時(shí)間,然后用0.1 mol/L ZnCl2 終止反應(yīng)并沉淀生成的hI。 hI的純化將0.6g IB分別用含0.1%, 0.2%, 0.3%-巰基乙醇的30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L尿素, pH8.0 溶解,進(jìn)行DEAE-Sepharose FF 離子交換層析,然后將收集得到的RRhPI組分通過Sephadex G-25脫尿素以使RRhPI復(fù)性。離心酶切解離A、B鏈離子交換發(fā)酵細(xì)胞破碎離心構(gòu)建工程菌胰島素粗品胰島素原純化的人胰島素離子交換、分子篩色譜、反相色譜、結(jié)晶圖11-4 利用基因工

24、程菌生產(chǎn)人胰島素的工藝路線（仿自李曉紅，2007）取上清夜胰島素復(fù)性收集菌體收集沉淀二、蛋白質(zhì)類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子蛋白質(zhì)類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子包括干擾素（IF）、，、白細(xì)胞介素1-18 (IL)，神經(jīng)生長因子（NGF）、肝細(xì)胞生長因子(HGF)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，腫瘤壞死因子(TNF)，集落刺激因子(CSF)，組織纖溶酶原激活因子(t-PA)，促紅細(xì)胞生成素(EPO)，骨發(fā)生蛋白(BMP)等。(一) 干擾素（Interferon ,IFN） 干擾素指由干擾素誘生劑誘導(dǎo)有關(guān)生物細(xì)胞所產(chǎn)生的一類高活性、多功能的誘生蛋白質(zhì)。這類誘生蛋白質(zhì)從細(xì)胞中產(chǎn)生和釋放之后，作用于相應(yīng)的其它同種生物細(xì)胞

25、，并使其獲得抗病毒和抗腫瘤等多方面的“免疫力”，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性的作用，是人體防御系統(tǒng)的重要組成。人干擾素根據(jù)其來源細(xì)胞不同，分為白細(xì)胞干擾素(IFN-)、類淋巴細(xì)胞干擾素(IFN-與IFN-的混合物)、成纖維細(xì)胞干擾素(IFN-)、T細(xì)胞干擾素 (IFN-)等幾類。按其抗原性的不同，分為型、型和型三種，同一型別，根據(jù)氨基酸序列的差異，又分為許多亞型，如常用的IFN-包括IFN-a、IFN-Ib和IFN-b等亞型。干擾素具有沉降率低，不能透析，可被胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶破壞，不被DNase和RNase水解破壞等特性。 干擾素的生產(chǎn)方法有傳統(tǒng)的體外誘生法和基因工程法

26、。 1傳統(tǒng)的體外誘生法 傳統(tǒng)的方法是通過體外誘生的方法獲得干擾素。干擾素具有高度的種屬特異性，臨床使用的干擾素都用人的細(xì)胞制備，-干擾素用人血白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞制備；-干擾素用人成纖維細(xì)胞制備。目前我國已完善了利用血庫血大量制備人血細(xì)胞干擾素的方法，達(dá)到106Umg蛋白的水平。其工藝路線見圖11-5。粗制-干擾素啟動(dòng)誘生人干擾素37，12h啟動(dòng)白細(xì)胞正式誘生仙臺(tái)病毒37，12h離心分離2500r/min除雜蛋白乙醇 5二次酸除雜蛋白HCl pH5.55.8沉淀分離NaOH pH8.0KSCN，HClPBS，對PBS透析pH7.07.5溶解pH7.07.5PBS，NaOH白細(xì)胞培養(yǎng)物沉淀1上清液1

27、沉淀2上清液2沉淀3PBS，KSCN沉淀4上清液3溶解液IFN-酸沉淀HCl pH3.0沉淀5溶解pH7.07.5PBS，NaOH溶解液除鹽離心透析清液溶解IFN1凍干-干擾素圖11-5 誘生法生產(chǎn)干擾素的工藝路線人白細(xì)胞灰黃層血漿抽取氯化銨（1）工藝過程如下： 分離灰黃層 取新鮮血液400mL/份，加入ACD抗凝劑，離心，分離出血漿，小心抽取灰黃層。每份血可抽取1315mL，放置4冰箱中過夜。 氯化銨處理 每份灰黃層加入30mL緩沖鹽水，再加入9倍體積量的0.83冷氯化銨，混勻，4放置10min，4離心(8000 r/min) 20min。棄上清液，加入適量緩沖鹽水，收集沉淀細(xì)胞，制備懸浮液

28、，重復(fù)上次處理，溶解殘存的紅細(xì)胞。取沉淀的白細(xì)胞懸于培養(yǎng)液中，冰浴保存，取樣作活細(xì)胞計(jì)數(shù)。 啟動(dòng)誘生 于白細(xì)胞懸浮液加入白細(xì)胞干擾素，使其濃度為100gmL，37水浴攪拌培養(yǎng)2h。 正式誘生 啟動(dòng)后的白細(xì)胞加入仙臺(tái)病毒(在10天齡雞胚中培養(yǎng)4872h，收獲尿囊液)使其最后濃度為100150血凝單位mL，在37攪拌培養(yǎng)過夜。仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞產(chǎn)生。 收集 將培養(yǎng)物離心(2500 r/min) 30min，吸取上清液即得粗制干擾素。 純化 在粗制干擾素中加入硫氰化鉀到0.5molL，用鹽酸調(diào)pH為3.5，離心，得沉淀l。沉淀1加入原體積15量的冷乙醇( 94)，離心，得上清液1。上清液1用鹽酸調(diào)

29、節(jié)pH 5.5，離心棄去沉淀，再調(diào)至pH 5.8，離心，得上清液2和沉淀2。沉淀2加入原體積150量的甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 2)溶解，得IFNl。上清液2用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，離心，棄上清液，得沉淀3。沉淀3加原體積150量的0.lmolL PBS和0. 5molL硫氰化鉀(pH 8)溶解，pH值降至5.2，離心，得上清液3和沉淀4。 沉淀4加原體積125000量pH 為8.0的0.1molL PBS溶解，調(diào)至pH為77.5，對PBS ( pH 7.3)透析，過夜，離心，收集上清液，檢測，得IFN-。調(diào)節(jié)上清液3 pH值為3.0，離心，得沉淀5。沉淀5加入原體積15000量的pH

30、8.0，0.1molL PBS，加NaOH調(diào)節(jié)pH 77.5，對PBS ( pH7.3)透析過夜，離心，收集上清液，檢測，得IFN-。（2）質(zhì)量檢驗(yàn) 我國用微量板染色的病變抑制法測定。國際上規(guī)定，能保護(hù)50%細(xì)胞免受病毒攻擊的濃度即為一個(gè)IFN活性單位。 該法特點(diǎn)是一次純化量大，回收率高于60；經(jīng)濟(jì)，簡便，易于普及，效價(jià)可達(dá)1.2×108UmL，比活2.2×106 Umg(蛋白)。IFN-中干擾素含量占回收干擾素的82，比活也比較高。2基因工程法 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用基因工程技術(shù)，已能在人體外大規(guī)模地生產(chǎn)人干擾素即基因工程干擾素。目前，編碼干擾素的基因已能在大腸桿菌、酵

31、母菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到表達(dá)。、三型基因工程干擾素都已研制成功，并投放市場，用于治療的病種達(dá)20多種。我國衛(wèi)生部已批準(zhǔn)生產(chǎn)的干擾素品種有IFN-lb、IFN-a、IFN-b和IFN-r四種。目前，人們在利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制活性更高，更適于臨床應(yīng)用的干擾素類似物和干擾素雜合體等各種新型干擾素。生產(chǎn)技術(shù)路線如圖11-6所示。生產(chǎn)種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)提取半成品制備成品檢測與包裝凍干分裝半成品檢測圖11-6 利用基因工程生產(chǎn)干擾素的工藝路線純化 基因工程菌的構(gòu)建 首先從產(chǎn)生干擾素的白細(xì)胞中提取干擾素mRNA，對其進(jìn)行分級分離。通過蟾蜍卵母細(xì)胞找出活性最高的mRNA，并用此mRNA合成cDNA。將c

32、DNA與含四環(huán)素和氨芐抗性基因的質(zhì)粒pBR322重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12，得到重組子質(zhì)粒。對每個(gè)重組子用粗提的干擾素mRNA進(jìn)行雜交，把得到的雜交陽性克隆中的重組質(zhì)粒DNA放到無細(xì)胞合成系統(tǒng)中進(jìn)行翻譯。對翻譯體系的產(chǎn)物進(jìn)行干擾素活性檢測。再將干擾素的cDNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌在特定條件下進(jìn)行高效表達(dá)。其生產(chǎn)流程如圖11-7所示。雜交翻譯法挑選含干擾素cDNA的克隆篩選抗四環(huán)素但對氨芐西林敏感的細(xì)菌克隆擴(kuò)增雜交質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12DNA的PstI酶切割段加dA或dCpBR322質(zhì)粒退火獲得雜交質(zhì)粒雙鏈cDNA用末端DNA轉(zhuǎn)移酶接上dT或dG尾mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA5%23%

33、蔗糖密度梯度離心提取12S的mRNA通過寡dT-纖維素柱獲得聚A的mRNA提取總RNA誘生的白細(xì)胞干擾素cDNA克隆在大腸桿菌中高效表達(dá)圖11-7 構(gòu)建干擾素工程菌的一般流程 工程菌的發(fā)酵a.種子制備 將構(gòu)建的基因工程菌傳代后于-70下甘油管中保存。如構(gòu)建的人干擾素-b基因工程菌SW-IFN-abE.coli-DHSa。質(zhì)粒用PL啟動(dòng)子，含氨芐西林抗性基因。使用時(shí)進(jìn)行活化。b.種子罐培養(yǎng) 將菌種按1種量接種到種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基的配方：1蛋白胨、0.5酵母提取物、0.5NaCl；30搖床培養(yǎng)10h，作為發(fā)酵罐種子使用。c.發(fā)酵罐培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基的配方：1蛋白胨、0.5酵母提取物、0.01NH

34、4Cl、0.05NaCl、0.6Na2HP04、0.001CaCl2、0.3KH2P04、0.01MgS04、0.4葡萄糖、50mgmL氨芐西林、少量防泡劑。用15 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為10 L，pH 6.8，攪拌500 r/min，通風(fēng)比為1：1(m3·min)，溶氧為50。30發(fā)酵8h，然后在42誘導(dǎo)23h完成發(fā)酵。同時(shí)每隔不同時(shí)間取2mL發(fā)酵液，在10 000 r/min離心除去上清液，稱量菌體濕重。 在整個(gè)發(fā)酵過程中，要注意：（1）不同發(fā)酵階段培養(yǎng)基的成分有差異；（2）培養(yǎng)液中要有足夠的溶解氧，不同的培養(yǎng)階段需要的溶解氧量也不同，通常通過增大攪拌速度，增加空氣

35、流量或者通入純氧來滿足條件；（3）發(fā)酵過程中在不同的階段應(yīng)控制不同的pH，發(fā)酵后期要降低pH，減少干擾素的水解；（4）要控制適當(dāng)?shù)臏囟龋纫ＷC菌體細(xì)胞膜的完整和細(xì)胞中酶的活性，又要有利于提高干擾素的產(chǎn)量。 產(chǎn)物的提取與純化 a.提取 發(fā)酵結(jié)束后，冷卻，離心(4000 r/min)，30min，收集沉淀，得濕菌體。取濕菌體懸浮于20mmolL 的磷酸緩沖液(pH 7.0)中，冰浴中進(jìn)行超聲破碎，釋放干擾素蛋白。4000 r/min離心30min，得沉淀，用含8molL尿素、20mmol磷酸緩沖液(pH 7.0)、0.5mmolL二巰基蘇糖醇溶液，室溫?cái)嚢璩樘?h，然后15000 r/min離心

36、30min。取上清液，用20mmolL磷酸緩沖液(pH 7.0)稀釋至尿素濃度為0.5molL，加二巰基蘇糖醇至0.1mmolL，4攪拌15h，15000 r/min離心30min，除去不溶物。上清液經(jīng)截流量為104相對分子質(zhì)量的中空纖維超濾器濃縮，將濃縮的人干擾素b溶液經(jīng)過SephadexG-50分離，層析柱(2cm×l00cm)先用20mmolL磷酸緩沖液(pH 7.0)平衡，上柱后用同一緩沖液洗脫分離，收集人干擾素b部分，經(jīng)SDS-PAGE檢查。b純化 將Sephadex G-50柱分離的人干擾素b組分，再經(jīng)DE-52柱(2cm×50cm)純化，人干擾素b組分上柱后用

37、含0.05molL、0.1molL、0.15molL NaCl的20mmolL磷酸緩沖液(pH 70)分別洗滌，收集含人干擾素b的洗脫液。全過程蛋白質(zhì)回收率為2025，產(chǎn)品不含雜蛋白、DNA及熱原質(zhì)。干擾素b含量符合要求。 3干擾素質(zhì)量檢驗(yàn) 基因工程干擾素半成品和成品均應(yīng)作檢測，包括干擾素效價(jià)、蛋白質(zhì)含量及比活性、純度測定 、相對分子質(zhì)量、殘余外源性DNA含量、殘余血清IgG含量、殘余抗生素活性 、干擾素效價(jià)測定、無菌試驗(yàn)、熱原質(zhì)試驗(yàn)。成品檢測：物理性狀 凍干制品外觀應(yīng)為白色或微黃色疏松體，加入注射水后，不得含有肉眼可見的不溶物；鑒別試驗(yàn) 應(yīng)用EIASA或中和試驗(yàn)鑒定,結(jié)果為陽性；水分測定 用

38、卡氏法，水分含量應(yīng)低于3。半成品也要進(jìn)行無菌試驗(yàn)、熱原質(zhì)試驗(yàn)、干擾素效價(jià)；安全試驗(yàn) 取體重350400g豚鼠3只，每只腹側(cè)皮下注射劑量為人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若豚鼠局部無紅腫、壞死、總體重不下降，則說明成品合格。(二) 人紅細(xì)胞生成素( rhEPO) 1結(jié)構(gòu)與性質(zhì)紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種糖蛋白，是調(diào)節(jié)紅系祖細(xì)胞，對紅細(xì)胞生成有特異刺激作用的細(xì)胞因子，在胎兒體內(nèi)由腎臟及肝臟產(chǎn)生，在成人體內(nèi)主要由腎臟分泌，在病理狀態(tài)下，與多種貧血尤其與終末期腎臟疾病貧血密切相關(guān)。紅細(xì)胞生成素有兩種，天然人紅細(xì)胞生成素和重組人紅細(xì)胞生成素。天然人紅細(xì)胞生成素是以人的尿、血等為原料，經(jīng)生物化

39、學(xué)方法純化得到。重組人紅細(xì)胞生成素是以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的紅細(xì)胞生成素，將人紅細(xì)胞生成素的基因連接到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)上清夜中純化紅細(xì)胞生成素。兩種人紅細(xì)胞生成素具有相同的體內(nèi)體外活性，根據(jù)其糖基的不同，可以分為rhEPO-和rhEPO-兩種。 2生產(chǎn)工藝 獲得人紅細(xì)胞生成素基因構(gòu)建人紅細(xì)胞生成素基因表達(dá)載體人紅細(xì)胞生成素表達(dá)細(xì)胞株的建立人紅細(xì)胞生成素的活性檢測人紅細(xì)胞生成素的分離純化重組細(xì)胞株的培養(yǎng)圖11-8 利用基因工程菌生產(chǎn)人紅細(xì)胞生成素的工藝路線人紅細(xì)胞生成素制劑工藝路線如圖11-8所示。 克隆并篩選人紅細(xì)胞生成素基因 獲得人紅細(xì)胞生成素基因的方式有兩種，一種提取人

40、胚胎mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA文庫，篩選文庫，得到人紅細(xì)胞生成素基因，也可以通過篩選人胚胎基因組文庫獲得。另一種是提取胚胎染色體DNA，通過PCR擴(kuò)增獲得基因片段，再體外拼接。 構(gòu)建紅細(xì)胞生成素基因表達(dá)載體 與編碼紅細(xì)胞生成素基因片段相連的表達(dá)載體有pDSVL、pSV2 和pD11。以構(gòu)建攜帶編碼人紅細(xì)胞生成素基因的核苷酸序列（prEP）的質(zhì)粒為例進(jìn)行說明。從人胚胎中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 進(jìn)行文庫篩選，得到人紅細(xì)胞生成素基因，將該基因與載體在連接體系中過夜, 加入T4 DNA連接酶。挑取單菌落接種于5mL培養(yǎng)基，37過夜。 建立紅細(xì)胞生成素表達(dá)的細(xì)胞株 將重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)

41、胞，經(jīng)篩選得到所需要的細(xì)胞系，凍存?zhèn)溆谩?重組細(xì)胞株的培養(yǎng) 將凍存的細(xì)胞株取出，37水浴解凍，離心，棄去凍存液。采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，將解凍的細(xì)胞株接種于適量的DMEM培養(yǎng)基，37、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)傳代三次。采用消化酶將細(xì)胞消化，使細(xì)胞濃度為2.5×106個(gè)/mL，接種。采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)重組細(xì)胞株，采用DMEM培養(yǎng)基，加含小牛血清，控制條件pH 7.0、攪拌速度小于50 r/min, 37、DO為5080，使細(xì)胞貼壁；細(xì)胞貼壁后提高轉(zhuǎn)速80100 r/min，培養(yǎng)10d；更換無血清培養(yǎng)基在進(jìn)行灌流培養(yǎng)，在此過程中，連續(xù)收獲培養(yǎng)液，在48保存。 紅細(xì)胞生成素的分離純化 采用三步法

42、純化紅細(xì)胞生成素，將培養(yǎng)液通過濾膜過濾，上CM-Sephrose親和色譜柱，CM柱預(yù)先用Na-HAc-異丙醇活化，20mmol/L Tris-HCL平衡緩沖液平衡，然后用02mol/L Tris洗脫液洗脫，收集洗脫峰，10mmol/L Tris透析液中透析過夜。透析過程中，透析液的體積為蛋白液體積的15倍，換液4次，0.22um濾膜過濾?；钚越M分上平衡過的DEAE離子交換柱，01mol/L NaCL-HCL洗脫液洗脫，收集活性洗脫峰，再上10乙腈平衡的RP-HPLC柱，1070的乙腈洗脫液洗脫，收集活性洗脫峰，再用20mmol/L檸檬酸鹽緩沖液平衡凝膠柱，并進(jìn)行洗脫，收集活性洗脫峰，即為紅細(xì)胞

43、生成素。 紅細(xì)胞生成素的活性檢測 紅細(xì)胞生成素的活性可以通過放射免疫分析和體內(nèi)生物活性分析，體內(nèi)生物活性的測定可以采用網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在生產(chǎn)過程中，重組細(xì)胞株的培養(yǎng)必須要注意是無菌條件、溫度37、氣體交換可靠、pH穩(wěn)定7.07.2、葡萄糖是必不可少的碳源，另外采用生物反應(yīng)器時(shí)要能及時(shí)添加培養(yǎng)液保證連續(xù)培養(yǎng)、載體要有足夠的表面積，使得細(xì)胞株得以高密度、高表達(dá)連續(xù)培養(yǎng)。（三）白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)白細(xì)胞介素(interleukin，IL) 由白細(xì)胞或其他體細(xì)胞產(chǎn)生的又在白細(xì)胞間起調(diào)節(jié)作用和介導(dǎo)作用的一類細(xì)胞因子，是淋巴因子家族的一員。目前已有IL-118。許多白細(xì)

44、胞介素不僅介導(dǎo)白細(xì)胞的相互作用，還參與其他細(xì)胞如造血干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等的相互作用。IL-2主要由T細(xì)胞或T細(xì)胞系產(chǎn)生，脾臟、淋巴結(jié)和扁桃腺中的T細(xì)胞受到刺激后都能產(chǎn)生IL-2，人和動(dòng)物某些T細(xì)胞白血病細(xì)胞系或腫瘤細(xì)胞在有絲分裂原、鈣離子載體(如 A23187) 或PMA刺激下可產(chǎn)生高水平的IL-2。白細(xì)胞介素的生產(chǎn)方法有傳統(tǒng)的體外誘生法和基因工程法。1. 白細(xì)胞介素-2的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法 IL-2是由輔助T細(xì)胞經(jīng)抗原或有絲分裂原等刺激，在巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞分泌的IL-1參與下，產(chǎn)生并分泌的含133個(gè)氨基酸的糖蛋白，分子量為15420。在pH為29范圍內(nèi)

45、穩(wěn)定，56 1h內(nèi)仍具有活性。臨床上主要用于治療一些免疫功能不全及癌癥的綜合治療。白細(xì)胞介素-2的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是通過誘生的方法獲得。工藝路線如圖11-9所示。誘生雞瘟病毒和PHA人血白細(xì)胞誘生白細(xì)胞培養(yǎng)液收集沉淀透析內(nèi)液親和載體1親和載體2凝膠載體除雜蛋白調(diào)節(jié)酸度離心硫酸銨離心上清液沉淀硫酸銨透析10mmol/L PBS親和層析sepharose4B柱洗滌0.4mol/L NaCl的PBS解吸1.0mol/L NaCl的PBS凝膠層析上Utrogel柱白細(xì)胞介素-2成品濃縮洗脫0.2mol/L Tris-HCl含PEG、正丁醇0.2mol/L甘氨酸圖11-9 誘生法生產(chǎn)白細(xì)胞介素-2的工藝路線

46、上清液IL-2活性組分 誘生 用加入雞瘟病毒和PHA的培養(yǎng)液培養(yǎng)人外周血白細(xì)胞，這兩種物質(zhì)起到聯(lián)合刺激的作用，37培養(yǎng)。 除變性蛋白 用6molL HCl調(diào)節(jié)pH2.02.5，再用6molL NaOH調(diào)回到pH7.27.4，離心除去變性雜蛋白。 硫酸銨分級沉淀 取上述離心后的培養(yǎng)上清液，加飽和硫酸銨至35飽和度，4靜置24h，離心棄去沉淀。上清液補(bǔ)加固體硫酸銨至85飽和度，4靜置24h，離心，收集沉淀。 透析 將沉淀溶于pH 6.5、10mmolL PBS中(內(nèi)含2正丁醇和0.15mol/L NaCL)。對pH 6.5、10mmolL PBS透析24h(更換5次透析外液)。 藍(lán)色瓊脂糖層析 將

47、上述透析內(nèi)液通過Sepharose4B層析柱，用PBS洗去不吸附的蛋白，再用含0.4molL NaCl的PBS洗滌親和柱，最后用含1.0molL NaCL的PBS解吸IL-2活性組分。 凝膠層析 將解吸的IL-2活性組分經(jīng)分子量為6000的PEG濃縮，再上ACA44U1-trogel層析柱。柱用含0.1PEG、2正丁醇和pH7.6的0.5molL甘氨酸的0.2mol/L Tris-HCL洗脫，得IL-2。2基因工程IL-2的制備目前國內(nèi)用酵母、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和用大腸桿菌基因重組的IL-2都已批準(zhǔn)生產(chǎn)，并用于臨床。重組IL-2的獲得過程中，已成功地利用大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞來表達(dá)重組人IL-

48、2，但在大量生產(chǎn)重組IL-2中主要是使用大腸桿菌。 基因工程菌的構(gòu)建從ConA激活的人白血病T細(xì)胞株提取高活性IL-2的mRNA作為模板，逆轉(zhuǎn)錄單鏈cDNA，經(jīng)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化，在cDNA末端連接若干dCMP殘基，再以寡聚(dG)1218為引物，利用DNA聚合酶I成雙鏈cDNA，經(jīng)蔗糖密度梯度離心法分離出此cDNA片段。通過GC加尾法將此cDNA片段插入到pBR322質(zhì)粒的PstI位點(diǎn)，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12株X1776，得到IL-2的cDNA文庫。利用mRNA雜交試驗(yàn)篩選IL-2 cDNA文庫得到含IL-2 cDNA質(zhì)粒的菌株。已有一些攜帶人突變型白細(xì)胞介素2 ( IL-2)

49、的質(zhì)粒，如pPIC9K等。 基因工程菌的發(fā)酵將IL-2 工程菌接種于含氨芐青霉素的2 mL YPD 培養(yǎng)基中, 過夜培養(yǎng), 以1 %接種入含100 mL BMGY的500 mL 三角瓶。30 300 r/ min 培養(yǎng)至OD600 = 36 (大約1618 h)。棄上清液并將菌體細(xì)胞沉淀懸浮在1/ 5 到1/ 10 原初始培養(yǎng)液體積的BMMY培養(yǎng)基中,0.5 %到5 %甲醇誘導(dǎo)。在此過程中優(yōu)化表達(dá)條件, 如通氣狀況、誘導(dǎo)時(shí)間（表達(dá)量隨時(shí)間延長逐漸增加,培養(yǎng)48 h 達(dá)到高峰值）、初始pH 值、甲醇終濃度（目的蛋白量在甲醇濃度為1%時(shí)達(dá)到最高）等。外源蛋白在甲醇酵母中的表達(dá)分2步, 即菌體生長和

50、蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。先在以甘油為碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌體, 達(dá)到一定OD 值后, 離心, 棄去上清液, 菌體懸浮于以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá), 每隔24 h 加1次甲醇, 以彌補(bǔ)甲醇的損失。 IL-2的分離 IL-2基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)后，發(fā)酵液離心，收集菌體。菌體懸浮于PBS溶液中，超聲破碎，離心沉淀，用PBS洗3次，盡量去除雜蛋白及核酸，離心粗制包涵體，包涵體主要含由IL-2單體分子聚合而成的多聚體，不溶于水，且其中的重組IL-2無生物活性。 蛋白溶解包涵體經(jīng)常出現(xiàn)不溶解現(xiàn)象，使用高性能分散機(jī)，瞬間打開分子間的化學(xué)鍵，有利于變性劑繼續(xù)打開蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的化學(xué)鍵，使蛋白完全溶解。

51、可用6molL鹽酸胍或8molL脲或尿素使包涵體變性解聚成單分子(變性后仍無生物學(xué)活性)。 IL-2的復(fù)性 采用50mol/L CuSO4的含有PBS的溶液與IL-2粗品以1：50體積混合后, 置室溫過夜。也可利用空氣氧化，或還原型谷胱甘肽復(fù)性，恢復(fù)IL-2二硫鍵和正常分子結(jié)構(gòu)，獲得生物學(xué)活性。 提高IL-2的復(fù)性率在復(fù)性過程中,只有60%70%的IL-2 能正確配對,另有30%40%的IL-2 則會(huì)形成錯(cuò)配體和二聚體,收集生產(chǎn)過程中經(jīng)高效液相色譜洗脫下來的錯(cuò)配體和二聚體（色譜峰的左部分）進(jìn)行重新氧化復(fù)性,可以使IL-2的回收率提高20%以上。IL-2的純化 用7molL尿素溶解IL-2包涵體

52、，得到上清液，上清液經(jīng)過SephadexG-100凝膠過濾和分子量為650的蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)DEAE離子交換層析，得均一的IL-2，純度高達(dá)98，比活性達(dá)4.3×106Umg蛋白，回收率為30.8。進(jìn)一步純化重組IL-2是利用IL-2的疏水性，經(jīng)超濾濃縮后利用反相高效液相層析(RP-HPLC)和較高濃度的乙腈(60)的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，從而得到高純度的IL-2；也可以通過受體親和層析一步純化，可得到純度為95以上的IL-2。 3質(zhì)量檢驗(yàn)IL-2生物活性用3H-TdR摻入法測定。三、血漿蛋白類血漿蛋白質(zhì)類包括白蛋白(Alb)、纖維蛋白溶酶原、血漿纖維結(jié)合蛋白(FN)、免疫丙種球蛋白，抗

53、淋巴細(xì)胞免疫球蛋白，Veil，s病免疫球蛋白，抗-D免疫球蛋白，抗-HBs免疫球蛋白，抗血友病球蛋白，纖維蛋白原(Fg)，抗凝血酶，凝血因子，凝血因子等。不同物種間的血漿蛋白質(zhì)存在著種屬差異，雖然動(dòng)物血與人血的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)非常相似，但不能用于人體。（一）白蛋白 （1）結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 白蛋白又稱清蛋白，是人血漿中含量最高的蛋白質(zhì)，約占總蛋白的55，對人沒有抗原性。白蛋白為單鏈，由584個(gè)氨基酸殘基組成，N-末端是天冬氨酸，C-末端為亮氨酸，相對分子質(zhì)量為65000，pI值為4.7，沉降系數(shù)S20,w 4.6，電泳遷移率5.92?？扇苡谒桶腼柡偷牧蛩徜@溶液中，一般在飽和度為60以上的硫酸銨析出沉淀。對

54、酸較穩(wěn)定，受熱后聚合變性，但仍較其它血漿蛋白質(zhì)耐熱。在白蛋白溶液中加入氯化鈉或脂肪酸的鹽，能提高蛋白的熱穩(wěn)定性，利用這種性質(zhì)，可使白蛋白與其它蛋白質(zhì)分離。 從人血漿中分離的白蛋白有兩種制品：一種是從健康人血漿中分離制得的，稱人血清白蛋白；另一種是從健康產(chǎn)婦胎盤血中分離制得的，稱胎盤血白蛋白。同種白蛋白制品無抗原性，主要功能是維持血漿膠體滲透壓。在臨床上用于失血性休克、嚴(yán)重?zé)齻?、低蛋白血癥等的治療。 （2）生產(chǎn)工藝工藝路線如圖11-10所示。絡(luò)合分離熱處理濃縮超濾濃縮液除菌人血漿熱處理液解離液白蛋白解離離心成品檢驗(yàn)分裝圖11-10 白蛋白生產(chǎn)的工藝路線絡(luò)合物工藝流程： 絡(luò)合 將人血漿放入不銹鋼夾

55、層反應(yīng)罐內(nèi)，開啟攪拌器，碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH 8.6，加入等體積的2利凡諾溶液，充分?jǐn)嚢?，靜置24h，分離上清液與絡(luò)合沉淀。 解離 沉淀加無菌蒸餾水稀釋，0.5molL HCL調(diào)節(jié)pH值至弱酸性，加入0.150.2氯化鈉，不斷攪拌進(jìn)行解離。充分解離后，65恒溫1h，立即用自來水夾層循環(huán)冷卻。將解離液進(jìn)行離心，分離液用不銹鋼壓濾器澄清過濾。 超濾 澄清濾液用超濾器濃縮。 熱處理 濃縮液在60恒溫處理10h，滅活病毒。 除菌 以不銹鋼壓濾器過濾，通過Sartoltis冷滅菌系統(tǒng)除菌。 分裝 白蛋白含量及全項(xiàng)檢查合格后，用自動(dòng)定量灌注器進(jìn)行分瓶灌裝或冷凍干燥得白蛋白成品。本品分為10與25兩種蛋白濃度規(guī)格。（3）質(zhì)量檢驗(yàn) 性狀呈淡黃色略帶黏稠狀的澄明液