生物：1.2《基因工程的基本操作程序》課件1(新人教版選修3)

1、1.2基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取有了目的基因，我們才 能賦予一種生物以另一 種生物的遺傳特性。2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建使目的基因在受體細(xì)胞 中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行 遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生 物的基因在另一種生物 中的轉(zhuǎn)化。4、目的基因的檢測(cè)與鑒定才能確定目的基因是否 真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定 遺傳和正確表達(dá)。一、目的基因的獲取請(qǐng)閱讀P9第一和二兩段(_)、目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子(二)、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫(kù)中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成、

2、目的基因的獲取（一）從基因文庫(kù)中直接獲取概念見(jiàn)P92.基因文庫(kù)的分類(lèi):按外源DNA片段的來(lái)源分類(lèi)基因組DNA文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù):只包含了一種生物的部分基因,如：cDNA文庫(kù)3.基因文庫(kù)的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的 目的基因。4.獲取目的基因的根據(jù):見(jiàn)課本P95.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一(1)直接分離法(鳥(niǎo)槍法)提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)艸限制酶切定大小的DNA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)SSfiDNA二二二二 DNA片較接?I斛上SSfiDNASSfiDNASSfiDNASSfiDNAmsSSfiDNA寄主細(xì)Jj DNA5

3、.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之反轉(zhuǎn)錄法：cDNA的合成流程圖解基因組文庫(kù)和部分基因組文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）比較cDNA tMi水*t有胡申卅子他科林白 酣耐肘軸DNA片肘%*2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增 目的基概念：PCR全稱(chēng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)原理：DNA復(fù)制條件:模板DNA（需含有目的基因） 四種脫氧核昔酸（dNTP） 熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）Mg2+（激活劑）緩沖溶液 對(duì)引物：一對(duì)寡核昔酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ)前提:一段已知目的基因的核昔酸序列，以便 根據(jù)這一序列合成引物過(guò)程樟板DNAIII預(yù)變性（增加DNA變性的概率）Il®cG高溫變

4、性（解旋為單鏈）低溫退火（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）適溫延伸（在Taq酶的作用下合成11與模板互補(bǔ)的DNA雙鏈）冷卻上鴿一冊(cè)生 引物結(jié)合列互補(bǔ)DN陶f(shuō)初!救厠俗 0M瞅引側(cè)起岳 互祐齡M重復(fù)循環(huán)圖I前PCRK應(yīng)徵理示倉(cāng)團(tuán)2、具體過(guò)程互補(bǔ)的雙股DNA序列°C95一70-35")聚合酵素連鎖反應(yīng)(Polymerase chain reaction) 是一種快速的DNA複製方法PCR （多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）DNA變性DMA變性再與引物復(fù)性合成DNA樣品DNA變性再與引物輕 合成DNA /再與引物復(fù)性合成DNAetc.etc.etc.引物etc.etc.etc.引物etc.、第1輪復(fù)制（2條

5、雙鏈）第2輪復(fù)制（4條雙鏈）第3輪復(fù)制（8條雙鏈）注:PCR可以指數(shù)級(jí)增加DNA的數(shù)量每經(jīng)過(guò)一次擴(kuò)増DNA數(shù)量增加一倍，因?yàn)楸仨?在高溫（8090°C）下使DNA解鏈.然后降低溫度使引物與變性DNA復(fù)性，所以PCR 酶必需耐堂咼溫. 概念：PCR全稱(chēng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng) 在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù) 原理：DNA復(fù)制 條件：要有一段已知目的基因的核昔酸序列（前提條件） 四種把氧核昔酸、一對(duì)引物、DNA聚合酶_事 方式：以蛋數(shù)方式擴(kuò)增，即上（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)） 結(jié)果：使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增 過(guò)程:a、DNA變性(90°C-95°

6、C):雙鏈DNA模板 在熱作用下，皇矍斷裂，形成 單鏈DNAb、退火(復(fù)性55°C-65°C):系統(tǒng)溫度降低，弓I物與DNA模板結(jié)合，開(kāi)纟成局部 雙鏈。c、延伸(70°C-75°C):在Taq酶的作用下, 合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。PCR技術(shù)擴(kuò)增與DN A復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核昔酸模板、能量、酶不同點(diǎn)解旋方式DNA在高溫下變性解旋體外復(fù)制旋化L41111細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DN A聚合酶結(jié)果大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子目的基因的mRNA反轉(zhuǎn)錄單鏈 DNA（cDNA）|合成雙鏈DNA（即目的基因）3

7、、人工合成的目的基1）反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信 使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互 補(bǔ)的單鏈DNA,然后在酶的 作用下合成雙鏈DNA,從而 獲得所需的基因.2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法:目的 基因二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心1、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在， 并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的 基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。所需物質(zhì):它們各自 的作用是 什么？2、基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因AY啟動(dòng)子：位于基因的首端的 一段特殊的DNA片斷，它是 RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部 位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn) 錄出mRNA,最終獲得蛋白質(zhì) 終止子：位于基

8、因的尾端的 一段特殊的DNA片斷，能終 止mRNA的轉(zhuǎn)錄見(jiàn)制匝點(diǎn)西卜10聶達(dá)媒垃圏標(biāo)記基因的作用是為了鑒別 受體細(xì)胞中是否含有目的基 因，從而將有目的基因的細(xì) 胞篩選出萊注意 載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因 和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體 基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部 分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又 用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種 酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵 啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少 目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表 達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(_)轉(zhuǎn)仃.目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi),并且在 受體

9、細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)宦_和蚩達(dá)"的過(guò)程將昨入農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法()方法$將目的基因?qū)?動(dòng)物細(xì)胞J將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞顯微注射法感受態(tài)細(xì)朋1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法: (1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多 數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力原理：Ti質(zhì)粒上的TDNA可以轉(zhuǎn) 移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染 色體的DNA上。過(guò)程:T>DNAxQSNlltfl也 emDNAsimuw 的早入扯軸“赳吿m組i« wj農(nóng)桿附萇氏岀Hi制熾am圖、|1優(yōu)點(diǎn)（2）基因槍法 （3）花粉管通道法花粉骨通進(jìn)法2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 方法：顯微

10、注射法 程序：目的基因表達(dá)載體提純 一取卵（受精卵）顯微注射一-受精卵-新性狀動(dòng)物3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物特點(diǎn)：繁殖快、細(xì)胞、遺傳物質(zhì);方法：曇瓷徑豊細(xì)胞i感受態(tài)細(xì)胞一-表 密載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài) 細(xì)胞吸收DNA分子四.目的基因的檢測(cè)與鑒定檢查是否成功（一）、檢測(cè)1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入 了目的基因（關(guān)鍵步驟）（1）方法：DNA分子雜交（2）過(guò)程：首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNAFA用含目的基因的DNA片段用放射性同位素 等作標(biāo)記，以此做探針1=1=使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交，若顯 示岀雜交帶，表明染色體已插入染色體DN A中*5-»mN-m

11、-wBDJXMUc叮 It Huy?訂=2ivw匕 芒叱 nosVZWD七 kBmpHsvrwxlo? r &EwmmLDaM* 一 IT 冒® t!DNA分子雜交示意圖W艸A物種B采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分 子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ) 的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合 在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序 列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。P】5思考與探究2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了證NA方法：分子雜交過(guò)程：用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交, 若出現(xiàn)雜交帶，表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法：抗原抗體雜

12、交（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平） 抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等)的基的檢測(cè)與鑒定檢查是否成功C檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因 方法DNA分子雜交檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA 方法一 - 分子雜交（注意與上不同之處）'檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 方法抗原抗體雜交鑒定抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等歸納：基因工程的基本操作程序1.獲取目的基因從基因文庫(kù)1=利用PCR 化學(xué)方法人工合成2構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因3將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法4.目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定:|=練習(xí)（2008理綜山東

13、卷）為擴(kuò)大可耕地面積, 增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利 用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出 了耐鹽水稻新品系。III（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所 用的限制性?xún)?nèi)切酶作用于圖中的_處， DNA連接酶作用于直 處。（填或III|=練習(xí)（2008理綜山東卷）為擴(kuò)大可耕地面積，增 加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用備 受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽 水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方 法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和基因槍法（花粉管通道法袪。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要 利用 植物組織培養(yǎng) 技術(shù),該技術(shù)的核心是和脫分化和再分化II

14、I（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既 要用放射性同位素標(biāo)記的 耐鹽基因 作探針進(jìn)行 分子雜交檢測(cè)，又要用一定濃度鹽水澆灌方 法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性O(shè)練習(xí)1）以下說(shuō)法正確的是（C ）A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核昔 酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多 個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái)2) 不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是A、能復(fù)制(D)B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)C、具有標(biāo)記基因D、它是環(huán)狀DNA練習(xí)3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（A）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái)B、限制性?xún)?nèi)切酶用

15、于目的基因的獲得C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D、人工合成目的基因不用限制性?xún)?nèi)切酶練習(xí)4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是（D ）A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供 資料練習(xí)練習(xí)5) 基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì) 施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行 堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是 (C)A、人工合成目的基因B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)知識(shí)點(diǎn)一：1原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū);編碼區(qū)下游非編碼區(qū)十 編碼區(qū)上游； 啟立與RNA聚合酶縛合位點(diǎn)；啟動(dòng)子：位于基因首端一

16、段能與RNA聚合矗結(jié)合并能起 始mRNA合成的序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能 阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA板鏈上脫離下來(lái), 使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合 的一種蛋白質(zhì).（以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落）編碼區(qū)上游非編碼區(qū);編碼區(qū)下游原核（編碼區(qū):能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA,能編碼蛋白質(zhì)細(xì)胞丿的1不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA,不能 編碼蛋白質(zhì)。基因心J有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核結(jié)狗I非編碼區(qū)昔酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。pin-L"知識(shí)點(diǎn)一:2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū) 編碼區(qū)上游編碼區(qū)與RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn)外顯子1非編碼區(qū)“編碼區(qū)下游