亞慢性毒性試驗

1、第1頁毒理學(xué)作業(yè)農(nóng)藥 2,4-滴鈉鹽原藥為白色粉末，水溶性，表1 是其對 sd大鼠的急性經(jīng)口試驗結(jié)果，請根據(jù)表中結(jié)果，給出該農(nóng)藥的90 天亞慢性試驗的試驗方案，以及如何對保證實驗質(zhì)量予以控制。表 1 2，4-滴鈉鹽原藥對sd大鼠急性毒性實驗結(jié)果劑量設(shè)置高劑量為25%ld50 ，中劑量為12.5%, 低劑量為6.3%。雌性 ld50為 584mg/kg，高劑量為146mg/kg, 中劑量為73mg/kg, 低劑量為37mg/kg；雄性為 501mg/kg，高劑量為125mg/kg，63mg/kg, 低劑量為31mg/kg。根據(jù) gb15670 農(nóng)藥登記毒理學(xué)實驗方法的農(nóng)藥急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，2，4

2、- 滴鈉鹽原藥的 ld50500mg/kg，屬于低度農(nóng)藥。因此試驗時選擇sd大鼠的 ld50為 584mg/kg。動物性別劑量（mg/kg) 動物數(shù)（只）死亡數(shù)（只）ld50 及 95%可信限（ mg/kg) 雌215 5 0 584 （430794）464 5 1 1000 5 5 2150 5 5 雄215 5 0 501 （344730）464 5 2 1000 5 5 2150 5 5 第2頁農(nóng)藥 2,4-滴鈉鹽原藥sd大鼠亞慢性毒性試驗?zāi)康?;研究喂飼 農(nóng)藥 2,4-滴鈉鹽原藥 對大鼠的亞慢性毒性。方法：取初斷乳 sd 大鼠 80 只，雌雄各半按照體重隨機(jī)分為4 組。將 2,4- 滴

3、鈉鹽原藥按146、73、 37mg/kg mg/kg 劑量分別拌入飼料內(nèi)經(jīng)口喂飼染毒90d。觀察： 大鼠外觀體征、體質(zhì)量、進(jìn)食情況等。在實驗中期和末期采血檢測檢測血液學(xué)。試驗?zāi)┢跈z測血生化指標(biāo)以及尿常規(guī)檢查。實驗結(jié)束時處死實驗動物，計算臟器指數(shù)， 并對主要臟器進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。1 材料和方法1.1 受試物農(nóng)藥 2,4-滴鈉鹽原藥，白色粉末，水溶性，由某地某農(nóng)藥公司提供。spf級初斷乳大鼠80 只，雌雄各半，體質(zhì)量50100 g ，由 xxx實驗動物研究所繁育場提供，動物合格證號為醫(yī)動字第xx-xxxx號。1.2 飼養(yǎng)與管理第3頁 spf 環(huán)境條件下，同組同性別兩只一籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。環(huán)

4、境溫度 21 25，相對濕度 40%60% 。嚴(yán)格控制晝夜交替。1.3 實驗方法試驗前將雌、 雄大鼠各半按體重隨機(jī)分為3 個劑量組和1 個對照組，每組 20 只，將 2,4-滴鈉鹽原藥按146、73、37mg/kg mg/kg 劑量分別均勻混入飼料中制成顆粒飼料輻照滅菌后分別供高、中、低劑量組動物食用，連續(xù)每日一次喂養(yǎng)90d；對照組給予不加受試物的正常飼料。1.4 觀察指標(biāo)1.4.1一般情況試驗期間觀察動物的一般情況包括外觀體征和行為活動、糞便性狀、食物攝入量及體重變化等。1.4.2血常規(guī)在實驗中期和末期按常規(guī)方法測定血液學(xué)指標(biāo)1.4.3血液生化指標(biāo)試驗?zāi)┢跈z測血液生化指標(biāo)1.4.5尿常規(guī)檢查

5、尿常規(guī)測定顏色、 ph 值、比重 (sg)、 尿糖 (glu)、 尿蛋白，將尿液離心，并對尿中沉淀物進(jìn)行鏡檢。1.4.6臟器病理解剖動物，取心、肝、 脾、肺、腎、 胃腸、腎上腺、胸腺、腦和卵巢、睪丸等臟器，觀察大體變化并稱重（胃腸除外），計算臟器指數(shù) 臟器質(zhì)量 / 體重） 100%。將解剖取得的臟器福爾馬林固定，常規(guī)制片，he 染色，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。1.5 統(tǒng)計學(xué)分析亞慢性毒性試驗結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗后，符合正態(tài)的指標(biāo)采用spss13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，否則經(jīng)變換后分析。 結(jié)果2.1 一般狀況第4頁2.2 體重變化見表 22.3 血常規(guī)檢驗結(jié)果見表 32.4 血生化檢測

6、結(jié)果見表 4 2.5 尿常規(guī)檢查2.5 臟器指數(shù)見表 5 2.6 病理組織學(xué)檢查表 2 2，4 滴原藥大鼠90 d 亞慢性毒性試驗體質(zhì)量變化情況性別劑量（mg/kg) 染毒周數(shù)0 2 5 8 10 13 雌0 37 73 146 雄0 37 73 146 表 3 2，4- 滴鈉鹽原藥大鼠90 d 亞慢性毒性試驗血液常規(guī)檢驗性別劑量（mg/kg) rbc/(1012l-1)hb/(gl-1)wbc/( 109l-1)gra/%lym/%雌性試驗前0 37 73 第5頁146 雄性試驗前0 37 73 146 雌性試驗后0 37 73 146 雄性試驗后0 37 73 146 表 4 2 ，4-

7、滴鈉鹽原藥大鼠90 d 亞慢性毒性試驗血生化檢測結(jié)果性別劑量（mg/kg) ast/(ul-1)alt/(ul-1)alp/(ul-1)bun/(mmol l-1)tp/(g l-1)alb/(g l-1)雌0 37 73 146 第6頁雄0 37 73 146 表 5 臟器指數(shù) %性別劑量（mg/kg) 大腦肝臟脾臟心臟肺臟胸腺腎臟腎上腺睪丸（卵巢）雌0 37 73 146 雄0 37 73 146 3. 討論控制實驗質(zhì)量1 大鼠毒理學(xué)實驗中實驗技術(shù)因素的質(zhì)量控制1. 1 動物臨床觀察指標(biāo)的質(zhì)量控制在藥品臨床前大鼠毒理學(xué)實驗研究過程中 , 其臨床觀察指標(biāo)主要包括行為活動、體質(zhì)第7頁量 、增質(zhì)

8、量、飼料生物利用度等，而體質(zhì)量、增質(zhì)量、飼料生物利用度指標(biāo)均為需要統(tǒng)計分析的客觀指標(biāo)。因其貫穿于整個實驗周期 , 數(shù)據(jù)的客觀性與實驗環(huán)境、給藥過程中動物感受是否舒適、動物密度、動物健康狀況等因素相關(guān)。在動物臨床指標(biāo)統(tǒng)計分析前控制體系中 , 實驗環(huán)境應(yīng)選擇 s p f級動物實驗室 ; 每籠 2 只 ; 體質(zhì)量在實驗前應(yīng)適應(yīng)環(huán)境周期1 周 ; 計算飼料攝入量每日應(yīng)稱質(zhì)量 , 每周給藥完畢即計算大鼠的飼料生物利用度 , 比較分析各組動物飼料生物利用度的統(tǒng)計學(xué)意義 ; 分析產(chǎn)生差異的原因 , 討論差異是否與動物自發(fā)性疾病 ( 如大鼠自發(fā)性糖尿病會引起大鼠飼料生物利用度明顯增大 ) 有關(guān) , 同時應(yīng)排除

9、營養(yǎng)因素或給藥途徑對動物的損傷因素 ; 在動物行為活動指標(biāo)觀察中應(yīng)在每日投藥過程中重點觀察大鼠投藥部位是否發(fā)生充血、水腫、嘔血 , 是否發(fā)生動物爭斗外傷、皮毛稀疏豎散、 糞便性狀改變等變化 , 并及時處理與藥物因素?zé)o關(guān)的改變 , 并詳細(xì)記錄 , 認(rèn)真分析。1. 2 血液學(xué)樣本的質(zhì)量控制大鼠慢性毒理學(xué)實驗中血液學(xué)常規(guī)的檢測項目主要有紅細(xì)胞計數(shù) ( r b c ) 、血紅蛋白定量 ( h b ) 、白細(xì)胞計數(shù)及其分類計數(shù) ( wb c+d c ) 、血小板計數(shù) ( p t ) 、凝血時間 ( c t ) ; 血清生物化學(xué)檢測項目主要有天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ( a s t ) 、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (

10、 a l t ) 、堿性磷酸酶 ( a l p ) 、總蛋白 ( t p ) 、清蛋白 ( a l b ) 、總膽固醇 ( t -c h o ) 、總膽紅素 ( t - b i l ) 、空腹血糖 ( g l u ) 、尿素氮 ( b u n ) 、肌酐 ( c r ) 。選擇合適的血樣采集法，不僅對動物損傷小、樣本溶血率低、可重復(fù)采樣等優(yōu)勢 , 而且使大鼠慢性毒理實驗中分階段檢測藥物對造血系統(tǒng)、生化系統(tǒng)的影響成為可能。1. 3 動物病理組織標(biāo)本分析前的質(zhì)量控制組織病理學(xué)檢查對于判斷實驗動物的毒性靶器官或靶組織具有重要意義。在長期毒理學(xué)實驗中有重要地位 , 是評價藥物毒性的重要依據(jù)。組織病理學(xué)

11、檢查對判斷動物的毒性靶器官或靶組織具有重要意義。 實踐中使用的組織學(xué)檢測前優(yōu)質(zhì)標(biāo)本取材流程可以為 : 根據(jù)實驗取材項目設(shè)計表格 , 需要取得臟器系數(shù)的器官或組織和其他器官或組織分別標(biāo)示于一個完整的記錄單元中 ; 使用 250 m l廣口瓶貯存新鮮配制的 10%甲醛溶液 180 200 m l 備用 ; 對擬取材的大鼠進(jìn)行解剖分組順序編號 ; 大鼠麻醉狀態(tài)下 , 股動脈放血致死胸腔組織 ( 胸腺、心、肺 ) 腹腔組織 ( 胃 、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、肝 、脾 、胰腺、腎上腺、腎 、卵巢、子宮、膀胱、前列腺、睪丸、附睪 ) 頸 、腦部組織 ( 甲狀腺、腦 、垂體、脊髓 ) 。其中胸腺、

12、胰腺、腎上腺、卵巢、甲狀腺、垂體、脊髓等腺體組織或微小組織應(yīng)使用擦鏡紙或紗布非擠壓式包裹置于 3. 6% 4. 0% 甲醛。這樣使浸泡于甲醛溶液中的易混淆臟器在進(jìn)行石蠟包埋時容易分辨 , 同時保證病理組織學(xué)檢查中組織樣本數(shù)目完整 ; 其他組織除大體觀察有明顯病灶的組織外 , 要求動物組織樣本均取自該組織的代表區(qū)。第8頁1. 4 動物實驗中的給藥途徑不同而引起的取材質(zhì)量控制因臨床給藥途徑不同 , 在大鼠慢性毒理實驗項目中存在不同的給藥方式 , 主要給途徑有主要給藥途徑有灌胃、直腸、舌下、腹腔注射、肌內(nèi)注射、皮膚涂抹等。在毒理學(xué)研究中可能通過對直接接觸藥物部位的檢測結(jié)果分析藥物慢性刺激對直接刺激局

13、部組織的影響 , 還可以分析藥物吸收和給藥技能合理與否。2 影響大鼠毒理學(xué)實驗結(jié)果的環(huán)境、動物福利、誤差控制2. 1 毒理學(xué)實驗中的環(huán)境控制在不同環(huán)境中進(jìn)行動物實驗的大鼠 , 對照組和藥物組動物均不同程度地存在因環(huán)境所致的炎性細(xì)胞浸潤或間質(zhì)性肺炎等病理變化 , 這些變化與實驗環(huán)境級別及日常消毒措施合理與否息息相關(guān)。 樣本固定前的大體解剖觀察處理與組織學(xué)檢查結(jié)果具有直接關(guān)系 , 取樣以肉眼能觀察到病灶的肺葉和表面觀察正常的肺葉各取一為原則 , 在同一個受試動物肺組織中不可單一地單純選擇大體觀察異常的小葉或大體觀察正常的小葉樣本。2. 2 毒理學(xué)實驗中的動物福利控制動物在毒理學(xué)研究過程中，會產(chǎn)生緊

14、張、疼痛、呼吸困難、痙攣、顫抖、腹瀉、孔道出血、癱瘓、休克 , 甚至死亡的情況。因此 , 它們在遇到恐懼或惡劣環(huán)境時 , 生理和心理都可能患病。 控制原則為實驗人員投藥過程時間宜短不宜長 , 抓取動物輕拿輕放 , 血清采樣宜快不宜慢 , 盡量提供人為因素影響小的實驗環(huán)境，要求實驗研究人員具備愛護(hù)動物之心和熟練的動物實驗技能并貫穿于整個實驗周期。2. 3 毒理學(xué)實驗中的誤差質(zhì)量控制在大鼠慢性毒理學(xué)實驗中系統(tǒng)誤差主要與樣本的隨機(jī)性、實驗操作的一致性、流程的恒定性有關(guān)。 抽樣誤差 : 一般情況下 , 慢性毒性實驗中每個實驗組應(yīng)使用相等數(shù)量的雌 、 雄動物。每組動物大鼠至少 20 只 。 差異應(yīng)不超過

15、平均體質(zhì)量的 20%。 系統(tǒng)誤差。包括下列兩類情況。 實驗技術(shù)熟練因素造成的誤差 : 在毒理學(xué)實驗研究中 , 為了真實反映外來化合物的毒性 , 除了要統(tǒng)一各種實驗條件外 , 每日的給藥時間應(yīng)一致。一是可比性強(qiáng) , 二是為了避免錯誤而影響其他藥理實驗甚至臨床用藥。 因此 , 應(yīng)將實驗人員的技術(shù)熟練因素以一定的模式貫穿于各實驗組中 , 在整個給藥期中給藥人員每天應(yīng)互換給藥的組別 ,同時應(yīng)保證給藥時間的準(zhǔn)確性和一致性； 流程造成的誤差控制 : 系統(tǒng)誤差可因分析方法、儀器校正錯誤、試劑純度不夠、檢測者的感觀、環(huán)境因素改變等因素造成 ; 隨機(jī)可能因動物實驗過程中各種隨機(jī)因素的共同作用等因素造成。 如實驗過程的溫度波動 - 電壓變