海島棉乙烯響應因子GbERF1-like在抗黃萎病反應中的功能解析

1、海島棉乙烯響應因子 GbERF1-like 在抗黃萎病反響中的功能解析棉花黃萎病是影響棉花生產的主要病害 , 乙烯信號路徑在棉花與黃萎病菌的 互作中扮演著重要的角色。明確乙烯在棉花抗黃萎病反響中的調節(jié)機制, 并調控乙烯信號路徑來改進棉花的抗病性對棉花抗病育種和生產具有重要意義。本研究從海島棉品種"7124"中克隆了乙烯信號路徑的一個 ERFs類轉錄因子 基因 GbERF1-like, 并對其在棉花抗黃萎病反響中的作用機制開展了研究 ,取得 的主要結果有：1、克隆了 GbERF1-like的全長序列,其ORFF!為537 bp,編碼179 個氨基酸的多肽，含有一個59個氨基酸

2、的ERFs類轉錄因子保守AP2/ERF結構域。 序列聚類顯示 GbERF1-like 與 GhERF1(AY181251.1), GhERF8(JN656957.1), TbERF (XM₀07035031.1 , GbERF5 (JN003808.1 )和 AtERF1(AB008103具有較高的同源性。表達分析顯示 GbERF1-like 在棉花的不同組織都有表達 ,并能快速響應 ET、MeJA處理。相對于感病的陸地棉,GbERF1-like在抗病的海島棉接種黃萎病菌 "V991 后上調表達迅速 , 并且持續(xù)的時間長。2、通過農桿菌介

3、導的遺傳轉化獲得了 GbERF1-like 在棉花中的超量表達系COV20 C0V5t抑制表達系 Ci8、Ci6,以及GbERF1-like在擬南芥中的超量表達 純系AOV12 AOV5接種鑒定分析說明,GbERF1-like的超量表達增強了轉基因棉 花和擬南芥的抗病性 , 而抑制 GbERF1-like 表達的轉基因棉花抗病性降低?；虮磉_分析說明GbERF1-like在棉花中能正調控PR3 PR4的表達,負調控PR1 PR5的表達。但在擬南芥中 GbERF1-like能促進 AtPR3 AtPR4及AtPDF1.2 的表達，但抑制AtPR2的表達。此外, 表達分析還顯示木質素合成路徑相關基

4、因表達受 GbERF1-like 表達水 平的影響，GhPAL5 GhC4H1 GhC3H、1 GhHCT、GhCCoAOMT和 GhF5H2等基因在GbERF1-like 超量表達棉花中表達上升 , 而在其抑制轉基因系中表達量下降。類 似的結果在擬南芥中也有發(fā)現(xiàn) , 這暗示 GbERF1-like 可能在植物中參與木質素合 成的調控。此外,與Mock相比，接種黃萎病菌后GbERF1-like超量表達的轉基因棉花、擬南芥中木質素合成路徑相關基因的表達上調更為顯著。用Wiesner方法對棉花莖的木質素染色結果顯示,Mock處理及"V991 處理后的各棉花材料均可被染為 紅色,所有接種處

5、理的著色明顯比 Mock深。在Mock處理的各材料間,GbERF1-like超量表達的轉基因棉花染色最深,而GbERF1-like 抑制表達的轉基因棉花染色最淺。 木質素總量測定與染色結果相符 接菌處理后,WT轉基因系莖的木質素總量均比 Mock處理對應材料顯著增加。在Mock及"V991 接種處理后,GbERF1-like超量表達的轉基因棉花、擬南芥中木質素總量分別比 WT增加6.9%-44.3%,而抑制GbERF1-like表達的轉基因棉花中木質素總量比 WT降低13.2%-23.4%。木質素單體測定說明,與Mock相比, 各材料的G和S單體在接菌后都增加。在Mock及"

6、;V991 接種處理后,棉花G單體含量在超表達材料中比 WT高但沒有到達顯著水平,RNAi系的G單體含量比 WT1著降低,在5.9%-12.4%之間。轉基 因擬南芥與 WT相比,G單體含量增加幅度在11.2%-31.6%之間。各棉花材料的S單體含量在兩種處理中，超表達材料含量較野生型增加10.8%-33.6%,而抑制表達的轉基因系下降，降低了 7.4%-12.9%。擬南芥的S單體 增加不明顯。3、分析顯示GhHCT和 AtPAL3兩個基因的啟動子序列均含有 TAAT-boxCAAT-box及GCCGCC-bd的ERF類轉錄因子結合順式元件。利用酵母單雜交分析說明GbERF1-like與GhHC

7、T和AtPAL3的啟動子之間存在互作。利用雙分子熒光檢測進一步證實 GbERF1-like 在棉花原生質體中可以結合GhHCT和AtPAL3基因的啟動子，并提高這兩個木質素合成關鍵基因的轉錄活性。 以上結果證明 GbERF1-like 直接參與了棉花及擬南芥的木質素合成調控。4、為了進一步證明 GbERF1-like 介導的棉花抗黃萎病增強與木質素合成激活有關, 我們利用病毒介導的基因沉默技術對 GbERF1-like 超量表達棉花材料 COV2沖的GhHCT進行了抑制。分子檢測、接種鑒定及木質素含量測定說明，在抑制GhHCT俵達后,GbERF1-like超量表達棉花材料的抗病性明顯降低，其莖

8、部 木質素含量減少。同時木質素合成相關基因的表達均受到影響 , 木質素合成上游基因 , 如GhPAL1 (Gbscaffold40957.1 )、GhPAL5 (Gbscaffold11559.9 )、GhC4H(Gbscaffold12103.1 )普遍表現(xiàn)為表達量降低 ,而木質素合成下游的基因那么普遍 表現(xiàn)為表達水平上升 , 如 GhCCR(Gbscaffold2152.13 ) , GhCAD(Gorai.009G192400.1 ) , GhFSH (Gbscaffold12698.2 )和 GhCOMT (Gorai.004G125600.1 )。以上結果證明木質素合成增強在 GbERF1-like 介導的 棉花抗黃萎病反響中具有重要作用。5、通過酵母雙雜交篩選鑒定到局部與 GbERF1-like 互作的蛋白因子。局部因子為前期己報道參與棉花抗病反響的蛋白,如MAPK, MLP, DIRIGENT(Cai et al.,2021;Yang et al.,2021;