球孢白僵菌營養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件

1、球孢白僵菌營養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件研究報告人：姚珺玥1.研究背景2.研究內(nèi)容3.研究方法4.主要結(jié)果與結(jié)論5.討論1.研究背景球孢白僵菌( Beauveria bassiana)( 以下簡稱白僵菌) 是一種常見的昆蟲病原真菌, 具有寄主范圍廣, 致病力強, 對人畜林木作物無毒害, 不傷天敵, 不污染環(huán)境等特點，長期以來被用做生物防治害蟲的重要手段。到目前為止, 已被開發(fā)的白僵菌制劑有粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑、油劑、乳劑、膠囊劑等。白僵菌油劑由于具有粘著力強, 滲透性好, 能破壞蟲體表面蠟質(zhì)層和幾丁質(zhì)層, 利于芽管侵入的特點, 使得其成為白僵菌主要的研發(fā)劑型。2.研究內(nèi)容選用經(jīng)生物測定毒力強的分離自馬

2、尾松毛蟲的 Bb13 為菌株, 從有關(guān)生物學研究著手, 將菌株基礎(chǔ)培養(yǎng)制備白僵菌孢子粉的營養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件進行正交組合實驗,通過分析比較所得孢子的含孢量和萌發(fā)率, 旨在篩選出生產(chǎn)高質(zhì)量白僵菌孢子粉的營養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件,為提高白僵菌孢子粉質(zhì)量和抗逆性做出研究。3.研究方法1.接種及培養(yǎng)2.含孢量測定3.萌發(fā)率測定3.1接種及培養(yǎng)將經(jīng)活化的菌種接入種子培養(yǎng)基, 在(251)的搖床上振蕩( 170r/min) 培養(yǎng) 4d。培養(yǎng)液均勻地涂抹于表面平鋪有無菌玻璃紙的 SDAY 培養(yǎng)基上( 40 個皿) ,傾去產(chǎn)孢培養(yǎng)基表面多余的培養(yǎng)液, 并將培養(yǎng)皿用保鮮膜密封。將接過種的培養(yǎng)皿置于(251)的無菌培養(yǎng)箱

3、中培養(yǎng) 5d, 待產(chǎn)孢培養(yǎng)基表面長滿菌絲時揭去保鮮膜, 再培養(yǎng) 46d 使菌絲大量產(chǎn)孢, 然后人工收獲培養(yǎng)基表面的孢子粉, 在常溫下通風處晾干后貯存于密封塑料袋中, 并放于 4的冰柜中保存。3.2含孢量測定含孢量測定: 稱取 20g 待測孢子粉于 50ml 0.5%Tween-80 無菌溶液中, 用高速分散器分散均勻, 稀釋，搖勻后立即用血球板計數(shù)測定孢子懸浮液的濃度, 每種待測孢子粉的測定重復 5 次, 計算孢子粉的平均含孢量。3.3萌發(fā)率測定將待測孢子粉用 0.5%Tween-80 無菌溶液配成濃度為 107 個孢子 /ml 的懸浮液, 吸取 1ml 加入到盛有9ml 萌發(fā)營養(yǎng)液( 蛋白胨

4、 0.5%、蔗糖 1%、另加 0.5%OP) 的小三角瓶中,(251)振蕩( 120r/min) 培養(yǎng) 24h后, 用血球計數(shù)器計數(shù)液樣中發(fā)芽和未發(fā)芽的孢子數(shù),重復取樣測定 3 次, 計算平均萌發(fā)率, 即為孢子粉的活孢率。孢子萌芽的標準為可見芽管長度等于或者大于孢子直徑。4.主要結(jié)果與結(jié)論4.1.1 碳源因素對孢子質(zhì)量指標的影響就含孢量而言, 碳源以葡萄糖( A1) 最好, 添加葡萄糖的培養(yǎng)基所產(chǎn)孢子的含孢量達到 3.231011/g, 其次是蔗糖, 以添加乳糖的效果最差, 含孢量僅為1.871011/g; 就萌發(fā)率而言, 也是以添加葡萄糖效果最好, 使得孢子萌發(fā)率達到 88.41%, 其次為

5、乳糖, 以添加蔗糖和淀粉的效果較差, 萌發(fā)率僅分別為85.67%和 85.68%。4.1.2氮源因素對孢子質(zhì)量指標的影響就含孢量而言, 由圖 3 可知, 各氮源因素的影響差異不是特別顯著, 其中, 以添加蛋白胨(B4)對提高的含孢量效果最好, 使含孢量達到 2.991011/g, 其次是硝酸鉀, 以添加尿素的效果最差, 含孢量僅為 2.041011/g; 就萌發(fā)率而言, 由圖 4 可知, 以添加甘氨酸和蛋白胨的效果為最好, 分別使孢子萌發(fā)率達到 88.48%和 88.07%,以添加硝酸鉀的效果最差, 孢子萌發(fā)率僅為 84.96%。4.1.3 不同微量元素對孢子質(zhì)量指標的影響由圖 5和 6 可知

6、, 微量元素對孢子含孢量和萌發(fā)率影響的趨勢基本相同, 都是以 Zn(E3)的效果最好, 使得孢子的含孢量和萌發(fā)率分別達到 2.911011/g 和 88.68%,其次是 Cu, 都以微量元素 Fe 和 Mn 的效果最差, 尤以 Fe 對孢子萌發(fā)率的效果最差, 它明顯使得孢子萌發(fā)率低于其他微量元素。4.2培養(yǎng)條件對孢子質(zhì)量指標的影響由圖 7 和 8 可知, 和孢子所需的營養(yǎng)因子一樣,孢子的培養(yǎng)條件也明顯影響孢子的質(zhì)量指標, 就含孢量而言, 培養(yǎng)溫度為 2025對提高孢子含孢量有明顯地效果, 尤以20(C2)為最好, 在該溫度下, 孢子含孢量達到 3.301011/g, 15和 30對提高孢子的含

7、孢量很不利, 培養(yǎng)環(huán)境中的 pH 值對孢子含孢量影響也很大, 孢子含孢量達到較高水平的 pH 值在 7(E3)左右, 此時孢子含孢量達到 2.911011/g; 就萌發(fā)率而言, 溫度和 pH 值對其影響的趨勢差不多, 都在因素 2 即溫度為 20(C2)、pH 在 6(E2)達到最高, 分別為 94.53%和 89.63%, 溫度在 15、pH 在 8 左右萌發(fā)率最低。4.3五個因素對孢子質(zhì)量指標的綜合影響碳源(A)、氮源(B)、溫度(C)、Ph(D)及微量元素(E) 五個因素對球孢白僵菌孢子含孢量和萌發(fā)率的影響可見表 2, 就含孢量而言, 五個因子中, 溫度的極差值最大, 為 1.67, 其

8、次是碳源和 pH 值, 微量元素的極差值最小, 僅為 0.90, 這說明對含孢量影響最大的因素是溫度, 其次是碳源和 pH 值, 微量元素對含孢量影響作用最小, 各因素對含孢量影響的主次順序為 CADBE; 就萌發(fā)率而言, 五個因素中, 也是以溫度的極差值最大, 為 11.78, 其次是 pH 值的, 碳源的極差值最小, 僅為 2.74, 這說明溫度對萌發(fā)率的影響最大, 其次是 pH 值, 碳源影響最小, 各因素對萌發(fā)率影響的主次順序為 CDEBA。綜合上面結(jié)果分析, 球孢白僵菌最適宜的產(chǎn)孢培養(yǎng)基為 A1B4C3D2E3, 即 4%葡萄糖、1%酵母粉、1%蛋白胨、2%瓊 脂 、0.1%KH2P

9、O4、0.1%MgSO4、0.01%ZnSO4。培養(yǎng)基最佳 pH 為 6 左右, 培養(yǎng)最佳溫度為205.討論1 在球孢白僵菌培養(yǎng)基中, 無論是孢子含孢量還是孢子萌發(fā)率, 碳源都是單糖利用效果優(yōu)于雙糖和多糖;在添加的氮源中, 雖然有機氮蛋白胨對于提高含孢量和萌發(fā)率都有很好的效果, 但價格較高, 若單從提高含孢量角度考慮, 可以選用價格低、使用方便的無機氮硝酸鉀。2.此次實驗只采用了含孢量和萌發(fā)率這兩個質(zhì)量指標來評價球孢白僵菌孢子粉的質(zhì)量, 因為含孢量反映了菌株的產(chǎn)孢力、可能的擴散傳播能力; 萌發(fā)率反映了菌株的可能侵染性、致病力等, 而沒有采用反映孢子在環(huán)境中的抗逆性的另一指標含水量, 主要是考慮到生產(chǎn)出來的白