蛋白質(zhì)檢測方法匯總

1、.蛋白質(zhì)檢測方法匯總2010-04-26 12:00:38|  分類： 蛋白電泳 |  標(biāo)簽： |字號大中小 訂閱 本文引用自嘯月天狼蛋白質(zhì)檢測方法匯總 更多相關(guān)資料請查看 蛋白質(zhì)檢測方法匯總 本實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)會各種蛋白質(zhì)含量的測定方法。了解各種測定方法的基本原理和優(yōu)缺點(diǎn)。  蛋白質(zhì)含量測定法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍(lán)法（Brad

2、ford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏1020倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。  值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：實(shí)驗(yàn)對測定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質(zhì)的性質(zhì)；溶液中存在的干擾物質(zhì)；測定所要花費(fèi)的時(shí)間。考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。一、微量凱氏（Kjel

3、dahl）定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：  CH2COOH  |         + 3H2SO4- 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3   (1)  NH2    2NH3 + H2SO4 - -(NH4)2SO4              

4、 (2)  (NH4)2SO4 + 2NaOH - 2H2O +Na2SO4 + 2NH3       (3)    反應(yīng)（1）、(2)在凱氏瓶內(nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以625即得。    五種蛋白質(zhì)測定方法比較如下：方法   

5、0;  靈敏度      時(shí)間      原理      干擾物質(zhì)     說明凱氏定氮法（Kjedahl法）  靈敏度低，適用于0.2 1.0mg氮，誤差為 ±2      費(fèi)時(shí)   810小時(shí)      將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定      非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）      用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測

6、定；干擾少；費(fèi)時(shí)太長雙縮脲法（Biuret法）    靈敏度低120mg    中速   2030分鐘      多肽鍵堿性Cu2?紫色絡(luò)合物      硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸      用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似紫外吸收法      較為靈敏50100mg      快速   510分鐘      蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基

7、在280nm處的光吸收      各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸      用于層析柱流出液的檢測；核酸的吸收可以校正Folin酚試劑法（Lowry法）      靈敏度高5mg      慢速 4060分鐘      雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原      硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇      耗費(fèi)時(shí)間長；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化考馬斯亮藍(lán)

8、法(Bradford法)      靈敏度最高15mg      快速515分鐘      考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm      強(qiáng)堿性緩沖液；TritonX-100;SDS      最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化二、雙縮脲法（Biuret法）（一）實(shí)驗(yàn)原理雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩 個分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與C

9、uSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。                                    H2O      O=C                     C=O 

10、;         HN                   NH      R-CH                       CH-R      O=C           Cu         

11、0;   C=O          HN                   NH      R-CH                       CH-R                  H2O  

12、0;             紫色絡(luò)合物    紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為110mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。  此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速 ，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。（二）試劑與器材  1. 試劑：  （1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標(biāo)

13、準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用BSA濃度1mg/ml的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用005N NaOH配制。  （2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑

14、色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。  2. 器材：  可見光分光光度計(jì)、大試管15支、旋渦混合器等。（三）操作方法  1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（2025）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。  2、樣品的測定：取23個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過

15、10mg/ml。三、Folin酚試劑法（Lowry法）（一）實(shí)驗(yàn)原理  這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：?在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。 Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。 

16、Folin酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個測定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只

17、須加濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉氫氧化鈉溶液的濃度12倍。  進(jìn)行測定時(shí)，加F olin酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸磷鎢酸試劑 被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。  此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。  此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測定范圍是20250mg。（二）試劑與器材  1.試劑  （1）試劑甲：（A）     &

18、#160;（A）     10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉 （KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500毫升蒸餾水中。（B）      （B）     0.5克硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。  （2）試劑乙：  在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）,25克鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸

19、，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克 硫 酸 鋰（Li2SO4），50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:  精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或 g球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。  2. 器材（1）可見光分光光度計(jì)（

20、2）旋渦混合器（3）秒表（4）試管16支（三）操作方法  1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（2025）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，

21、吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。  注意：因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。  進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯，每位學(xué)生都必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），并按由左

22、至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測得的吸光度值。Folin酚試劑法實(shí)驗(yàn)表格： 管號         1   2   3   4   5   6   7   8   9   10標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)   0   0.1 0.2   0.4   0.6   0.8 1.0     （250mg/ml）         

23、0;                 未知蛋白質(zhì)                           0.2   0.4 0.6（約250mg/ml）蒸餾水     1.0   0.9 0.8   0.6   0.4   0.2   0   0.8 0.6   0.4試劑甲  

24、  5.0   5.0 5.0   5.0   5.0   5.0   5.0 5.0 5.0   5.0試劑乙     0.5   0.5 0.5   0.5   0.5   0.5   0.5 0.5 0.5   0.5每管中蛋白質(zhì)的量（mg）吸光度值（A700）    2. 樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20250微克），按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的

25、測定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。  根據(jù)所測樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。  注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度（相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。四、改良的簡易Folin酚試劑法（一）試劑  1. 試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅，配制時(shí)注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后，最后加入。  2. 試

26、劑乙：與前面的基本法相同。臨用時(shí)加蒸餾水稀釋8倍。  3. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：同基本法。（二）操作步驟  測定標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1毫升，室溫放置10分鐘后，試劑乙改為4毫升。在55恒溫水浴中保溫5分鐘。用流動水冷卻后，在660nm下測定其吸光度值。  改良的快速簡易法，可獲得與 Folin酚試劑法（即Lowry基本法）相接近的結(jié)果。五、考馬斯亮蘭法（Bradford法）（一）實(shí)驗(yàn)原理  雙縮脲法（Biuret法）和Folin酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。&#

27、160; 1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。  考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。  在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。  Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：&#

28、160; （1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。  （2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。  （3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、

29、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。  此法的缺點(diǎn)是：  （1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。  （2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。  （3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。（二）試劑與器材 

30、 1. 試劑：  （1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用 g球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。  （2）考馬斯亮蘭G250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。  2. 器材：  （1）可見光分光光度計(jì)  （2）旋渦混合器  （3）試管16支（三）操作方法  1. 標(biāo)準(zhǔn)方法  （1）取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/

31、ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。  （2）加完試劑25分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計(jì)上測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對照為第1號試管，即0.1mlH2O加5.0mlG250試劑。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以

32、洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時(shí)間浸泡。考馬斯亮蘭法實(shí)驗(yàn)表格：    管 號   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)   0 0.01   0.02   0.04 0.06 0.08   0.10   (1.0mg/ml) 未知蛋白質(zhì)                  

33、           0.02 0.04 0.06   (約1.0mg/ml) 蒸餾水     0.1 0.09   0.08 0.06   0.04 0.02   0   0.08 0.06 0.04   考馬斯亮藍(lán) G250試劑 5.0 5.0   5.0   5.0   5.0   5.0   5.0   5.0   5.0   5.0   每管中的蛋白質(zhì)量（mg） 光吸

34、收值 （A595）    （3）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。  0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。  2. 微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)（10100mg/ml）,可將取樣量（包括補(bǔ)加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白對照則分別為0.5ml或1.0ml H2O, 考馬斯亮藍(lán)G250試劑仍加5.0ml, 同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定595nm的光吸收值。  0.05mg牛血清蛋白/ml溶液

35、的A595約為0.29。六、紫外吸收法  蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。  紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH4）2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因?yàn)榇藭r(shí)只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。&#

36、160; 此法的特點(diǎn)是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。  此外，進(jìn)行紫外吸收法測定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時(shí)的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。 

37、 下面介紹四種紫外吸收法：  1. 280nm的光吸收法  因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。  測定時(shí)，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，A280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。 

38、 許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長下的光吸收值（A11cm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A11cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%，光徑為1cm時(shí)的光吸收值）的關(guān)系。文獻(xiàn)值A(chǔ)11cm,稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。    蛋白質(zhì)濃度 = (A28010 )/ A11cm,280nm (mg/ml)  (Q   1%濃度?10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ： A11cm=6.3 (280nm)    溶菌酶 ：     A11cm=22.8 (280nm) 

39、  若查不到待測蛋白質(zhì)的A11cm值，則可選用一種與待測蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（BSA）。  標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取6支試管，按下表編號并加入試劑：管號             1     2     3     4     5     6 BSA（1.0mg/ml）    

40、 0   1.0   2.0   3.0   4.0   5.0H2O             5.0   4.0   3.0   2.0   1.0   0A280    用第1管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計(jì)上測定吸光度A280，以A280為縱座標(biāo)，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線，利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用2

41、至6管A280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì)濃度計(jì)算出該蛋白質(zhì)的A11cm,280nm  2. 280nm和260nm的吸收差法  核酸對紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：        純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260 ? 1.8      純核酸的光吸收比值： A280/A260 ? 0.5

42、60;   含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。        蛋白質(zhì)濃度=1.45×A2800.74×A260 (mg/ml)    此經(jīng)驗(yàn)公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的。  3. 215nm與225nm的吸收差法  蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時(shí)，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定蛋白質(zhì)稀

43、溶液的濃度。  用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成20100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì)溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度值，并計(jì)算出吸收差：                          吸收差D= A215 A225    以吸收差D為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測出未知樣品的吸收差，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。  本方法在蛋白質(zhì)濃度20100mg/ml范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與

44、吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等緩沖液，都無顯著干擾作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、巴比妥等緩沖液的215nm光吸收值較大，必須將其濃度降到0.005M以下才無顯著影響。  4. 肽鍵測定法  蛋白質(zhì)溶液在238nm處的光吸收的強(qiáng)弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制一系列50500mg/ml已知濃度的5.0ml蛋白質(zhì)溶液，測定238nm的光吸收值A(chǔ)238，以A238為縱座標(biāo), 蛋白質(zhì)含量為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。  進(jìn)行蛋白質(zhì)溶液的柱層析

45、分離時(shí)，洗脫液也可以用238nm檢測蛋白質(zhì)的峰位。  本方法比280nm吸收法靈敏。但多種有機(jī)物，如醇、酮、醛、醚、有機(jī)酸、酰胺類和過氧化物等都有干擾作用。所以最好用無機(jī)鹽，無機(jī)堿和水溶液進(jìn)行測定。若含有有機(jī)溶劑，可先將樣品蒸干，或用其他方法除去干擾物質(zhì)，然后用水、稀酸和稀堿溶解后再作測定。 考馬斯亮蘭法（Bradford法）（一）實(shí)驗(yàn)原理雙縮脲法（Biuret法）和Folin酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法?？捡R斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)