第十四章 甾體激素的微生物轉(zhuǎn)化工藝

1、u了解甾體激素種類及其微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)原理；u熟悉甾體激素的生產(chǎn)工藝過(guò)程；u掌握氫化可的松的生產(chǎn)技術(shù)。第一節(jié) 概述u認(rèn)識(shí)認(rèn)識(shí)甾體激素甾體激素 甾類藥物是指分子結(jié)構(gòu)中含有環(huán)戊烷多氫菲核的一類藥物，在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用非常廣泛，特別是甾體激素類藥物，應(yīng)用在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，控制炎癥，避孕，利尿等各方面的治療上，對(duì)機(jī)體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。甾類激素根據(jù)其生理活性可分為腎上腺皮質(zhì)激素，性激素和蛋白同化激素三大類。甾體化合物的基本結(jié)構(gòu)如下：1716151413121110987654321ABCD 圖14-1 甾體化合物的基本結(jié)構(gòu)甾類激素藥物的生產(chǎn)，目前一般采用化學(xué)合成和微生物轉(zhuǎn)化兩種方法相結(jié)合的生產(chǎn)工藝。第二節(jié)

2、微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)原理 微生物幾乎對(duì)甾體每個(gè)位置都能進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中對(duì)甾體激素藥物合成比較重要的主要有氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)、水解反應(yīng)等。其中氧化反應(yīng)又包括甾體骨架上的羥基化和脫氫（生成雙鍵）、甾醇氧化成甾酮、支鏈降解作用以及D環(huán)的切斷和D環(huán)開(kāi)裂形成內(nèi)酯環(huán)等。羥化反應(yīng)羥化反應(yīng)uC9羥化羥化C9羥化在甾體藥物合成中是一個(gè)關(guān)鍵中間步驟，涉及到甾體邊鏈的選擇性降解，并且是皮質(zhì)激素合成中一個(gè)關(guān)鍵中間體。由于C9位上導(dǎo)入羥基后，容易在C9C10之間引入雙鍵，然后進(jìn)一步形成C11羥基或?qū)敕?。例如甾體合成中重要中間體9-羥基-4-雄甾烯-3，17雙酮和9-羥基-3氧化娠烷-4，17雙烯-20羧酸的制取。uC11

3、羥化C11羥化是微生物轉(zhuǎn)化的特有反應(yīng)。如孕酮的轉(zhuǎn)化中，利用黑根霉在溫度不超過(guò)320C時(shí)實(shí)現(xiàn)C11羥基化反應(yīng)。溫度的控制很重要，生產(chǎn)過(guò)程中溫度超過(guò)320C，黑根霉只會(huì)大量生長(zhǎng)菌絲而不對(duì)孕酮進(jìn)行C11羥化。過(guò)程伴隨有微量副產(chǎn)物出現(xiàn)。環(huán)氧化反應(yīng)環(huán)氧化反應(yīng) 用微生物轉(zhuǎn)化法在甾體母核上引入環(huán)氧基團(tuán)的反應(yīng)與微生物羥基化有關(guān)。能產(chǎn)生11-羥基化的新月彎孢霉或布氏小克漢銀霉都可將17，21-二羥基-4，9（11）-孕甾二烯-3，20-二酮轉(zhuǎn)化成9，11環(huán)氧化合物。脫氫反應(yīng)脫氫反應(yīng) 微生物對(duì)甾體C1，C2位是直接脫去C1，C2位上的氫。微生物對(duì)甾體羥化與脫氫能力是相反的，細(xì)菌的脫氫能力比真菌大，特別是棒狀桿菌和

4、分枝桿菌活力最大。球形芽孢桿菌，諾卡氏菌對(duì)可的松和皮質(zhì)醇也有較高的脫氫活力。而對(duì)甾體母核有脫氫活力的微生物，常伴隨邊鏈降解和C26位酮基還原以及其C9羥化引起環(huán)打開(kāi)等作用。甾體母核及邊鏈的選擇性降解機(jī)理甾體母核及邊鏈的選擇性降解機(jī)理 具有生理活性甾體類藥物的基本母核目前都是從高等動(dòng)植物中獲得的，首先必須有選擇性地對(duì)其邊鏈進(jìn)行降解。 甾醇邊鏈降解機(jī)理與脂肪酸的氧化途徑相似。膽甾醇的邊鏈降解從C27羥基化開(kāi)始，再氧化成C27羧醇，繼后氧化先失去丙酸、醋酸，最后再失去丙酸，形成C17酮化合物，最后一步轉(zhuǎn)化為脫氫，加水和開(kāi)裂。 甾體母核的降解，先在C3進(jìn)行酯化，3-羥基氧化后接著5雙鍵被異構(gòu)酶催化轉(zhuǎn)位

5、為4雙鍵，但此步異構(gòu)化也可發(fā)生于非酶催化。在3-酮-4-烯化合物9-羥基化后，隨著C-1(2)-脫氫同時(shí)，甾體母核A環(huán)芳香化并導(dǎo)致環(huán)開(kāi)裂。第三節(jié) 甾體激素的生產(chǎn)工藝過(guò)程 甾體的微生物轉(zhuǎn)化和一般的氨基酸、抗生素的生產(chǎn)不同，發(fā)酵的產(chǎn)物不是目的產(chǎn)物，而只是利用微生物的酶對(duì)甾體底物的某一部位進(jìn)行特定的化學(xué)反應(yīng)來(lái)獲得一定的產(chǎn)物。整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程，微生物的生長(zhǎng)和甾體的轉(zhuǎn)化完全可以分開(kāi)，一般先進(jìn)行菌的培養(yǎng)，在菌生長(zhǎng)過(guò)程中累積甾體轉(zhuǎn)化所需要的酶，然后利用這些酶來(lái)改造分子的某一部位。 甾體的微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)流程甾體的微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)流程 甾體的微生物轉(zhuǎn)化兩個(gè)階段。生長(zhǎng)階段，它是將菌種接入斜面培養(yǎng)基或小米培養(yǎng)基培養(yǎng)35d

6、，然后將成熟的菌種細(xì)胞或孢子接入搖瓶或種子罐，給予合適的溫度、溶氧濃度、pH值等條件培養(yǎng)，使其充分繁殖與生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化階段是在微生物生長(zhǎng)的終點(diǎn)，逐漸將甾體的粉末或適當(dāng)?shù)模ㄓ袡C(jī)）溶液加到培養(yǎng)物中，或把成熟細(xì)胞分離洗滌，然后懸浮于水或緩沖液中，再將底物加入，加入方式如圖。大多數(shù)甾體化合物難溶于水，所以常用的方法是先把底物溶于有機(jī)溶劑，如丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺，濃度在2%對(duì)微生物無(wú)毒性?；蛴帽砻婊钚詣ㄈ缤聹?0）來(lái)提高基質(zhì)溶解度。 甾體氧化需要較大的通氣量，一般為1：0.8（v/v/min）。甾體加入的速度隨菌種轉(zhuǎn)化能力和基質(zhì)的性質(zhì)而定，采用基質(zhì)的定期加入和連續(xù)加入的辦法來(lái)解決基質(zhì)或產(chǎn)物的毒性

7、問(wèn)題。轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物大多不溶于水，所以采用溶媒萃取法進(jìn)行提取。微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)甾體化合物一般采用二級(jí)培養(yǎng)，其工藝流程如下。 如果產(chǎn)物分泌在發(fā)酵液中，則發(fā)酵濾液采用離子交換樹(shù)脂吸附法吸附甾體化合物，洗脫后，減壓濃縮進(jìn)行結(jié)晶。甾體微生物轉(zhuǎn)化方式甾體微生物轉(zhuǎn)化方式進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以利用不同形式的微生物細(xì)胞。菌體培養(yǎng)物（單菌體或混合菌體培養(yǎng)液）靜止細(xì)胞懸液（使菌體充分生長(zhǎng)發(fā)育后，用過(guò)濾或離心法進(jìn)行分離，將收集到的菌體懸浮在水或適當(dāng)?shù)木彌_液中，再將甾類化合物加入進(jìn)去。）孢子懸液干細(xì)胞固定化細(xì)胞或固定化酶等。氫化可的松的制備氫化可的松的制備 氫化可的松（Hydrocortisone）又稱為皮質(zhì)醇，化學(xué)名稱

8、為11，17，21-三羥基孕甾-4-烯-1，20-二酮。其結(jié)構(gòu)式為氫化可的松為白色或幾乎白色的結(jié)晶性粉末，無(wú)臭，初無(wú)味，隨后有持續(xù)的苦味，遇光逐漸變質(zhì)，略溶于乙醇或丙酮，微溶于氯仿，在乙醚中幾乎不溶，不溶于水。熔點(diǎn)為212222。 氫化可的松為皮質(zhì)激素類藥物，具有影響糖代謝、抗炎、抗毒、抗休克及抗過(guò)敏等作用。主要用于腎上腺皮質(zhì)功能不足和自體免疫性疾病。應(yīng)用于某些感染的綜合治療。消化性潰瘍病、骨質(zhì)疏松癥、精神病、重癥高血壓患者忌用，充血性心力衰竭、糖尿病、急性感染病慎用。u反應(yīng)原理反應(yīng)原理在產(chǎn)物中，除了氫化可的松（簡(jiǎn)稱體）（b）外，還產(chǎn)生11-羥基化合物即表氫可的松（又稱為體）（c）、少量的其它位置的羥基化合物和未轉(zhuǎn)化的化合物S（a）。所以在產(chǎn)品的分離純化時(shí)，以上各種物質(zhì)必須分離出去。第四節(jié) 其他工藝技術(shù)及技術(shù)改造方向u工藝過(guò)程u開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品 紅霉素的半合衍生物：羅紅霉素、阿齊霉素、克拉霉素和地紅霉素等。這類半合成紅霉素具有耐酸、高效、長(zhǎng)效等特點(diǎn)，可減少給藥劑量和次數(shù)，所以不良反應(yīng)發(fā)生率亦比紅霉素低。 將紅霉素制備成紅霉素有機(jī)酸鹽類和酯類衍生物可大大地改進(jìn)了紅霉素的性能。如紅霉素乳糖酸鹽用