臨床檢驗技師考試輔導(dǎo)(80)

1、第十四章免疫細(xì)胞的分離及其表面標(biāo)志檢測技術(shù)第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離一、 外周血單個核細(xì)胞的分離外周血中單個核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的比重與紅細(xì)胞、 多核白細(xì)胞及血小板不同，介于 1.075 1.090 之間，紅細(xì)胞及粒細(xì)胞在1.092 左右，血小板在 1.030 1.035 之間，因而可利用一種比重介于1.075 1.092 之間而近于等滲的溶液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布而加以分離。分離介質(zhì)是分離各類細(xì)胞的關(guān)鍵，對分離介質(zhì)的基本要求是：對細(xì)胞無毒；基本等滲；不溶于血漿及分離物質(zhì)；有特定的比重。Ficoll分離液為常規(guī)的淋巴細(xì)胞分離液，其比重為1.077 ± 0

2、.002 ，主要用于分離外周血中單個核細(xì)胞。其分布由上到下依次為：稀釋的血漿層、單個核細(xì)胞層、粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞層。二、淋巴細(xì)胞的分離純淋巴細(xì)胞群的采集是利用單核細(xì)胞在37和 Ca2+ 存在時，能主動黏附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性，從單個核細(xì)胞懸液中除去單核細(xì)胞，從而獲得純淋巴細(xì)胞群。主要的方法有：1. 黏附貼壁法；2. 吸附柱過濾法；3. 磁鐵吸引法；4.Percoll分離液法。三、 T、B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞亞群的分離（一）磁性微球分離法（二）熒光激活細(xì)胞分離儀分離法四、分離細(xì)胞的保存及活力測定1. 短期保存技術(shù)：將分離的細(xì)胞用適量含 10% 20%滅活小牛血清 的 Ha

3、nks、 Tc-199 、 RPMI1640或其他培養(yǎng)液稀釋重懸。 短期保存可置于 4保存。2. 長期保存技術(shù)：液氮深低溫（ -196 ）環(huán)境保存細(xì)胞，加入二甲亞砜作為保護(hù)劑。活力測定最簡便常用的為臺盼藍(lán)染色法。這是一種陰離子型染料， 不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，但死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，可使染料通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞著色呈藍(lán)色，通過死亡細(xì)胞與活細(xì)胞的百分比可反映細(xì)胞活力。第二節(jié)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志及亞群分類常用于鑒定和檢測淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的是簇分化抗原（CD）。 CD抗原的鑒定和檢測依賴于其相應(yīng)的單克隆抗體。一、 T 細(xì)胞表面標(biāo)志及其亞群T 細(xì)胞是參與機體細(xì)胞免疫

4、反應(yīng)并起主導(dǎo)調(diào)節(jié)作用的一組免疫細(xì)胞。所有的 T 細(xì)胞均有共同的標(biāo)志性抗原，一般認(rèn)為是 CD3分子，不同功能的T 細(xì)胞亞群又有各自的標(biāo)志性抗原。根據(jù)T 細(xì)胞的免疫效應(yīng)功能和表面 CD分子表達(dá)至少可以將+-+T 細(xì)胞分為： CD3CD4CD8輔助性 T 細(xì)胞（ help T cell Th）、 CD3CD4 CD8細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（ cytotoxicT cell ,Tc+T cell ,Tr或 Treg ）或 CTL）和 CD4CD25調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（ regulatory等幾組亞群。（一） T 細(xì)胞表面主要的 CD抗原1. CD2：表達(dá)于全部人T 細(xì)胞和 NK細(xì)胞表面 ，因其能與綿羊紅細(xì)胞

5、（SRBC）結(jié)合，又稱為綿羊紅細(xì)胞第 1 頁受體。2. CD3：表達(dá)于全部 T 細(xì)胞表面，是 T 細(xì)胞的表面標(biāo)志 ，是 TCR-CD3復(fù)合物的重要組成部分。3.CD4/CD8：CD4和 CD8分子分別表達(dá)于外周血不同的T 細(xì)胞亞群表面， 是區(qū)分 T 細(xì)胞亞群的重要標(biāo)志。表達(dá) CD4的主要是輔助性T 細(xì)胞，表達(dá)CD8的主要是細(xì)胞毒性T 細(xì)胞。4. 致有絲分裂受體、病毒受體。（二） T 細(xì)胞亞群+-1. 輔助性 T 細(xì)胞：表面標(biāo)志是 CD3CD4CD8。主要有兩種輔助性 T 細(xì)胞（ Th1， Th2），其產(chǎn)生的細(xì)胞因子不同。 Th1 主要分泌 IL-2 、 IFN- 或 TNF- 等細(xì)胞因子輔助細(xì)

6、胞免疫或參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)，本身具有明顯的細(xì)胞毒作用；Th2 主要分泌 IL-4、 IL-5、IL-6 或 IL-10等細(xì)胞因子輔助體液免疫，參與速發(fā)型超敏反應(yīng)，但本身不具有明顯的細(xì)胞毒作用。+Th1 和 Th2 十分相似，遂細(xì)分2. 細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞：表面標(biāo)志是 CD3CD4 CD8。分泌細(xì)胞因子的特征與為 Tc1 與 Tc2，Tc1 與 Tc2 都有典型的細(xì)胞毒性效應(yīng)。3. 調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞：主要包括兩個亞群，一種是+CD4CD25調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞；另一種為 CD8調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞，+-T 細(xì)胞。其主要包括 CD8CD28 調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞和CD8CD28限制性的調(diào)節(jié)性二、 B 細(xì)胞表面

7、標(biāo)志B 細(xì)胞活化后轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，分泌抗體，執(zhí)行體液免疫功能。B 細(xì)胞表面的膜免疫球蛋白（SmIg）、 Fc受體、補體受體、 EB病毒受體和小鼠紅細(xì)胞受體是 B 細(xì)胞的重要表面標(biāo)志，其中以 SmIg 為 B 細(xì)胞所特有，是鑒定 B 細(xì)胞可靠的指標(biāo)。 B 細(xì)胞表面較特異的 CD分子有 CD19、 CD20、 CD21、 CD22和 CD23等，其中有些屬全體 B 細(xì)胞共有的標(biāo)志，而有些僅是活化B 細(xì)胞特有，據(jù)此可用單克隆抗體，通過間接熒光免疫法、酶免疫組化法或流式細(xì)胞技術(shù)對其進(jìn)行檢測。膜免疫球蛋白（mIg）又稱為 BCR，表達(dá)于所有成熟的B 細(xì)胞表面，是B 細(xì)胞最具特性的表面標(biāo)志。mIg的主要作用

8、是結(jié)合特異性抗原，故又稱為抗原受體。成熟 B 細(xì)胞的 mIg 主要為 mIgM和 mIgD。B 細(xì)胞及其亞群的檢測是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫調(diào)節(jié)紊亂的重要指標(biāo)。三、 NK細(xì)胞表面標(biāo)志-+NK細(xì)胞的表面標(biāo)志：人類NK細(xì)胞表面標(biāo)志主要以CD16、 CD56來認(rèn)定。 目前 NK標(biāo)志以 CD3、 CD16、+受體，當(dāng) IgG 類抗體與靶細(xì)胞表面相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)CD56為公認(rèn) 。 CD16分子又稱為低親和性 IgG Fc合后， 可通過其 Fc 段與 NK細(xì)胞表面 FcR 結(jié)合， 行使針對靶細(xì)胞的定向非特異性殺傷作用，也即NK細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ ADCC） 。第三節(jié)抗原提呈細(xì)

9、胞（APC）指能攝取、加工、處理抗原，并將抗原提呈給抗原特異性淋巴細(xì)胞的一類免疫細(xì)胞。抗原提呈細(xì)胞可分為兩類：“專職”抗原提呈細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B 細(xì)胞，它們均可表達(dá)MHC-類分子；“非專職” 抗原提呈細(xì)胞， 包括內(nèi)皮細(xì)胞、 上皮細(xì)胞和激活T 細(xì)胞等， 它們在某些因素刺激下可表達(dá)MHC-類分子，并具有抗原提呈功能。另外，所有表達(dá)MHC-類分子并具有提呈內(nèi)源性抗原能力的細(xì)胞，廣義上也屬于抗原提呈細(xì)胞。一、單核 - 吞噬細(xì)胞系統(tǒng)單核 - 吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）包括骨髓內(nèi)的前單核細(xì)胞、外周血中的單核細(xì)胞和組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞。單核- 吞噬細(xì)胞的典型的表面標(biāo)志是CD14。第 2 頁二、樹突狀

10、細(xì)胞（DC）樹突狀細(xì)胞（DC）是一大類專職抗原提呈細(xì)胞，其主要有兩種來源，即髓系和淋巴系。DC是形態(tài)、表型和功能高度異質(zhì)的細(xì)胞。根據(jù)刺激T 細(xì)胞增殖能力的不同，它們被分為成熟和不成熟的 DC；根據(jù)誘導(dǎo)T 細(xì)胞分化為不同效應(yīng)T 細(xì)胞的功能，將它們分為誘導(dǎo)分化Th1 的 DC（ DC1）和誘導(dǎo)分化Th2 的 DC（DC2）；根據(jù)明顯的譜系和細(xì)胞表型的不同，分為骨髓DC和淋巴 DC。人成熟 DC的主要特征表面標(biāo)志為CD1a、 CD11c和 CD83，但不表達(dá)其他淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志。第四節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測及應(yīng)用一、免疫細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測方法通常采用相應(yīng)的標(biāo)記單克隆抗體為探針，通過標(biāo)志物對陽性細(xì)胞

11、作出指示，對有關(guān)細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，根據(jù)標(biāo)志物的不同形成了不同的檢測方法，有代表性的幾種方法為：（一）抗體致敏細(xì)胞花環(huán)法（二）免疫細(xì)胞化學(xué)法（三） 免疫熒光法 ：將分離得到的外周血單個核細(xì)胞與相應(yīng)的以熒光素標(biāo)記的CD單克隆抗體作用（直接法），或與抗相應(yīng)CD單克隆抗體作用后，洗去游離的抗體，再加入熒光素標(biāo)記的抗小鼠IgG 抗血清（間接法），制片后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，計算陽性細(xì)胞占總計數(shù)細(xì)胞的百分率。（四） 流式細(xì)胞分析法：目前免疫細(xì)胞的檢測主要采用流式細(xì)胞術(shù)，結(jié)果客觀準(zhǔn)確，重復(fù)性好。二、淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志檢測的臨床意義淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志檢測是評價免疫功能的重要指標(biāo)。由于淋巴細(xì)胞，特別是T 淋巴細(xì)胞在執(zhí)行

12、免疫功能方面發(fā)揮多種作用，故有必要對各類淋巴細(xì)胞（淋巴細(xì)胞亞群）進(jìn)行分析。這中間主要是通過表面標(biāo)志識別進(jìn)行計數(shù)。在評價免疫功能時經(jīng)常采用CD4/CD8比值。 如 CD4是 HIV 受體， HIV 感染時 CD4/CD8比值明顯降低。 但CD4陽性細(xì)胞包括了很多功能性細(xì)胞，如TH、 Tr 等， CD8陽性細(xì)胞也是如此，所以單用CD4/CD8比值反映免疫功能顯然不夠準(zhǔn)確。除AIDS 患者外，實際觀察 CD4/CD8比值與患者的免疫功能及臨床癥狀的關(guān)系及意義有限。+CD4/CD8對 CD4和 CD8T 細(xì)胞的測定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)的監(jiān)測。升高常見于自身免疫性疾?。欢鳦

13、D4/CD8降低常見于病毒感染、惡性腫瘤和再生障礙性貧血等。外周血中單個核細(xì)胞包括A. 有核紅細(xì)胞B. 淋巴細(xì)胞C. 單核細(xì)胞D. 淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞E. 粒細(xì)胞正確答案 D答案解析外周血中單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。外周血單個核細(xì)胞的比重介于 1.075 1.030 1.035第 3 頁 1.090 1.098正確答案D答案解析外周血中單個核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的比重與紅細(xì)胞、多核白細(xì)胞及血小板不同，介于 1.075 1.090 之間。Ficoll密度梯度分層液主要用于分離外周血中的A. 粒細(xì)胞B. 單個核細(xì)胞C. 紅細(xì)胞D. 巨噬細(xì)胞E. 血小板正確答案B答案解析 Ficoll

14、 分離液為常規(guī)的淋巴細(xì)胞分離液，其比重為 1.077 ±0.002 ，主要用于分離外周血中單個核細(xì)胞。采用 Ficoll密度梯度分離液處理血液后，分離結(jié)果從上至下依次為A. 稀釋的血漿、粒細(xì)胞、單個核細(xì)胞、紅細(xì)胞B. 稀釋的血漿、紅細(xì)胞、單個核細(xì)胞、粒細(xì)胞C. 單個核細(xì)胞、稀釋的血漿、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞D. 稀釋的血漿、單個核細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞E. 稀釋的血漿、單個核細(xì)胞、紅細(xì)胞正確答案 D答案解析 Ficoll分離液為常規(guī)的淋巴細(xì)胞分離液，其比重為1.077 ±0.002 ，主要用于分離外周血中單個核細(xì)胞。其分布由上到下依次為：稀釋的血漿層、單個核細(xì)胞層、粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞層

15、。玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞指的是A.B 淋巴細(xì)胞B.T 淋巴細(xì)胞C. 紅細(xì)胞D. 粒細(xì)胞E. 單核細(xì)胞正確答案B答案解析玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞指的是T 淋巴細(xì)胞?？赏ㄟ^ ADCC介導(dǎo)細(xì)胞毒作用的細(xì)胞是A. 漿細(xì)胞B.CTLC.B 細(xì)胞D.NK細(xì)胞E. 肥大細(xì)胞正確答案D答案解析 CD16分子又稱為低親和性IgG Fc 受體，當(dāng)IgG 類抗體與靶細(xì)胞表面相應(yīng)抗原表位特異性第 4 頁結(jié)合后，可通過其Fc 段與 NK細(xì)胞表面 FcR 結(jié)合，行使針對靶細(xì)胞的定向非特異性殺傷作用，也即NK細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）。淋巴細(xì)胞活力檢測最常用的方法是A. 細(xì)胞培養(yǎng)B. 伊紅染色C. 臺盼藍(lán)染色D. 瑞氏染色E. 細(xì)胞計數(shù)正