人GM-CSF基因原核表達質粒的構建與表達

1、人gm-csf基因原核表達質粒的構建與表達景巧1邵輝2楊曉玲3(通訊作者)(1寧夏國龍醫(yī)院婦產科 寧夏銀川750004)(2寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院耳鼻喉科寧夏銀川750004)(3寧夏醫(yī)科大學病理牛理學系 寧夏銀川750004)【摘要】目的克隆編碼人粒巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)的重組原核 表達質粒，為進一步研究其功能提供依據。方法pcr擴增人gm-csf基因編碼序 列,定向克隆入融合蛋白原核表達載體pet32a+獲得重組表達質粒,轉化大腸桿菌 后用iptg進行誘導表達,pcr和western-blot鑒定表達產物。結果 重組質粒經 pcr、限制性內切酶及dna測序證實構建成功;且誘導后能

2、在大腸桿菌中穩(wěn)定表 達pet-gmcsf嵌合蛋白。結論 成功構建并表達了 pet-gmcsf蛋白，為進一步研 究gm-csf功能奠定基礎?！娟P鍵詞】gm-csf原核表達 構建【中圖分類號】r318【文獻標識碼】a【文章編號】2095-1752 (2014) 06-0158-02粒巨噬細胞集落刺激因 了(granulocyte macrophage colony-stimulating factor gm-csf)在造血調控和免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用1,2o克隆和純化人gm-csf對 進一步研究gm-csf在各個系統的功能具有重要的意義。木實驗利用基因工程技 術，構建重組hgm-csf原核表達載體

3、，并誘導其在大腸桿菌bl21 (de3)中表達，獲得 融合蛋白pet-gmcsf,為今后深入研究該蛋白的功能打下基礎。1.材料1.1菌株及質粒 大腸桿菌e.coli de3購自天根生物,porfhgmcsf質粒購自 invitrogen公司，原核表達質粒pet32a+為木室保存。1.2主要試劑 prime startm hs dna聚合酶、dntp、dna連接試劑盒是 takara公司產品;ecor i、hindlll及蛋白分了量標準購自晶美公司;0mega質粒提 取試劑盒、pcr產物冋收試劑盒及膠冋收試劑盒購自寶信生物;抗his單克隆抗體 購自天根生物;dab底物顯色試劑盒為北京中杉公司產品

4、;其余均為分析純。2力法2.1人gm-csf基因的pcr擴增 根據genbank中報告的人gm-csf的cds（登 錄號:m13207.1）設計引 物:pl:5’cggaattcatgtggctgcagagcctg3’, p2:5’ ccaagctt tcactcctggactggctc -3’,劃線部分是 ecor i 和 hindlll酶切位 點。以porf-hgmcsf質粒為模板，以pl和p2為引物,95°c預變性5分鐘,94°c變 性30秒,60°c復性45秒,72°

5、c延伸1分鐘,30個循環(huán),72°c延伸10分鐘，擴增 hgm-csf基因。取pcr產物進行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳,pcr產物冋收試劑盒冋收 目的基因gm-csfo2.2垂組表達質粒pet-gmcsf構建與鑒定 按照omega質粒提取說明書提取 和純化pet32a+質粒，將pet32a+和gm-csf基因分別用ecor i和hindlll雙酶切 后6°c連接4h,轉化宿主菌e.colide3o隨機挑取氨卞青霉素霉素抗性的陽性重組 子接種于5ml lb液體培養(yǎng)基中,37°c振搖過夜，提取質粒行pcr鑒定，另一方面用 ecor i和hindlll雙酶切消化，電泳檢測有

6、無插入片段及其大小，并將與預期大小相 符的重組質粒送invitrogen公司進行dna序列分析。2.3垂組蛋白的誘導表達挑取單克隆在加有氨卞青霉素霉素的液體lb培養(yǎng) 基中37°c220r/min振搖培養(yǎng)10h,加入終濃度為0.5mmol/l的iptg誘導56h, 分離培養(yǎng)液上清和沉淀，將菌體沉淀重懸于pbs緩沖液中（ph7.2）,超聲裂解并離心 分離上清和沉淀,sds-page電泳后轉膜,加入抗his單克隆抗體室溫2h,再加入hrp 標記的羊抗鼠igg進行western-blot分析。3 結果3.1gm-csf基因的擴增 用pcr法從porf-hgmcsf質粒獲得435bp的人 gm

7、-csf基因片段，與預期的gmcsf基因大小一致（見圖1）。圖1 gm-csf基因的擴增3.2重組質粒的鑒定以抗生素篩選陽性重組子提取質粒為模板行pcr擴增, 并用ecor 1、hindlll雙酶切后均證實有大小為435bp的目的片段插入pet32a+ 質粒，測序結果和genbank中人gm-csf基因完全匹配(100%),表明垂組質粒構建 成功(見圖2) o圖3融合蛋白petgm-csf的表達1：空質粒;2:重組質粒4.討論人gm-csf基因編碼144個氨基酸(約16.3kda )，其中信號肽為17個氨基酸構 成，是一種能夠刺激粒細胞、巨噬細胞形成集落的細胞因子，能在體外調控粒細胞、 單核/

8、巨噬細胞的分化、增殖和存活2,3o gm-csf通過調節(jié)抗原遞呈細胞(尤其是 樹突狀細胞)的數量和功能來增強機體的免疫應答水平。研究發(fā)現gm-csf可通過 增強特異性抗體應答和t細胞增殖加強dna疫苗的免疫效果，也可以通過激活巨 噬細胞并增強其殺傷活性/足進巨噬細胞分泌il2、ifn-γ細胞因子，增強 宿主的非特異性免疫應答,可作為免疫佐劑廣泛應用于免疫學領域。pet系統是e.coli中克隆表達重組蛋白功能最為強大的系統,被廣泛應用于 重組蛋白的表達和純化中，其優(yōu)點是遺傳背景清處、表達穩(wěn)定、操作簡便、含強 啟動子使蛋白表達高、易純化，而口 pet系統在插入目的dna后表達蛋

9、白的n末 端含6個分子量較小的組氨酸(his)標簽蛋白，不僅不改變目的蛋白的活性,且易于 純化。本研究用基因重組技術將人gm-csf基因克隆到大腸桿菌原核表達載體 pet32a+上,構建含gmcsf基因的原核表達質粒，并誘導其在人腸桿菌bl21(de3) 中表達，獲得融合蛋白pet-gmcsf,為今后深入研究該蛋白的功能提供依據。參考文獻1 dabritz j. granulocyte macrophage colony-stimulating factor and the in testi nal inn ate immune cell homeostasis in croh n!s dis

10、ease. am j physiolgastrointest liver physiol. 2014, 306(6): 455-652 annels ne, et al. the effects of gemcitabi ne and capecitabine combi nation chemotherapy and of low-dose adjuvant gm-csf on the levels of myeloid-derived suppressor cells in patients with advaneed pancreatic cancer.cancer immunol immunother. 2014, 63(2):175-83.3 sawada h, et al. reduced bmpr2 expressi on in duces gm-csf tra nslati on and macrophage recruitme nt in huma ns and mice to exacerbate pulm on ary hyperte nsion. j exp med. 2014, 211(2):263-80