獸藥大鼠傳統(tǒng)致畸試驗(yàn)指導(dǎo)原則

1、獸藥大鼠傳統(tǒng)致畸試驗(yàn)指導(dǎo)原則一、概述<-）定義與目的傳統(tǒng)致畸試驗(yàn)是通過(guò)觀察藥物對(duì)母體子宮內(nèi)的胚胎或胎兒產(chǎn)生的薛作用.包括外觀、內(nèi)臟和骨 骼陶形.對(duì)藥物的胚胎毎性進(jìn)行評(píng)價(jià)的一種方法.母體在孕期受到可通過(guò)胎盤屏障的菜種有宮物質(zhì) 作用，彩響胚胎的器官分化與發(fā)育，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和機(jī)能的缺陷，出現(xiàn)胎兒腐形.因此.在受孕動(dòng)物的 胖胎瑞床后.并已開始進(jìn)入細(xì)胞及器官分化期時(shí)給予受試藥物，可檢出受試藥物對(duì)胎兒的致崎作用"為了確保大鼠致購(gòu)試驗(yàn)結(jié)果的兵實(shí)性、可靠性和可追潮性，根據(jù)新藥研究的規(guī)律，結(jié)合國(guó)內(nèi) 轉(zhuǎn)藥竈理學(xué)評(píng)價(jià)的實(shí)際情況制定了本指導(dǎo)原則.（二）適用范圍本規(guī)程適用于獸用化學(xué)藥品、中善藥、消那劑及飼料

2、藥物添加刑的大段致鮒作用測(cè)定.二、試鯊設(shè)計(jì)（-）材料與方法1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇spf級(jí)健廉性成熟（90lood）大風(fēng).未交配過(guò)的靑年雌取8090只，俺就減半.2. 藥品和試劑（1）受試物（2）陽(yáng)性對(duì)照物可選用敵枯雙nn 甲撐雙（2氨基-134囉二哇）.matda）,要求分析純以上，含廈不低于 98j%給藥劑董為0.51.0mg/kg體重.經(jīng)口給予.另外陽(yáng)性對(duì)照物還可選用五氯酚鈉（30mg/kg體重）、阿斯匹林（250300mg/kg體乘）及維生 素a （7513mg/kg體霾）等.（3）試刊：甲莊、冰乙戰(zhàn)、2. 4, 6三硝基粉、氫氧化鉀、甘油、水合氯醉、茜泰紅（4）其他試液茜素紅上備液冰乙5.

3、0ml,甘油lo.oml. 1%水合篡醛60.0ml配成混合液，取適量茜我紅邊加邊復(fù)拌，直 至飽和為止.置櫬色瓶中保存.齒素紅應(yīng)用液取曲素紅貯備液iml,加1%氫氧化鉀溶液稀釋至loooml,置棕色瓶中臨用時(shí)配制透明液a甘油20ml2%氫氧化鉀溶液3ml,加蒸憎水至100ml混合.透明液b甘油50ml, 2%氫氧化鉀溶液3ml,加蒸ts水至100ml混合.固定液（boui血液）2.4,6-三硝基酚（苦味酸飽和液75份、甲醛20份、冰乙酸5份混合.3. 儀器設(shè)備生物顯微鏡及體視顯微鏡游標(biāo)卡尺（百分尺實(shí)臉空梵它常用設(shè)備（二）試驗(yàn)步驟1. 劑組設(shè)計(jì)役3-5個(gè)試驗(yàn)組.另外設(shè)一個(gè)陰性（溶劑）對(duì)照姐和一個(gè)

4、陽(yáng)性對(duì)照組.試驗(yàn)組高劑量原測(cè)上應(yīng) 便部分孕斂（和/或胎效）出現(xiàn)毒性作用，如體重域輕帛 低劑星不應(yīng)引起基性作用，各組可采用1/4、 1/16、1 / wldw等劑jt急性毒性試驗(yàn)給予動(dòng)物受試藥物量大劑量（量大使用濃度和最大淞胃容量） 無(wú)死亡時(shí).以30天唱養(yǎng)試驗(yàn)的繪大未觀察到有害作月劑量為高劑fit以下設(shè)24個(gè)劑5l毎組至少 保證】2只孕肌2. 受孕臥檢責(zé)性成熟雌、掛大取按1:1 （或2:1）同寵后，母日早晨觀察陰栓（或陰道涂片），以査出陰栓（或 從陰道涂片中觀察到梢子）確認(rèn)雌啟己交配，將該堆竄作為試驗(yàn)用就，并以當(dāng)日作為“受孕"零天連續(xù)將雌、雄大帆進(jìn)行同籠交配.反復(fù)檢査雌亂的受精情況，宜

5、到檢岀的“受巒6t數(shù)足以進(jìn)廳 試驗(yàn)，如集5天內(nèi)筠未交配，則更換堆孔動(dòng)物交配以空溫20-25x?為宜.環(huán)墳應(yīng)安孰必耍時(shí)蟻 以麥芽、蛋桂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。3. 試驗(yàn)動(dòng)物稱重、標(biāo)記編號(hào)和分組不斷將同一天檢杳確認(rèn)的“受穩(wěn)亂”進(jìn)廳稱重、標(biāo)記編號(hào)，采用完全隨機(jī)法分組直到各組“受粘 歐'達(dá)12只以上.4. 致突變陽(yáng)性對(duì)照物及受試藥物溶液配制（1）陽(yáng)性對(duì)照物z確龍陽(yáng)性對(duì)照物種類及其給于刑量（參見“（一）2. （1） ”）按0.51.0ml/100g體貳給予大鼠 受試藥物灌胃容童，計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照物溶液帝配制的濃度.擬定需配制的體枳，計(jì)算配制溶液時(shí)需稱 取陽(yáng)性刈照物的量.（2）受試藥物配制根據(jù)受試藥物理化性質(zhì)，選

6、定港劑，將受試藥物配制成水溶淞（或乳化劑、浪懸液、糊狀軟等） 必要時(shí)加入增涪劑或助懸劑（如吐隘80、淀粉、竣甲基纖維素鈉等）各劑量組受試藥物溶液可采用倍比稀釋法配制根據(jù)設(shè)計(jì)的受試藥物刑園，按大取灌胃容it耍 求，確定高劑量徂（即第i劑n組）受試藥物溶液希配制的濃度以及各劑楚組所需受試藥物溶液體積， 再擬定第1劑尼組受試藥物初始溶液希配制的體積，計(jì)算雋稱取/豪取受試藥物的風(fēng)5. 給藥方案采用經(jīng)口港胃給藥.從受孕的第7天第16天，1次/d,連續(xù)10d分別在受孕的第0日、第7日、第12日、第16日及第20日對(duì)孕鼠進(jìn)行稱重，按大鼠潅胃容址耍求， 調(diào)整各時(shí)段受試藥物涪液酒胃盤。6. 臨床觀察在試驗(yàn)期問(wèn)險(xiǎn)

7、査記錄妊娠大貳的攝食、飲水及第玄情況觀察妊娠大fit的一般行為衰現(xiàn)、中潯 及死亡情況.7. 孕取的處死及檢査于奸嫌笫20天稱取孕肌體更斷頭處死孕鼠，剖股取出卵巢、子言，檢査黃體數(shù)、吸收胎數(shù)、 死胎數(shù)、活胎數(shù)，活胎取雌雄比，胎載在子宮內(nèi)位置，稱取卵與貳、子宮連胎k血（包括羊水）、子宮政等.&活胎載檢査測(cè)活胎鼠的休:.體長(zhǎng).更長(zhǎng).檢連活胎凱外觀喊形.胎亂體農(nóng)檢査項(xiàng)目見表19.胎骨標(biāo)本制作與檢查（1）胎骨標(biāo)本制作將毎寰一半的活胎放入95%乙醉屮固定23周.取出胎歐流水沖洗數(shù)分鐘后放入2經(jīng)氫氣化鉀 洛液內(nèi)（至少5倍于胎載體積）透明872h,然后放入凸素紅應(yīng)用液中染色648h,并輕搖12次/山直

8、至頭骨染紅再取出胎k.放入透明液a中12d.放入透明液b中23d.待雪骼紅染而牧 組織基本鐲色即可.表1致畸試驗(yàn)活胎61體表檢査項(xiàng)目頭部軀干部四肢無(wú)腦癥腳骨裂多肢腦膨出陶林裂頭蓋裂脊椎裂短肢腦枳水脊椎侵1彎半肢小頭癥脊推后彎多捋顏面裂臍疝無(wú)指小眼癥床遭下裂并指眼球突出無(wú)肛門短指無(wú)耳癥砸尾、卷尾 >小耳癥無(wú)尾耳低位腔裂無(wú)穎癥小頻癥下頻裂口唇裂（2）胎骨標(biāo)本檢査：將胎仔標(biāo)本取出放入小平u1中.用透射光源，在體視顯做鏡下作療體觀蔡，然后逐步檢査骨昭 （見茨2測(cè)頭頂間什及后頭卄缺損悄況，於后檢春腸骨的數(shù)目、缺失或融合（胸什為6個(gè).# 化不充全時(shí)片先缺第5厲骨、次快;r 2膺骨兒檢直助骨（肋肯適常

9、為1213對(duì)，常見崎形有融合助、 分叉肋、波狀肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨中斷尊），檢査弁柱發(fā)耳和椎體數(shù)目（頸椎7個(gè)，胸椎12 13個(gè)，3?椎56個(gè)，詆椎4個(gè)，庫(kù)椎35個(gè)）以及椎骨詢無(wú)愍合、縱裂等.最后檢査四肢常農(nóng)2致崎試驗(yàn)胎mji骼檢査項(xiàng)目枕骨借化中心.發(fā)育不全數(shù)目、黴合、縱裂、冊(cè)分裂開、骨化中心數(shù)、發(fā)耳不全、縮窄、脫離、形狀弓克目、骨化中心數(shù)、形狀異常、融合、裂開、縮窄、脫離四肢骨形狀、數(shù)目魂骨件化中心敷拿骨形狀tt#形狀肋骨數(shù)目.形狀、融合、分叉.缺損、發(fā)育不全w# 形狀、完全缺損、胸骨節(jié)融合、裂開、形狀異常、發(fā)育不全10胎服頭£、內(nèi)臟檢査禪每寞的另一半胎隊(duì)放入buins液中.固

10、定兩周后作內(nèi)虹險(xiǎn)査（見喪3）先用自來(lái)水沖上固定 沒，將缺仰放在石蠟板上，剪去四肢和崑，用刀片從頭部到尾部逐段檄切或縱切.按觀察不同部位 新面器官的大小.形狀和相對(duì)位賈.正常切面見下圖.經(jīng)口從舌與兩口角向枕部橫切（切面1，可觀蔡大腦、間腦、正腦、舌及發(fā)裂在眼滸血作垂 直縱切（切面2）、可觀瑕鼻部.從頭部垂直通過(guò)眼球中央作縱切（切面3）和沿頭部聶大橫位處穿 過(guò)腦作切面（切面4）,該兩切面可觀察舌裂、雙義舌、額裂、眼球歸形、鼻諭形、腦和裁室異常 沿下顎水平通過(guò)頸部中部作橫切面（切面5九可觀察氣訝、禽訝和延腦詼脊19然后自腹中線剪開胸、腹腔，依次檢玄心、肺、橫諏、肝、胃、腸等臟器的大小、位置，檢 査左

11、半將其摘除，再檢査腎臟、輸尿聳、膀胱、亍宮或窣丸位置及發(fā)育情況.燃后將疔臟切開，觀 察有無(wú)腎盂枳水與擴(kuò)大.聶3致畸試驗(yàn)胎馭內(nèi)臟檢査項(xiàng)目mt（w«）sb凌郁眼球發(fā)宵不全側(cè)腦室擴(kuò)張第三筋室擴(kuò)張無(wú)腦癥無(wú)眼球底小bs球癥角膜缺損右位心房中陽(yáng)w拐主動(dòng)脈弓伏道閉慣無(wú)肺癥多和箜帥葉融令m疝氣內(nèi)狂妊異位肝分葉斤常 腎上腿缺夫多馬失失失位失不 缺尿w畀統(tǒng)ff k丸ak宮發(fā) 勝睪卵卵子宮號(hào)積水腎軼失輸卵管枳水（三）試驗(yàn)結(jié)果整理及敷據(jù)分析1. 受試藥物對(duì)妊娠大駅的一般行為表現(xiàn)、中壽及死亡情況的影響2. 受試藥物對(duì)妊娠大鼠攝食、伙水及增轉(zhuǎn)的響3受試藥物對(duì)大取生殖機(jī)能的影響異常心胱異常肺臟異常肝異常腎、踴胱異

12、 常生建器育異 常其它內(nèi)腑畸形平 均數(shù)內(nèi)臟畸形平均數(shù)=內(nèi)臟疇形總數(shù)曲査胎區(qū)數(shù)）7 數(shù)據(jù)分析各種率的統(tǒng)計(jì)用疋檢驗(yàn).孕凰增直用力建分析或屮:魯數(shù)統(tǒng)計(jì)，胎限身長(zhǎng)、體乘、平均活胎數(shù)、 子音連胎重割用t檢驗(yàn).結(jié)果能得出受試藥物是否有母體壽性和胚胎得性、致崎性，最好能得出最 小致越劑量為比較不同有害物質(zhì)的致鬧強(qiáng)度，可計(jì)算致酹指數(shù)：致畸指數(shù)二*im.ld50最小或畸劑債(1)，為衰示有害物質(zhì)在伙品中存在時(shí)人體受害幾率.可計(jì)算致酚危害指數(shù):致崎危皆抬松:茫最大可能攝入董（四）結(jié)果評(píng)價(jià)判定標(biāo)準(zhǔn)：致腐指數(shù)v10為不致畸；10s致畸指數(shù)0100為致畸：致畸指致a100為強(qiáng)致畸致崎危害指數(shù)300表明受試藥物對(duì)人危害??；1005致畸危害指數(shù)s300表明受試藥物對(duì)人危害中等；致畸危害指數(shù)v100表明受試藥物對(duì)人危害大（五）注就事項(xiàng)1除特別注明外.試驗(yàn)用水為蒸熠水，試劑為分析純?cè)噭瑒?dòng)物為spf實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2. 實(shí)臉動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境要求達(dá)到spf級(jí).3. 有的吸收胎僅有若床腺附著于子宮系膜上，呈黃白色小結(jié)節(jié)狀，觀察時(shí)要認(rèn)丸辨認(rèn)4打開腸腹腔檢査偽臟時(shí).耍避免刀片切入過(guò)深或剝離過(guò)竄的情況以免適成臟弱移位的損傷.5. 當(dāng)試臉組大亂的受孕率較對(duì)照組明顯為低時(shí)，應(yīng)考總至受試藥物引起胚胎早期死亡、流產(chǎn)、 機(jī)化的可能性.三、試驗(yàn)報(bào)吿為公正、科學(xué)地評(píng)價(jià)藥物的待殊焉性，對(duì)試驗(yàn)報(bào)吿內(nèi)容做如下耍