免疫測定方法學和臨床應用教材

1、1免疫測定方法學臨床應用 2l免疫分析技術簡介l乙肝病毒標志物定性、定量檢測常見問題l抗HCV檢測問題lANA.ENA檢測問題lTP-Ab檢測問題lTB-Ab檢測問題免疫測定方法學臨床應用3l早期的免疫分析技術早期的免疫分析技術: 免疫擴散、免疫電泳、直接及間接血凝、被動血凝、補體結合實驗l特點:這些檢測方法成本低、結果易于判斷、技術上便于掌握,但不便于免疫檢測自動化 l后來的免疫分析技術后來的免疫分析技術: 放射性核素標記、熒光免疫標記、酶免疫標記、稀土元素標記及化學發(fā)光分子標記l特點:快速、靈敏、特異、易于測定等實驗室的免疫檢測自動化奠定了基礎 4 待測物質(zhì)濃度與檢測手段待測物質(zhì)濃度與檢測

2、手段 臨床化學分析臨床化學分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLm mg/mLmg/mLg/L免疫分析免疫分析Therapeutic DrugsThyroid HormoneFertility HormoneAllergyCancer MarkersInfectious DiseaseVitaminsSerum Proteins免疫分析技術5l1959 美國Yalow & Bersonl1960 英國 Ekimsl1977 獲諾貝爾醫(yī)學生物學獎醫(yī)學生物學超微量分析的里程碑免疫分析技術6lR：放射性核素示蹤高靈敏不直接探測待測物，而探測待測物上的標記信號 (標

3、記物的放大效應)RIAI：免疫學反應高特異廢除以往沿用的無機或有機試劑，代之以抗體為結合劑免疫分析技術7l半衰期短，限制了藥盒使用壽命l由于標記物的不斷變化，帶來藥盒批間、批內(nèi)較大的差異，標準曲線無法保存?zhèn)溆胠反應時間過長(數(shù)小時至過夜)l結果測量依靠時間累計，至少每一樣品一分鐘其主要的缺陷是：理論和實踐證明其分析的限度是10-7分子/mL或10-12 g/mL，要再提高有困難以上原因都造成放射免疫無法進行自動化分析免疫分析技術8放免其必然受到一代新的更靈敏、穩(wěn)定、快速，而且全自動化的測量技術的挑戰(zhàn)。從90年代開始放免分析在國際上每年以 1015% 的速度下降，這是事實。一些大型的實驗室，標本

4、量大的項目都已逐步應用各種非放免標記的自動化設備來進行分析，這是技術發(fā)展的必然規(guī)律。免疫分析技術9標記標記 名稱名稱 縮寫縮寫 儀器儀器 放射免疫 RIA -計數(shù)器 放射性核素 免疫放射度量分析 IRMA -計數(shù)器 免疫發(fā)色 ELISA ES-300、SR-1、Dimension 免疫熒光 EIFA IMX、AxSYM、 VIDAS 酶 免疫發(fā)光 EILA ACCESS、Amerlite、 Immulite、MAGIA 熒光偏振免疫 FPIA TDX、AxSYM 熒光 時間分辨熒光 DELFIA Wallac Arcus 1235 Cyber Fluor 615 發(fā)光免疫 LIA ACS-18

5、0SE 發(fā)光 電化學發(fā)光免疫 ECL Elecsys 免疫分析技術10一、消除手工操作的誤差一、消除手工操作的誤差二、靈敏度高、穩(wěn)定性好二、靈敏度高、穩(wěn)定性好三、速度快三、速度快四、當天四、當天/隔天報告隔天報告 實現(xiàn)短時間反饋實現(xiàn)短時間反饋提高臨床診斷效率和質(zhì)量，有效降低總醫(yī)療費用提高臨床診斷效率和質(zhì)量，有效降低總醫(yī)療費用免疫分析技術11l乙肝的診斷主要以實驗室檢測乙肝表面抗原乙肝的診斷主要以實驗室檢測乙肝表面抗原（Hepatitis B Surface antigen , HBsAg ）為主，）為主，檢測方法主要有酶免疫法、反向間接血凝法、檢測方法主要有酶免疫法、反向間接血凝法、放免法、化

6、學發(fā)光法、免疫熒光法等，目前應放免法、化學發(fā)光法、免疫熒光法等，目前應用較廣、較普及的是酶免疫一步法和化學發(fā)光用較廣、較普及的是酶免疫一步法和化學發(fā)光定量法。定量法。lHBsAgHBsAg 的酶免疫檢驗方法根據(jù)反應模式可分為的酶免疫檢驗方法根據(jù)反應模式可分為“一步法一步法”和和“兩步法兩步法”兩種方法。兩種方法?！耙徊椒ㄒ徊椒ā笔菍⒋郎y樣品和酶標記抗體同時加人到反應孔是將待測樣品和酶標記抗體同時加人到反應孔中進行反應，從而達到快速的目的，一步法中進行反應，從而達到快速的目的，一步法”存在產(chǎn)生存在產(chǎn)生“前帶現(xiàn)象前帶現(xiàn)象”的可能的可能 。12l定性測定常以定性測定常以“有有”或或“無無”也即也即“

7、陽性陽性”或或“陰性陰性”來表達測定結果；半定量測定雖介于來表達測定結果；半定量測定雖介于定性和定量之間，但從嚴格意義上來說，其仍定性和定量之間，但從嚴格意義上來說，其仍屬于定性測定，只不過其對定性測定中的屬于定性測定，只不過其對定性測定中的“陽陽性性”作了進一步的分級，即所謂的強陽性作了進一步的分級，即所謂的強陽性陽陽性性弱陽性的區(qū)別弱陽性的區(qū)別l定量測定的結果則以濃度（定量測定的結果則以濃度（如如IU/L、ug/L等等的方式表達的方式表達。乙肝病毒標志物13l定性測定結果確定的依據(jù)在于陽性定性測定結果確定的依據(jù)在于陽性陰性判定值陰性判定值（Cut-off）的建立，）的建立， Cut-off

8、 值的確立應盡可值的確立應盡可能地避免假陽性或假陰性結果的出現(xiàn)。因此衛(wèi)能地避免假陽性或假陰性結果的出現(xiàn)。因此衛(wèi)生部臨床檢驗中心也在應用生部臨床檢驗中心也在應用Cut-off 值時引用值時引用了灰區(qū)概念以解決定性測定結果的可疑陽性問了灰區(qū)概念以解決定性測定結果的可疑陽性問題。題。 乙肝病毒標志物14乙肝病毒標志物15l重復測定：同樣方法復做一次l確認試驗：中和試驗：HBsAg 重組免印跡（RIBA）：HCV-Ab 蛋白印跡（WB）: HIV-Abl結合臨床或跟蹤隨訪乙肝病毒標志物16l系列濃度標準品測得的系列濃度標準品測得的劑量反應曲線劑量反應曲線，即通常，即通常所謂的標準曲線。所謂的標準曲線。

9、l由于定量酶免疫測定中的劑量反應曲線與生化由于定量酶免疫測定中的劑量反應曲線與生化測定中的標準曲線相比，一般均為非線性的，測定中的標準曲線相比，一般均為非線性的，變異較大，故不宜稱為標準曲線。變異較大，故不宜稱為標準曲線。l不同的數(shù)學模式可用來改善上述劑量反應曲線不同的數(shù)學模式可用來改善上述劑量反應曲線繪制的精密度，從而能以較少的數(shù)據(jù)和計算獲繪制的精密度，從而能以較少的數(shù)據(jù)和計算獲得較為準確的結果得較為準確的結果乙肝病毒標志物17定性測定 定量測定結果報告結果判定測定方法的變異系數(shù)（CV%）臨床意義陽性/陰性臨界值 Cutoff（CO）CO 陽性CO 陰性1520診斷濃度：g/L (ng/mL

10、) U/L (mU/mL)根據(jù)標準品計算7%診斷、病情、治療監(jiān)測乙肝病毒標志物18l檢測靈敏度檢測靈敏度ElecsysElecsys HBsAg:0.09ng/ml HBsAg:0.09ng/ml對酶免法對酶免法(0.550ng/ml)(0.550ng/ml)，因此酶免法有較高的陽性漏檢率，尤其對于早期患者；因此酶免法有較高的陽性漏檢率，尤其對于早期患者； Elecsys HBsAgElecsys HBsAg不存在灰區(qū)，減少重測，結果更可靠。不存在灰區(qū)，減少重測，結果更可靠。l結果的精密度結果的精密度 5% CV5% CV值與值與20% CV20% CV值的差別值的差別, , 酶免法結果可靠性

11、差。酶免法結果可靠性差。l出結果時間出結果時間 來樣本即檢測出結果來樣本即檢測出結果(18(18分鐘分鐘-27-27分鐘分鐘) )與集中標本檢與集中標本檢測后出結果（測后出結果（3434小時）報告的分別。小時）報告的分別。l酶免法與國際標準值未接軌酶免法與國際標準值未接軌乙肝病毒標志物19l丙型肝炎(Hepatitis C，HC)是丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)引起的世界范圍內(nèi)流行、且嚴重危害人們身心健康的傳染病之一, 尤其在亞洲、非洲等一些發(fā)展中國家,流行率、發(fā)病率均較高。 臨床特點臨床特點：感染者中感染者中50-8550-85發(fā)展成慢性或持續(xù)感發(fā)展成慢性或持續(xù)感

12、 染、進而部分發(fā)展成肝硬化和肝癌。染、進而部分發(fā)展成肝硬化和肝癌。 因此，早期診斷仍是防止傳播的有效手段。因此，早期診斷仍是防止傳播的有效手段。20丙肝病毒抗體21丙肝病毒抗體221. 酶聯(lián)免疫吸附實驗2. 凝集實驗3. 放射免疫實驗4. 快速檢測技術5. 其它檢測技術：免疫熒光、化學發(fā)光等6. 補充/確認實驗:重組免疫印跡 (RIBA) 丙肝病毒抗體23 檢測原理：利用固定在固相載體上的HCV重組表達和/或人工合成多肽抗原捕捉待測樣品中的抗-HCV IgG,然后,通過加入酶(如HRP、ALP等)標記的抗-人IgG檢測所捕捉到的特異性抗-HCV IgG。丙肝病毒抗體24HCV不能體外培養(yǎng),大量

13、HCV天然抗原幾乎得不到.目前主要用基因工程表達和多肽合成方法得到。用什么區(qū)段的丙肝病毒抗原蛋白？如何選擇各種抗原合適的比例？是保證HCV試劑測出樣品中所有的抗-HCV抗體的關鍵。包被抗原的選擇包被抗原的選擇丙肝病毒抗體25抗體抗體臨床意義臨床意義CHCV感染后出現(xiàn)較早感染后出現(xiàn)較早,陽性率也很高陽性率也很高,在抗在抗-HCV檢測中檢測中發(fā)揮重要作用發(fā)揮重要作用NS3抗原的免疫原性很強抗原的免疫原性很強,相應的抗體滴度也很高相應的抗體滴度也很高,HCV感感染后出現(xiàn)很早染后出現(xiàn)很早,同同C區(qū)抗體一樣在抗區(qū)抗體一樣在抗-HCV的檢測中發(fā)的檢測中發(fā)揮重要作用揮重要作用NS4 HCV感染后出現(xiàn)延遲感染

14、后出現(xiàn)延遲,持續(xù)陽性可能與慢性化有關持續(xù)陽性可能與慢性化有關NS5HCV感染后出現(xiàn)較早感染后出現(xiàn)較早,可用于急性期感染的診斷可用于急性期感染的診斷HCV各片段抗體檢出的臨床意義各片段抗體檢出的臨床意義丙肝病毒抗體26cDNA克隆5-1-1：1989年5月,美國Chiron公司分離到一個能表達NANB肝炎病毒特異性蛋白的cDNA克隆5-1-1。C100-3：又將3個與5-1-1有共同的重疊克隆連接起來建立了另一個克隆C100(部分NS3和NS4區(qū)重組表達抗原)； HCV C100-3抗體檢測系統(tǒng),是最早的檢測方法.丙肝病毒抗體27 主要缺陷是：靈敏度低,漏檢率較高：C100只含363個氨基酸,只

15、代表整個HCV抗原抗體系統(tǒng)的一小部分；抗體檢出時間較晚：不適于早期診斷。非特異性反應較高：使用的抗原含SOD融合蛋白,因此,當人體存有抗-SOD時常常出現(xiàn)假陽性。丙肝病毒抗體28第二代抗第二代抗-HCV檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)C區(qū)區(qū)較較E E區(qū)和某些非結構區(qū)蛋白都保守區(qū)和某些非結構區(qū)蛋白都保守, ,用用C C區(qū)基區(qū)基因產(chǎn)物檢測因產(chǎn)物檢測HCVHCV抗體顯得更加合理抗體顯得更加合理; ;第二代試劑除上述第二代試劑除上述C C100100抗原外又抗原外又加上了加上了HCV核心核心區(qū)區(qū)多肽多肽C C22-322-3和非結構區(qū)抗原和非結構區(qū)抗原C C33C33C。較第一代試劑較第一代試劑檢出率提高檢出率提高2

16、5-30%,抗體出現(xiàn)提抗體出現(xiàn)提早到早到16-60天。天。丙肝病毒抗體29 不足：由于重組基因多肽抗原中仍有SOD多肽,所以仍存在抗-SOD造成的假陽性問題,于是激發(fā)人們建立人工合成肽段檢測抗-HCV的新試劑。 丙肝病毒抗體30核心區(qū)抗原比例相對下降,而相應也增加了NS3區(qū)C33C的比例,優(yōu)化了試劑盒的組裝工藝；利用現(xiàn)代基因重組技術,對一些重要抗原采用更好的表達、純化系統(tǒng),利用先進的生產(chǎn)工藝、使包被抗原的活性更強,增加了檢測的靈敏度,減少了非特異性反應；加入了NS5區(qū)抗原。丙肝病毒抗體31目前我國多采用第三代抗-HCV ELISA試劑,其敏感性超過99%,雖然目前缺乏判斷其敏感性的金標準,但對

17、于免疫功能正常的HCV RNA陽性感染者,抗-HCV檢出率也高于99%。 丙肝病毒抗體32 檢測原理：以待測血清中的HCV抗體和分別固定在硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、尼龍膜等載體上的不同HCV抗原之間的特異性結合反應為基礎,測定待測樣品中抗-HCV的存在和有無。丙肝病毒抗體33因為HCV的各種抗原分別被單獨固化在載體的不同位置上,因此,該項檢測可以區(qū)分待測樣品對HCV不同抗原的不同反應。目前RIBA HCV已經(jīng)得到FDA的認可,成為抗-HCV確認的標準。臨床意義：RIBA陽性的患者中75-80%為病毒血癥(HCV RNA);RIBA陽性而血清中沒有HCV RNA時提示可能為既往感染。丙肝病毒抗

18、體34 實時熒光監(jiān)測實時熒光監(jiān)測PCR檢測原理：檢測原理：在在PCRPCR擴增反應管內(nèi)加入了標記有兩種擴增反應管內(nèi)加入了標記有兩種染料的針對靶序列的探針染料的針對靶序列的探針, ,每當一次擴增反應中一每當一次擴增反應中一條探針與靶序列退火結合后條探針與靶序列退火結合后, ,整個反應體系就會增整個反應體系就會增加一個單位的熒光加一個單位的熒光. .從而得出每一次擴增循環(huán)結束從而得出每一次擴增循環(huán)結束后產(chǎn)物的量后產(chǎn)物的量. .丙肝病毒抗體35 臨床意義：特異性強：抗-HCV陽性并不能代表現(xiàn)癥感染,丙型肝炎的診斷標準是HCV-RNA.敏感性高：可發(fā)現(xiàn)抗-HCV陰性者HCV感染.陽性出現(xiàn)早：在“窗口期

19、”沒有抗-HCV產(chǎn)生,但可檢測出RNA. 可指導用藥：為療效觀察及預后判斷提供指標.丙肝病毒抗體36 與HBV DNA相比，HCV RNA檢測更為復雜和困難,檢出率低:血清中病毒含量低,且有一定波動,呈間歇陽性;易被RNA酶降解;HCV RNA受進食的影響,HCV易與血中脂質(zhì)及脂蛋白結合,致使其檢出率降低;二次PCR,其中任何步驟的問題均易影響其檢出。丙肝病毒抗體37任芙蓉,等. 中華肝臟病雜志, 2005,13:255-258丙肝病毒抗體38*以S/Co 3.8 (OCD HCV ELISA 3.0) 或 8.0 (OCD VITROS ECi/ECiQ HCV)為“界值”。丙肝病毒抗體39

20、l目前臨床應用檢測自身抗體的主要免疫學試驗技術種類有：間接免疫熒光法（indirect immune fluorescence, IIF）、直接免疫熒光法(IF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫印跡技術、乳膠顆粒凝集、免疫擴散、免疫電泳、放射免疫檢驗和酶免疫細胞化學等。其中，IIF法、免疫印跡法和ELISA法被廣泛用于臨床檢測直接抗細胞成份和可溶性細胞成份抗體的檢測。有時為了彌補試驗技術或試劑中可能存在的缺陷以及試驗條件的影響，提高試驗結果的特異性和敏感性，也用一種方法檢測多種自身抗體，或一種自身抗體用多種試驗方法檢測 。40ANA.ENA-Abs41實驗原理 將膜條上平行包被數(shù)種純化的

21、、已鑒定生化特性的抗原線作為固相。象固定生物薄片一樣將膜條固定在載片的反應區(qū)。 若是陽性，已稀釋血清中的特異性抗體將與固相上的抗原結合。 第二步，堿性磷酸酶(AP)標記的抗人抗體與已結合的抗體反應。 第三步，加入可產(chǎn)生顏色反應的色原底物溶液溫育。若標本中含有待測的特異性抗體，相應的抗原條帶將呈現(xiàn)較深的顏色。ANA.ENA-Abs42結果判斷簡單，可靠 不需特殊儀器，肉眼判斷結果 由于把抗原包被在固定的位置判斷實驗結果比免疫印跡法簡單，更適合常規(guī)檢測 反應區(qū)的質(zhì)控帶呈顯較深的顏色反應說明操作正確。 陰陽性結果差別明顯。條帶顯色的深淺與抗體滴度相關。 抗原經(jīng)親和層析分離純化。膜條上沒有多余蛋白，不

22、會產(chǎn)生非特異性反應。 反應過的載片可長期保存，試驗結果容易存檔。ANA.ENA-Abs43ENA多肽抗體譜（免疫印跡法）ANA.ENA-Abs44l (1)同一批號NC膜與同一批號標準帶相比：了解了NC膜制備可知只有同一批號才有比較價值，因在一次電泳中各種ENA抗原泳動位置相同，不同批號時因每每電泳條件不可能完全一致而沒有可比性；電泳中蛋白質(zhì)遷移率衡定，各種蛋白質(zhì)先后順序衡定，但各蛋白質(zhì)之間距離(mm)因每次電泳條件不同而有變化。l (2)標本膜條“O”線與標準帶“O”線對齊：有時病人血中僅含有一種單抗原區(qū)帶顯色的ENA抗體甚或一種非特異顯色區(qū)帶，如果沒有將“O”線對齊，12mm的偏差就會誤判為另一種ENA抗體或誤為非特異顯色而報出錯誤的報告。 ANA.ENA-Abs45l理論上同一分子量的蛋白質(zhì)在一次電泳中泳動速度是一致的，從“O”線至電泳位置的距離是一樣的；實際上，