降血壓肽ACE抑制活性及降壓功能研究

1、降血壓肽ace抑制活性及降壓功能研究【摘要】探討了 ace抑制活性的檢測方法，并以貽貝 為原料制取降血壓肽，研究了不同酶解條件對其ace抑制活 性的影響，然后利用shr飼喂試驗檢測其降血壓活性。結(jié)果 表明，降血壓肽有較好的ace抑制活性：其ace抑制率可達(dá)。 同時動物試驗表明其降壓效果明顯，在shr飼喂后26h之 內(nèi)均有顯著降壓效果，平均降低為1628mmhg o【關(guān)鍵詞】降血壓肽血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性降血 壓abstrac t】 the test in gmethodoface inhib ito ryactivitieswasstudied,andth eantihyperte nsiv

2、epeptideswerederivedfrommytiluse oruscus,then theaceinhibitoryactivitieswerestudie dondifferent conditions；theantihypertensiveeffect sweretestedb yshr-feedingmethod. theresultswereasf ollows：theantihypertensivepeptidehadstrongaceinhibitoryactivities,theaceinhibitoryratiowas%,andtheantihypertensiveef

3、fectwasobviousin2to6hours,theaveragereducedbreadthis1628mmhg.【keywords 】 an tihypertensi vepeptide ； angiotensin-convertingenzymeinhibitory降血壓肽實質(zhì)是一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，它通過 抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，阻礙有升高血壓作用的血管緊張素 ii的生成，同時抑制具有降血壓作用的血管舒緩激肽的分解, 從而使血壓下降，此即降血壓肽的作用機理lo近年來國際學(xué)術(shù)界對降血壓肽的研究較多，已報道有以 牛奶、乳酪、大豆、魚肉、蔬菜、小麥蛋白等食物為原料， 經(jīng)蛋白酶酶解產(chǎn)

4、生了具有較好ace抑制活性的降血壓肽2 7。eiji等8水解了 12種食物蛋白進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，從 魚肉、蝦、蟹等水產(chǎn)動物蛋白中制得的降血壓肽其降壓活性 優(yōu)于其他食物性蛋白。我國在降血壓肽領(lǐng)域的研究起步相對 較晚，現(xiàn)有報道以大豆、蛇毒、老酒、茶葉為原料，對降血 壓肽的制備工藝和活性基團(tuán)等方面進(jìn)行了 一定研究913； 對于最適合用于降血壓肽制備的水產(chǎn)動物蛋白的開發(fā)研究， 則鮮有報道。貽貝，又名海紅、淡菜，近年來人工養(yǎng)殖取得重大成功， 在我國東南沿海產(chǎn)量豐富。但由于加工手段和技術(shù)的落后， 在收獲季節(jié)產(chǎn)出的大量貽貝因得不到及時處理而造成極大 浪費14。本研究以貽貝為原料，經(jīng)酶解、活性修飾等方 法制取降

5、血壓肽，然后利用shr飼喂試驗檢測其降血壓活性， 并分析了其相對分子質(zhì)量分布和氨基酸組成，以期為貽貝酶 解降血壓肽的開發(fā)提供理論探索。1材料與方法材料與設(shè)備 貽貝：市售°ace標(biāo)準(zhǔn)樣品：sigma試劑。 復(fù)合生物酶p1,其組分均購自上海生物化學(xué)試劑公司。降血 壓肽制備所需其他試劑，均為生化純，上海生物化學(xué)試劑公 司提供。降壓功能試驗用動物：shr,上海高血壓研究所提 供。儀器設(shè)備：hp lc,大鼠血壓儀及常用試驗儀器若干。實驗步驟ace活性抑制檢測方法研究 酶解降血壓肽對ac e的抑 制活性分析原理為：ace與hhl作用會生成hippuricacid , 當(dāng)hhl的量一定時，h ip

6、puricacid的生成量與ace的活性 呈線性關(guān)系，而由于酶解降血壓肽的作用，會抑制ace的活 性，從而使反應(yīng)生成的hippuricacid量減少，通過檢測生 成的hi ppuricacid的含量，對比ace的活性，即可分析出 酶解降血壓肽的抑制活性。降血壓肽的制備 根據(jù)本項目組前期研究經(jīng)驗和國際 新近研究成果，結(jié)合有關(guān)蛋白酶酶解的作用特點，選取復(fù)合 蛋白酶p1,在不同酶解條件下對貽貝蛋白進(jìn)行酶解，采取 unif ormdesign方案15,研究不同酶量、酶解時間、酶 解溫度、ph等四大因素下對ace的抑制效果。選擇最佳的酶 解條件。按上面實驗所確定的酶解條件，取新鮮貽貝去殼，搗碎, 酶解，

7、純化，然后加入活性修飾劑ma1,提取，冷凍干燥，制 備降血壓肽，以備分析檢測之用。將制備的降血壓肽樣品利用shr飼喂試驗來分析其降壓 活性。實驗方法ac e活性抑制檢測方法研究 取標(biāo)準(zhǔn)hippurica cid樣 品，配制成溶液，參考前述有關(guān)文獻(xiàn)，分別稀釋至、；以 及、兩組不同濃度，分別于2 28nm下測定其吸光值，記 錄結(jié)果。酶解樣品ace抑制效果的分析 用紫外分光光度法分析 不同酶解條件下制備的酶解降血壓肽對應(yīng)的ace抑制活性。 參照上述研究結(jié)果，并借鑒cu shman 16和后經(jīng)toshiro 17改進(jìn)的方法進(jìn)行。將各酶解液反應(yīng)值與空白樣品對照，分析所得酶解降壓 肽的ac e抑制率p。計

8、算公式為：p=a-a ax 1 0 0%降血壓肽降壓功能檢測 實驗用動物:shr,均由上海市 高血壓研究所提供，全部為雄性，16周齡,體重為250300g。 實驗前分析各組血壓、體重、周齡等比較差異均無顯著性。 用8只shr為一組，共分為5組，另取8只為空白組進(jìn)行對 昭c八、o測量方法：尾動脈法測量收縮壓sbp。2結(jié)果ace抑制活性檢測方法的研究不同濃度hippuricaci d 吸光值結(jié)果見表1、表2及圖1、圖2。表1不同濃度 hippuricac id吸光值 表2 不同濃度hippuricaci d吸光 值酶解條件對降血壓肽ace抑制率的影響 將在不同的酶 解條件下處理所得降血壓肽樣品按前

9、述方法進(jìn)行ace抑制活 性的檢測，分析其ace活性抑制率，研究不同酶解條件對降血 壓肽ace抑制率的影響，結(jié)果見表3。降血壓肽的降壓效果降血壓肽樣品動物試驗，將樣品 以/kg體重的樣品劑量進(jìn)行灌喂。灌喂前和灌喂之后第2、4、 6、8、10h分別檢測收縮壓一次，記錄各血壓值。結(jié)果見表 4。統(tǒng)計學(xué)分析采用各組別服用降血壓肽前后收縮壓的 變化情況來反映降壓效果，數(shù)據(jù)以x ±s表示，采用forwi ndows系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)，并進(jìn)行單因素方差分析，各組間進(jìn)行 dunnett t多重比較。分析結(jié)果見表5。表3不同酶解條 件對ace抑制效果影響表4 降血壓肽樣品對收縮壓降壓 效果注：3結(jié)論ace抑制

10、活性檢測方法的研究分析和的數(shù)據(jù)，可 發(fā)現(xiàn)hippuri cacid在濃度范圍為內(nèi)線性最佳，因此應(yīng)控 制有關(guān)反應(yīng)使最終的hippu ricacid濃度在此范圍之內(nèi)，提 高檢測的準(zhǔn)確性。pl酶最佳酶解條件 對于ace抑制結(jié)果進(jìn)行回歸分析, 所得回歸方程為：y二+根據(jù)方程分析最佳的ace抑制活性為。但由實驗結(jié)果在此條件下的實際ace抑制率為，所以 n01為最佳條件。其ace抑制率為，對應(yīng)的最佳酶解條件為： 酶量25iu/ml；酶解時間2h； ph ；酶解溫度6 0°co具體分析p1的酶解情況，酶量從25iu/ml到175iu/ml, 酶解時間27h,隨著酶量的增加和酶解時間的延長，其酶解

11、程度增加，但所得降血壓肽的ace抑制率下降。這是因為隨 著酶解的進(jìn)行，蛋白質(zhì)逐漸被水解成不同長度的肽斷，其中 部分因結(jié)構(gòu)上的某些活性基團(tuán)而具有降血壓活性；但隨著酶 解程度提高，部分具有ace抑制活性的短肽被酶解成氨基酸 或其活性基團(tuán)被破壞，從而導(dǎo)致其ace抑制活性下降。這一 點與kim等18通過牛皮膠制備酶解降血壓肽的研究得到 的結(jié)論相吻合，在酶解過程中控制酶解程度非常重要，既要 使蛋白質(zhì)得到充分的酶解，使更多的活性肽斷被水解出來, 但同時又要適當(dāng)控制酶解程度，即并非酶解程度最大時其降 壓活性最好。降血壓肽的降壓效果 由方差分析結(jié)果，查表得=,可 知對于處理4h和6h血壓變化的f值，說明服用降

12、血壓肽 4h和6h效果差異有顯著性。同時，由上述實驗結(jié)果可知，降血壓肽在26h之內(nèi)均 有顯著降壓效果，平均降低為1628mmhgo在6h處降壓效 果達(dá)到最大值為28mmhg ,且效果極為顯著。根據(jù)國內(nèi)外大量隨機對照的臨床試驗結(jié)果，收縮壓降低 1014mmllg和舒張壓降低56mmllg,冠心病減少1/6,總 的主要心血管事件減少1/3 19,從這個意義上講，貽貝 酶解降壓肽的降壓效果非常顯著，隨著今后進(jìn)一步研究，其 有望作為一種高品質(zhì)的食品、藥品原料而大有用途。意義 作為世界第一水產(chǎn)大國，我國的水產(chǎn)品深加工水 平卻相當(dāng)落后，產(chǎn)品的附加值較低且市場前景有限。對于應(yīng) 用水產(chǎn)原料進(jìn)行降血壓肽的開發(fā)研

13、究工作還比較落后。鑒于 以上情況，加大從水產(chǎn)動物蛋白中研制開發(fā)具有較高降血壓 活性的降血壓肽，則對于緩解以上問題有較為積極的意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1yamamoton,rubinj.antihypertensivepeptidederivedfromfoo dproteins. bi opoly,1997,4 3:129-134.2 meiselh. aceinhibitoryact ivitiesinm訂k, 1997,52： 30 7-311.3hail eslassied. pu rificationan didentificat ionofpotenti allybioactiv epep

14、tidesfro menzyme-modi f iedcheese. j dairysci, 199 9,82,1612-16 17.4jipwuy. charaterizat ionofinhibit onandstab訂i tyofsoy-prot einderivedan giotensin-co nvertinenzy meinhibitory peptides .foo dresearchlnt ernation,200 2,35:367-372 .5smachie,m egumiy. pepti desfromsever alltalianche esesinhibito ryto

15、proteoly ticenzymesof lacticacidba cteria. enzym emicrobtechn ol, 1998,22： 6 87-694.6eij ikm. resistan cetogastroin testanlprote asesofthesho rtchainpepti deshavereduc tiveeffectin bloodpressur e. nipponshkuhinkagakukog akukaishi,19 96,43:520-52 5.7pihlanto -leppalaa.an £iotensinlco nvertingenz

16、y meinhibitory propertiesof wheyproteind igests：conce nt rationandcharac teriza/tionofactivedairyres, 2000 ,67,5364.8eijik.angiot ensinconvert ingenzymeinhibitoryactiv ityoftheshor tchainpeptid esderivedfro mvariousfood proteins nip ponshkuhinka gakukogakuka ishi, 1996,43 :839-8409吳建平，丁霄霖.大豆降壓肽的研制-生

17、產(chǎn)高活性ace i肽酶系的篩選中國油脂,1999, 23： 49-51.10張蓉真，劉樹浮福建老酒中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制 物質(zhì)的分離鑒定福州大學(xué)學(xué)報,1999, 22： 112-116.11宴會根.薪蛇毒中抑制ace活性組分的分離純化與表 征福州大學(xué)學(xué)報,2001, 28： 114-117.12倪莉，陶冠軍.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性抑制劑-絲素 肽的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定色譜，20 01, 19： 222-22 5.13林智，大森正司.氨基丁酸茶成份對大鼠血管緊張素 轉(zhuǎn)換酶活性的影響茶葉科學(xué)，2002, 2 2： 43-46.14中國海洋年鑒編纂委員會.2 002中國海洋年鑒.北 京：海洋出版社,x

18、x, 11 1-121.15方開泰.均勻設(shè)計與均勻設(shè)計表.北京：科學(xué)出版社， 199 4,6.16cushm andw. spectro photometrica ssayandprope rtiesofthean giotensinco nvertingenzymeofrabbitlu ng. biopharm, 1971,20： 1673 -1675.17tos hiro. inhibit ionofangiote nsin convert ingenzymebyb acillusliche niformisalka lineprotease hydrolyzates derivedfrom