淋巴細(xì)胞表面抗原檢測(cè)-20141113碩士班

1、淋巴細(xì)胞表面抗原檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面抗原檢測(cè) - -免疫熒光法免疫熒光法2014-11-13 2014-11-13 碩士班碩士班2 基本概念基本概念 所有參與免疫應(yīng)答以及與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞均被稱為所有參與免疫應(yīng)答以及與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞均被稱為免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞。 包括包括淋巴細(xì)胞、單核淋巴細(xì)胞、單核- -巨噬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DCDC、各種粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、肥、各種粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞、干細(xì)胞。大細(xì)胞、干細(xì)胞。3免疫細(xì)胞分離方法：免疫細(xì)胞分離方法：1. 根據(jù)不同免疫細(xì)胞表面標(biāo)志:FACS、MACS2. 根據(jù)細(xì)胞理化性質(zhì)： 1）根據(jù)細(xì)胞比重差異：自然沉降法、密度梯度離心法、改變細(xì) 胞密度法 2）根

2、據(jù)細(xì)胞黏附特性：B細(xì)胞黏附于尼龍棉 3）根據(jù)細(xì)胞對(duì)滲透壓變化的敏感度：紅細(xì)胞對(duì)低滲敏感u 淋巴細(xì)胞是指在適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用的白細(xì)胞，由淋巴器官產(chǎn)生，機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分。主要指B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，二者表面抗原受體具有高度多樣性，經(jīng)抗原激發(fā)可分化為抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞，分別介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫。u 淋巴器官根據(jù)其發(fā)生和功能的差異可分為：l 中樞淋巴器官（又名初級(jí)淋巴器官）：包括胸腺、腔上囊或其相當(dāng)器官。它們無(wú)須抗原刺激即可不斷增殖淋巴細(xì)胞，成熟后將其轉(zhuǎn)送至周圍淋巴器官。l 周圍淋巴器官（又名次級(jí)淋巴器官）：包括脾、淋巴結(jié)等。 成熟淋巴細(xì)胞需依賴抗原刺激而分化增殖，繼而發(fā)揮其免疫

3、功能。 在此我們將要討論CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)的方法和意義。2021-11-30淋巴細(xì)胞5T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的主要調(diào)節(jié)及效應(yīng)細(xì)胞，在正常機(jī)體內(nèi)各淋巴細(xì)胞亞群相互作用，可通過(guò)對(duì)抗原識(shí)別、處理、遞呈引起多種細(xì)胞因子同多種細(xì)胞之間的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，構(gòu)成維持免疫功能的生理平衡，維持著機(jī)體正常免疫功能。當(dāng)不同淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí)，可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂并發(fā)生一系列病理變化。因此，淋巴細(xì)胞亞群的免疫分型能夠提供有關(guān)患者免疫狀態(tài)的重要信息。T淋巴細(xì)胞2021-11-30早期將T細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞分為Thl和Th2兩個(gè)亞群。l Thl細(xì)胞通過(guò)分泌IL-2、IL-12、IFN-和T

4、NF- 等細(xì)胞因子，介導(dǎo)與細(xì)胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏反應(yīng)。在抗感染、抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。l Th2細(xì)胞則通過(guò)分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等細(xì)胞因子，其主要功能為刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體，促進(jìn)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答。2021-11-30l 調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)也是近年來(lái)認(rèn)識(shí)的一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞， CD4+ T細(xì)胞在TGF-單獨(dú)的誘導(dǎo)下則而分化成Treg細(xì)胞，分泌TGF-并表達(dá)Foxp3，參與免疫的調(diào)節(jié)。l Thl7是一種能產(chǎn)生IL-17卻不產(chǎn)生IFN-和IL-4的CD4+T細(xì)胞，目前的研究證實(shí)了TGF-和IL-6在Thl7細(xì)胞

5、分化啟動(dòng)過(guò)程中的重要作用。同時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子STAT3和RORt，在Thl7的分化過(guò)程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。2021-11-30Th1/Th2 亞群及其相互之間的平衡在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用，Th1/Th2 平衡的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有著密切的關(guān)系。目前已發(fā)現(xiàn)許多感染性疾病、自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病以及移植排斥反應(yīng)等都與Th1/Th2 平衡有關(guān)。建立穩(wěn)定有效的細(xì)胞內(nèi)因子檢測(cè)方法對(duì)于準(zhǔn)確說(shuō)明Th1/Th2細(xì)胞的作用非常重要。目前檢測(cè)的主要方法： 酶聯(lián)免疫法、ELISPOT法、熒光定量法及原位雜交等方法。2021-11-30分化抗原分化抗原 cIuster of differen

6、tiation, CD不同譜系細(xì)胞在分化、成熟、活化過(guò)程中,出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)志。細(xì)胞表面標(biāo)志通常用單克隆抗體來(lái)識(shí)別。每個(gè)抗體都有指定的CD編號(hào),能被特定抗體識(shí)別的特定抗原通常具有相同的編號(hào),例如,被“CD1抗體”識(shí)別的抗原稱為“CD1抗原”。CD4細(xì)胞，作為淋巴細(xì)胞的一種，是人體中調(diào)控免疫系統(tǒng)最重要的樞紐細(xì)胞，其數(shù)量能夠最直接的反應(yīng)人體免疫功能的狀態(tài)。CD4細(xì)胞檢測(cè)廣泛應(yīng)用于對(duì)人體免疫功能狀況的評(píng)估，有助于腫瘤、糖尿病、冠心病、艾滋病等疾病的早期發(fā)現(xiàn)及臨床診療2021-11-30人體內(nèi)的淋巴細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)基本是一樣的，但其功能各異，對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞和醞細(xì)胞及其有關(guān)的亞群的相應(yīng)表

7、面標(biāo)志檢測(cè)，藉以判斷機(jī)體的免疫水平。一、T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)lT細(xì)胞表面標(biāo)志l抗體致敏細(xì)胞花環(huán)法l免疫細(xì)胞化學(xué)法l免疫熒光法lT細(xì)胞亞群檢測(cè)2021-11-30lT細(xì)胞表面標(biāo)志T細(xì)胞是參與機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)和在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起主導(dǎo)調(diào)節(jié)作用的一組免疫細(xì)胞。所有的T細(xì)胞均有共同的標(biāo)志性抗原，不同功能的T細(xì)胞亞群又具有各自的標(biāo)志性抗原。最常用單克隆抗睞鑒定和檢測(cè)計(jì)數(shù)T細(xì)胞及亞群的表面標(biāo)志l抗體致敏細(xì)胞花環(huán)法用相應(yīng)的抗CD3單克隆抗體吸附于醛化的紅細(xì)胞(致敏)，當(dāng)其與受檢的細(xì)胞混勻后，結(jié)合有蘭細(xì)胞的單抗與待測(cè)細(xì)胞上的CD3抗原結(jié)合形成橋聯(lián)，由于加入的紅細(xì)胞多于受檢細(xì)胞，陽(yáng)性的受程細(xì)胞能與致敏的紅細(xì)胞

8、結(jié)合而形成玫瑰花樣的花環(huán)，凡受檢細(xì)胞周圍黏附3個(gè)和3個(gè)以上紅細(xì)胞牽為花環(huán)形成細(xì)胞，計(jì)算花環(huán)形成細(xì)胞與計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞之比。2021-11-30l免疫細(xì)胞化學(xué)法通常以酶作為抗體標(biāo)記物，采用細(xì)胞酶免疫組化技術(shù)完成，并常采用生物素一鏈霉親合素放大系統(tǒng)提高靈敏度。該類方法可用普通顯微鏡觀察，凡著色的細(xì)胞即為相應(yīng)CD抗原陽(yáng)性的細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占總計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率進(jìn)行定量分析。l免疫熒光法本法是將分離得的外周血單個(gè)核細(xì)胞與相應(yīng)的以熒光物質(zhì)標(biāo)記的CD單克隆抗體作用(直掃法)，或與抗相應(yīng)CD單克隆抗體作用后，洗去游離的抗體，繼而加入熒光素標(biāo)記的抗小鼠IgG抗皿清，經(jīng)溫育結(jié)合后，洗去多余的標(biāo)記抗體(間接法)，制片

9、后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占總計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率。如有條件，采用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，結(jié)果客觀準(zhǔn)確。2021-11-30lT細(xì)胞亞群檢測(cè)采用三色標(biāo)記單克隆熒光抗體標(biāo)記單個(gè)核細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析，可對(duì)T細(xì)胞及亞群作出精確分類。2021-11-30免疫細(xì)胞定量檢測(cè)，如T淋巴細(xì)胞亞群（CD3、CD4、CD8等）檢測(cè)，能精確觀察免疫細(xì)胞數(shù)值變化，評(píng)估免疫狀況。通常采用流式細(xì)胞儀法，特別針對(duì)CD4細(xì)胞檢測(cè)，此方法已被稱作“金標(biāo)準(zhǔn)”。T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)T淋巴細(xì)胞檢測(cè)免疫細(xì)胞活性檢測(cè)，如T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，根據(jù)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度測(cè)定免疫應(yīng)答功能，但功能檢測(cè)仍需結(jié)合細(xì)胞定量檢測(cè)，結(jié)果更可靠。流式

10、細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀T細(xì)胞表面標(biāo)志及其亞群細(xì)胞表面標(biāo)志及其亞群uT細(xì)胞有兩大亞群：CD4+ CD8+u根據(jù)具體功能有分不同亞群：Td Ti Th Tc Tsu受抗原或細(xì)胞因子激活就是活化的T細(xì)胞u不同的活化細(xì)胞功能不同：l Tc活化后成CTL主要?dú)徊《靖腥镜募?xì)胞或癌細(xì)胞，l Ts活化主要抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和其他T細(xì)胞的分化，起調(diào)節(jié)免疫作用，l Td活化則適當(dāng)多種淋巴因子導(dǎo)致炎癥，排除抗原，l Th也主要協(xié)助其他免疫細(xì)胞發(fā)揮功能，是免疫應(yīng)答必不可少的。2021-11-30T細(xì)胞表面標(biāo)志及其亞群細(xì)胞表面標(biāo)志及其亞群 CD3+CD4+CD8- 輔助性T細(xì)胞（help T cell,Th） CD3+C

11、D4-CD8+ 細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cell,Tc or CTL） CD4+CD25+ 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell,Tr or Treg）2021-11-3017l SmIg、Fc受體、補(bǔ)體受體、EB病毒受體，部分CD分子是B細(xì)胞的重要表面標(biāo)志，其中以SmIg為B細(xì)胞所特有，是鑒定B細(xì)胞可靠的指標(biāo)。 l CD19/CD5分子：可將B細(xì)胞區(qū)分為B1細(xì)胞和B2細(xì)胞，B1細(xì)胞為CD19和CD5雙陽(yáng)性，而B(niǎo)2細(xì)胞僅為CD19陽(yáng)性，B2細(xì)胞為通常所指的B細(xì)胞。 B B細(xì)胞表面標(biāo)志細(xì)胞表面標(biāo)志 18 人類NK細(xì)胞表面標(biāo)志主要以CD16、CD56來(lái)認(rèn)定，臨床將CD3

12、-CD56+CD16+淋巴細(xì)胞認(rèn)定為NK細(xì)胞。 NK細(xì)胞表面標(biāo)志細(xì)胞表面標(biāo)志 19 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀由激光光源系統(tǒng)，氣控單細(xì)胞層流系統(tǒng)，光檢測(cè)及信由激光光源系統(tǒng)，氣控單細(xì)胞層流系統(tǒng)，光檢測(cè)及信息處理系統(tǒng)和細(xì)胞分離純化系統(tǒng)組成。息處理系統(tǒng)和細(xì)胞分離純化系統(tǒng)組成。 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)(FCM)是一種對(duì)處在液流中的是一種對(duì)處在液流中的單個(gè)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞或其它生物微或其它生物微粒（如細(xì)菌）等進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)，它將免疫熒光與細(xì)粒（如細(xì)菌）等進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)，它將免疫熒光與細(xì)胞生物學(xué)、流體力學(xué)、光學(xué)和電子計(jì)算機(jī)等多種學(xué)科的高新技術(shù)融為胞生物學(xué)、流體力學(xué)、光學(xué)和電子計(jì)算

13、機(jī)等多種學(xué)科的高新技術(shù)融為一體，進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的基礎(chǔ)理論與臨床應(yīng)用研究。一體，進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的基礎(chǔ)理論與臨床應(yīng)用研究。 將熒光標(biāo)記的將熒光標(biāo)記的單克隆抗體單克隆抗體加入加入PBMCPBMC懸液內(nèi)，使二者特異性結(jié)合，懸液內(nèi)，使二者特異性結(jié)合，通過(guò)流式細(xì)胞儀自動(dòng)檢測(cè)，既可很快得到通過(guò)流式細(xì)胞儀自動(dòng)檢測(cè)，既可很快得到T T、B B細(xì)胞及其亞群百分率和細(xì)胞及其亞群百分率和絕對(duì)值的有關(guān)數(shù)據(jù)，又能以每秒高達(dá)絕對(duì)值的有關(guān)數(shù)據(jù)，又能以每秒高達(dá)50005000個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞(18(18106 106 細(xì)胞細(xì)胞/h)/h)的的速度分離和收集無(wú)菌的淋巴細(xì)胞，純度可達(dá)速度分離和收集無(wú)菌的淋巴細(xì)胞，純度可達(dá)90%

14、90%99%99%，細(xì)胞活性亦不，細(xì)胞活性亦不受影響，可用于淋巴細(xì)胞的各種免疫生物學(xué)功能測(cè)定。受影響，可用于淋巴細(xì)胞的各種免疫生物學(xué)功能測(cè)定。 FACSl流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞或顆粒的各項(xiàng)特性在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞或顆粒的各項(xiàng)特性特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析可檢測(cè)的樣本種類多樣：外周血，骨髓，細(xì)胞穿刺液，洗脫液，可檢測(cè)的樣本種類多樣：外周血，骨髓，細(xì)胞穿刺液，洗脫液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞，微生物實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞，微生物2021-11-30流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣本流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣本0.4um40um流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)指標(biāo)流

15、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)指標(biāo)l流式細(xì)胞術(shù)提供的信息：流式細(xì)胞術(shù)提供的信息： - 相對(duì)細(xì)胞大小相對(duì)細(xì)胞大小 - 相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度 - 染色過(guò)細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度染色過(guò)細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu)=細(xì)胞大小細(xì)胞大小=細(xì)胞粒度細(xì)胞粒度=DNA含量與細(xì)胞周期含量與細(xì)胞周期=RNA含量含量=蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量=染色體分析染色體分析 細(xì)胞功能細(xì)胞功能=細(xì)胞表面細(xì)胞表面/胞漿胞漿/核的特核的特異性抗原異性抗原=細(xì)胞活性細(xì)胞活性=細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子=酶活性酶活性=激素結(jié)合位點(diǎn)激素結(jié)合位點(diǎn)=細(xì)胞受體細(xì)胞受體=細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡在上述信號(hào)基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選流式細(xì)胞儀組成流式

16、細(xì)胞儀組成l液流系統(tǒng)：形成層流系統(tǒng)，聚焦細(xì)胞l光學(xué)系統(tǒng)：產(chǎn)生和收集光學(xué)信號(hào)l電子系統(tǒng)：光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，進(jìn)行信號(hào)處理25熒光激活細(xì)胞分離儀分離法熒光激活細(xì)胞分離儀分離法 2021-11-30光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)l激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)包括:- 激光器- 透鏡和反射鏡，將激光引導(dǎo)到檢測(cè)區(qū)域l收集光學(xué)系統(tǒng)包括:-濾光片，將產(chǎn)生的光信號(hào)引導(dǎo)到對(duì)應(yīng)的光學(xué)接收器光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)l激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)包括:- 激光器- 透鏡和反射鏡，將激光引導(dǎo)到檢測(cè)區(qū)域l收集光學(xué)系統(tǒng)包括:-濾光片，將產(chǎn)生的光信號(hào)引導(dǎo)到對(duì)應(yīng)的光學(xué)接收器l懸浮狀態(tài)的細(xì)胞l單個(gè)流過(guò)流動(dòng)室l細(xì)胞被激發(fā)l產(chǎn)生散射光和熒光 信號(hào)l信號(hào)被采集l轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)l存儲(chǔ)于電腦

17、上 前向散射光 forward angle light scatter FALS、FSC、FS 光學(xué)檢測(cè)器在入射光的正前方所收集的低角度光信號(hào),與細(xì)胞或顆粒的大小和體積有關(guān)。 側(cè)向散射光 side scatter, SSC 光學(xué)檢測(cè)器在入射光的直角處所收集的細(xì)胞散射的光信號(hào),與細(xì)胞或顆粒的內(nèi)部和表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度有關(guān),如細(xì)胞質(zhì)顆粒性、膜不規(guī)則性及核形等。2021-11-30 熒光強(qiáng)度 fluorescence intensity 結(jié)合到細(xì)胞或顆粒上的熒光素的量。熒光信號(hào)的通道數(shù)越大提示熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。在恰當(dāng)?shù)臈l件下,熒光強(qiáng)度與一個(gè)細(xì)胞和特定熒光素相結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)相關(guān)。 自發(fā)熒光 autofIuore

18、scence 未染色細(xì)胞白身發(fā)出的熒光。通常由嘧啶和黃素核苷酸所產(chǎn)生,自發(fā)熒光的強(qiáng)度取決于激發(fā)光的波長(zhǎng),且隨所分析細(xì)胞的類型和(或)細(xì)胞活化狀態(tài)而改變。通過(guò)特殊的標(biāo)本處理方法可以降低自發(fā)熒光的強(qiáng)度(如用結(jié)晶紫孵育)。2021-11-30 顏色補(bǔ)償 coIor compensation 由于一種熒光素發(fā)射的熒光疊加到其他熒光素發(fā)射的波長(zhǎng)范圍內(nèi)而造成熒光信號(hào)重疊，通過(guò)在其他熒光信號(hào)中扣除已測(cè)定熒光信號(hào)的一部分而糾正顏色重疊造成的計(jì)數(shù)錯(cuò)誤?？鄢臒晒饬渴怯们‘?dāng)?shù)膯稳緦?duì)照來(lái)確定的。被校正的信號(hào)反映了單熒光信號(hào)的發(fā)射情況。 設(shè)門 gate 在流式細(xì)胞儀顯示的象限圖上基于一組參數(shù)(如熒光對(duì)SSC、FSC/

19、SSC等)來(lái)確定的所要分析的目的細(xì)胞群。對(duì)限定區(qū)內(nèi)的目的細(xì)胞群通過(guò)其他參數(shù)(如熒光參數(shù))進(jìn)一步分析其表達(dá)情況。2021-11-30數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集l三種數(shù)據(jù)：三種數(shù)據(jù)： - 前向散射光FSC - 側(cè)向散射光SSC - 各種熒光散射光FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3，F(xiàn)L4l當(dāng)使用激光光源時(shí)，在前向方向（和激光行進(jìn)的方向相同）上可用前向散射光接收通道前向散射光接收通道接收到一定量的散射光l前向散射光的強(qiáng)度是和細(xì)胞或其他檢測(cè)顆粒的大小、形狀密切相關(guān)的數(shù)據(jù)采集-前向散射光l當(dāng)激光光源被使用時(shí)，側(cè)向也有一定量的散射光產(chǎn)生， 可以用9090o o 角的側(cè)向散射光檢測(cè)通道角的側(cè)向散射光檢測(cè)通道來(lái)采集l側(cè)向散射光的強(qiáng)

20、度和細(xì)胞或其他檢測(cè)顆粒的顆粒密度、內(nèi)部復(fù)雜程度密切相關(guān)數(shù)據(jù)采集-側(cè)向散射光外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖圖 顆粒雜質(zhì)、氣泡對(duì)檢測(cè)的影響l細(xì)胞標(biāo)記上熒光物質(zhì)后，這種熒光物質(zhì)要求特定波長(zhǎng)的激發(fā)光來(lái)激發(fā)，同時(shí)發(fā)出特定波長(zhǎng)的光l熒光物質(zhì)被激發(fā)以后產(chǎn)生的發(fā)射光將由特定的熒光通道來(lái)接收l(shuí)特定檢測(cè)是通過(guò)光學(xué)濾片和透鏡來(lái)控制的數(shù)據(jù)采集-熒光信號(hào)l熒光強(qiáng)度是和細(xì)胞上標(biāo)記上的熒光染料的量正相關(guān)數(shù)據(jù)采集電壓電壓l 信號(hào)放大方式：log、linl 信號(hào)類型：A,W,Hl 電壓的調(diào)節(jié):根據(jù)陰性對(duì)照管來(lái)調(diào)節(jié)閾值閾值l可以以任意參數(shù)及多個(gè)參數(shù)的組合作為閾值l大多數(shù)樣本都可以設(shè)定FSC/SSCl閾值以

21、下的信號(hào)不存儲(chǔ)l根據(jù)陰性對(duì)照管來(lái)調(diào)節(jié)l目的是將不需要的雜質(zhì)信號(hào)，噪音信號(hào)，無(wú)用的細(xì)胞信號(hào)等扣除，使收集到的都是有用信號(hào)補(bǔ)償補(bǔ)償l 補(bǔ)償方式：任意兩個(gè)通道之間，可以采用手動(dòng)或自動(dòng)補(bǔ)償。l 補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié):根據(jù)單染對(duì)照管來(lái)調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析l 流式數(shù)據(jù)流式數(shù)據(jù) 直方圖直方圖 散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖 等高線圖等高線圖 密度圖密度圖 三維圖三維圖 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)直方圖直方圖l 直方圖直方圖(Distribution Histogram) 橫坐標(biāo)代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度橫坐標(biāo)代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度，單位是，單位是對(duì)數(shù)，可以是線性或?qū)?shù)坐標(biāo)。對(duì)數(shù)，可以是線性或?qū)?shù)坐標(biāo)。 縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)?？v坐標(biāo)

22、一般是細(xì)胞數(shù)。散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖l 散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖(Dot Plot) X坐標(biāo)為該細(xì)胞一參數(shù)相對(duì)含量，坐標(biāo)為該細(xì)胞一參數(shù)相對(duì)含量，Y坐標(biāo)為該細(xì)胞另一坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的含量，可以將細(xì)胞亞群分開(kāi)。參數(shù)的含量，可以將細(xì)胞亞群分開(kāi)。等高線圖和密度圖等高線圖和密度圖三維圖三維圖統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)l Eventsl 百分比l 平均熒光強(qiáng)度l 熒光中位值l CVl SDl 數(shù)據(jù)獲取與分析電壓閾值補(bǔ)償獲得數(shù)據(jù)畫(huà)圖設(shè)門統(tǒng)計(jì) 熒光素標(biāo)記的單克隆抗體 采用熒光素直接標(biāo)記的單克隆抗體(單抗)，稱直標(biāo)抗體。選擇直標(biāo)抗體是淋巴細(xì)胞亞群分析的關(guān)鍵步驟,要考慮所選抗體對(duì)細(xì)胞的反應(yīng)性。 單抗 CD45、CD3、CD4、CD8、CD1

23、9、CD16、CD56。2021-11-30 單抗對(duì)細(xì)胞的反應(yīng)性 CD45表達(dá)于所有白細(xì)胞; CD3表達(dá)于T淋巴細(xì)胞; CD4表達(dá)于T輔助/誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)和單核細(xì)胞; CD8表達(dá)于細(xì)胞毒T細(xì)胞(CD8- T)和NK細(xì)胞; CD19表達(dá)于B淋巴細(xì)胞; CD16表達(dá)于NK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等; CD56表達(dá)于NK細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞。 單抗對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的鑒定CD4、CD8、CD16和CD56單抗均不能特異性標(biāo)記淋巴細(xì)胞某一亞群。采用CD45和(或)CD3作為設(shè)門抗體,同時(shí)兼做質(zhì)控試劑。CD3+ T細(xì)胞標(biāo)記為CD3 +,CD4+T細(xì)胞標(biāo)記為CD3 + CD4+ C

24、D8+ T細(xì)胞標(biāo)記為CD3+ CD8+B細(xì)胞標(biāo)記為CD3 -CD19 +NK細(xì)胞標(biāo)記為CD3 - CD56+ 或 CD3 CD(16+56)+2021-11-30 直標(biāo)抗體常用熒光染料 異硫氰酸熒光素(FITC) 藻紅蛋白(PE/RD1) 藻紅蛋白偶聯(lián)物(PECY5) 多甲藻葉綠素蛋白(PerCP) 藻紅蛋白-德州紅偶聯(lián)物(ECD) 別藻青蛋白(APC) 除別藻青蛋白(APC)外,其他熒光染料均采用488nm的激發(fā)光源激發(fā),最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為525nm、575nm、670nm、675nm和613nm。 別藻青蛋白(APC)的激發(fā)光源為630nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為660nm。2021-11-30

25、溶血素 使用與儀器相匹配的溶血素(內(nèi)含固定液),并嚴(yán)格按照使用說(shuō)明和注意事項(xiàng)進(jìn)行操作。如果使用沒(méi)有固定作用的溶血?jiǎng)?如氯化銨和低滲緩沖液等),染色后標(biāo)本需要保存在4 ,并在1h內(nèi)完成上機(jī) 固定液 0.1%-2.0%多聚甲醛或甲醛緩沖液是常用的固定液,用于對(duì)感染的標(biāo)本在分析前進(jìn)行滅活,能夠滅活HIV 等病毒的3個(gè)-5個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的病毒載量。在染色過(guò)程中的最后一次離心后,用含有多聚甲醛或甲醛緩沖液(Ph7.0-7.4)處理,4 保存待測(cè)。2021-11-3056流式細(xì)胞分析儀流式細(xì)胞分析儀1973年BD公司公司與StanfordUniversity合作開(kāi)發(fā)世界上第一臺(tái)商用流式細(xì)胞儀FACSI。1980

26、年北京師范大學(xué)引進(jìn)中國(guó)第一臺(tái)流式細(xì)胞儀FACSIII。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 流式細(xì)胞儀主要有兩個(gè)最基本的用途： 可以定量分析鑒定活細(xì)胞表面表達(dá)的特異分子， 進(jìn)行特定的活細(xì)胞群的分離和純化。2021-11-30 免疫細(xì)胞群的分類 靜止淋巴細(xì)胞之間從其外觀形態(tài)難以區(qū)分，都是以致密的核及少量細(xì)胞質(zhì)組成的小而圓的細(xì)胞為特征。然而，這些細(xì)胞確是由功能各異的不同細(xì)胞亞群所組成，各種細(xì)胞群表達(dá)各自特殊的表面分子。 B淋巴細(xì)胞上表達(dá)有特異的膜表面免疫球蛋白（mIg），而成熟的T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)特異的CD3分子。 T淋巴細(xì)胞又可進(jìn)一步按其表達(dá)的不同表面標(biāo)志細(xì)分成不同的亞群，如CD4+CD8-和CD4-CD8+亞群。因此，可

27、由這些特征性的表面標(biāo)志，將細(xì)胞分為不同的群或亞群。2021-11-30 免疫細(xì)胞的分化發(fā)育 免疫細(xì)胞分化發(fā)育的不同階段，其表面標(biāo)志也在不斷地發(fā)生著變化。 如胸腺細(xì)胞（發(fā)育過(guò)程中的T淋巴細(xì)胞），在發(fā)育的不同階段從不成熟到成熟，其表面標(biāo)志經(jīng)歷了從雙陰性（CD4-CD8-）到雙陽(yáng)性（CD4-CD8-），直到單陽(yáng)性（CD4+CD8-或CD4-CD8+）的過(guò)程。正常生理狀態(tài)下，發(fā)育不同階段的胸腺細(xì)胞以一定的比例存在于胸腺中。通過(guò)檢測(cè)這些標(biāo)志，即可判定某些因素（基因突變等）對(duì)胸腺細(xì)胞發(fā)育的影響。2021-11-30 免疫細(xì)胞的分子表達(dá) 免疫細(xì)胞的不同因素的影響下，其表達(dá)的分子也會(huì)發(fā)生變化。通過(guò)檢測(cè)這些分子的變化，可分析細(xì)胞功能以及細(xì)胞分化狀態(tài)等。 靜止的T淋巴細(xì)胞不表達(dá)或低水平表達(dá)CD69分子；而一經(jīng)活化，其表達(dá)CD69分子數(shù)量明顯增加。 可通過(guò)檢測(cè)這些活化標(biāo)志的變化來(lái)判定細(xì)胞狀態(tài)