蘇教選修植物組織培養(yǎng)技術實用教案

1、一、實驗(shyn)目的掌握植物組織培養(yǎng)相關理論知識掌握植物組織培養(yǎng)的操作方法了解不同激素(j s)及其比例對愈傷組織再分化的作用第1頁/共46頁第一頁，共46頁。二、相關(xinggun)(xinggun)知識 離體（in vitro)條件下利用人工培養(yǎng)條件在無菌情況下培養(yǎng)、生長、發(fā)育再生出完整植株的過程。 1958年，英國科學家Steward 等用胡蘿卜根的愈傷組織細胞進行懸浮培養(yǎng)，成功誘導出胚狀體并分化為完整的小植株，不但使細胞全能性理論得到證實，而且為組織培養(yǎng)的技術程序奠定(dindng)了基礎。 第2頁/共46頁第二頁，共46頁。應用領域應用領域 1 1、快速繁殖、快速繁殖 運用組織

2、培養(yǎng)的途徑運用組織培養(yǎng)的途徑，一個單株一年可以繁殖幾萬到幾百萬個植株，一個單株一年可以繁殖幾萬到幾百萬個植株。例如一株蘭花一年繁殖到。例如一株蘭花一年繁殖到400400萬株。萬株。2 2、種苗脫毒、種苗脫毒 針對針對(zhndu)(zhndu)病毒對病毒對農作物造成的嚴重危害，通過組織培養(yǎng)可以有農作物造成的嚴重危害，通過組織培養(yǎng)可以有效地培育出大量的無病毒種苗。效地培育出大量的無病毒種苗。3 3、遠緣雜交、遠緣雜交 利用組織培養(yǎng)可以使難度利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的遠緣雜交取得成功，從而育成一些罕見很大的遠緣雜交取得成功，從而育成一些罕見的新物種。的新物種。二、相關(xinggun)知識第3頁

3、/共46頁第三頁，共46頁。應用領域應用領域 4 4、突變育種、突變育種 采用組織培養(yǎng)可以直采用組織培養(yǎng)可以直接誘變和篩選出具抗病、抗鹽、高賴氨酸、高接誘變和篩選出具抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。蛋白等優(yōu)良性狀的品種。5 5、基因工程、基因工程 基因工程主要研究基因工程主要研究DNADNA的的轉導轉導(zhun do)(zhun do)，而基因轉導，而基因轉導(zhun (zhun do)do)后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實現(xiàn)植株后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實現(xiàn)植株再生。再生。6 6、生物制品、生物制品 有些極其昂貴的生物制品有些極其昂貴的生物制品，如抗癌首選藥物，如抗癌首選藥物-

4、紫杉醇等，可通過組織培紫杉醇等，可通過組織培養(yǎng)方式生產(chǎn)。養(yǎng)方式生產(chǎn)。二、相關(xinggun)知識第4頁/共46頁第四頁，共46頁。植物組織培養(yǎng)的分類 廣義(gungy)的組織培養(yǎng)依外植體不同，可分為： 1) 器官培養(yǎng)（organ culture） 2)莖尖分生組織培養(yǎng)(shoot tip culture, apical meristem culture) 3)愈傷組織培養(yǎng)(calluse cultrue) 4)細胞培養(yǎng)(cell culture) 5)原生質體培養(yǎng)(protoplast culture)二、相關(xinggun)知識第5頁/共46頁第五頁，共46頁。 外植體(explant)

5、：由活體（in vivo)植物體上提取下來的，接種在培養(yǎng)基上的無菌細胞、組織、器官等。 愈傷組織(callus)：在人工(rngng)培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團無序生長狀態(tài)的薄壁細胞。二、相關(xinggun)知識第6頁/共46頁第六頁，共46頁。二、相關(xinggun)知識第7頁/共46頁第七頁，共46頁。二、相關(xinggun)知識第8頁/共46頁第八頁，共46頁。二、相關(xinggun)知識第9頁/共46頁第九頁，共46頁。二、相關(xinggun)知識第10頁/共46頁第十頁，共46頁。二、相關(xinggun)知識第11頁/共46頁第十一頁，共46頁。二、相關(xinggun

6、)知識第12頁/共46頁第十二頁，共46頁。植物組織培養(yǎng)特點 培養(yǎng)條件可以(ky)人為控制 生長周期短，繁殖率高 管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制二、相關(xinggun)知識第13頁/共46頁第十三頁，共46頁。植物組織培養(yǎng)營養(yǎng)(yngyng)條件-培養(yǎng)基(Culture Medium) 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質。 培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無機鹽、有機物、天然復合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。二、相關(xinggun)知識第14頁/共46頁第十四頁，共46頁。 國際上流行(lixng)的培養(yǎng)基有幾十種，常用的培養(yǎng)基有： MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、KM-

7、8P培養(yǎng)基二、相關(xinggun)知識第15頁/共46頁第十五頁，共46頁。常用培養(yǎng)基簡介-MS培養(yǎng)基 1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設計的。特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他(qt)培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。二、相關(xinggun)知識第16頁/共46頁第十六頁，共46頁。常用培養(yǎng)基簡介-B5培養(yǎng)基 是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計的。其主要特點是含有(hn yu)較低的銨，這可能

8、對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。二、相關(xinggun)知識第17頁/共46頁第十七頁，共46頁。常用培養(yǎng)基簡介-White培養(yǎng)基 是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設計的。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MgSO4的濃度和增加了硼素。其特點是無機(wj)機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。二、相關(xinggun)知識第18頁/共46頁第十八頁，共46頁。常用培養(yǎng)基簡介N6培養(yǎng)基 是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設計(shj)的。其特點是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。

9、在國內已廣泛應用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。二、相關(xinggun)知識第19頁/共46頁第十九頁，共46頁。常用培養(yǎng)基簡介KM-8P培養(yǎng)基 1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設計的。特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛(gungfn)地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。二、相關(xinggun)知識第20頁/共46頁第二十頁，共46頁。不同營養(yǎng)條件對植物(zhw)組織培養(yǎng)的影響 Growth medi

10、um is optimised for regeneration of plantletsNo sucrose (0%)Sucrose reduced to 1%Sucrose increased to 5%T h e e x p l a n t i s completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.Shoots developed o

11、n edges of upper surface, a n d s o m e r o o t development has occuredShoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium二、相關(xinggun)知識第21頁/共46頁第二十一頁，共46頁。No BAPBAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAAPoor shoot

12、development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots. Undi

13、fferentiated callus is developing at the edges of the explant二、相關(xinggun)知識第22頁/共46頁第二十二頁，共46頁。NAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callusNo MS saltsNo sign of regeneration from explant at all. MS salts reduced to 0.

14、47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shootsMS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.二、相關(xinggun)知識第23頁/共46頁第二十三頁，共46頁。植物(zhw)細胞的全能性 植物細胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。 差異:(1) 受精卵的全能性最高 (2) 受精卵分化后的細胞中，體細胞的全能性比生殖細胞的低。 潛在

15、全能性的原因：基因表達的選擇性 科學研究表明，處于離體狀態(tài)的植物活細胞，在一定的營養(yǎng)物質、激素和其他外界條件的作用(zuyng)下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實現(xiàn)的這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。三、實驗(shyn)原理第24頁/共46頁第二十四頁，共46頁。植物(zhw)細胞全能性的表達 脫分化（dedifferentiation)：將來自(li z)已分化組織的已停止分裂的細胞從植物體部分的抑制性影響下解脫出來，恢復細胞的分裂活性。 再分化（redifferentiation):經(jīng)脫分化的組織或細胞在一定的培養(yǎng)條件下可有轉變?yōu)楦鞣N不同細胞類型的能力。三、實驗(shyn)原

16、理第25頁/共46頁第二十五頁，共46頁。四、試劑(shj)和器材1、材料 新鮮胡蘿卜莖2、試劑(shj) MS培養(yǎng)基 10%亞硫酸溶液第26頁/共46頁第二十六頁，共46頁。MS培養(yǎng)基配制(pizh)方法四、試劑(shj)和器材第27頁/共46頁第二十七頁，共46頁。四、試劑(shj)和器材3、儀器(yq)高壓滅菌鍋、超凈工作臺、烘箱、培養(yǎng)箱4、玻璃器皿試劑瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培養(yǎng)皿5、用具鑷子、解剖刀、接種針、記號筆、封口膜第28頁/共46頁第二十八頁，共46頁。離體的植物離體的植物器官、組織器官、組織(zzh)、細

17、、細胞胞脫分化(fnhu)愈愈傷傷組組織織(zzh)再分化根根芽芽植植物物體體五、操作步驟第29頁/共46頁第二十九頁，共46頁。五、操作步驟 切開胡蘿卜，在圓圈(yunqun)處取一塊組織 P-木質部、C-形成層、X-韌皮部第30頁/共46頁第三十頁，共46頁。五、操作步驟形成(xngchng)層開始形成(xngchng)愈傷組織C1-愈傷組織、C2-形成(xngchng)層第31頁/共46頁第三十一頁，共46頁。五、操作步驟3-4周后完全形成愈傷組織狀態(tài)（脫分化(fnhu)）組織塊失去色素第32頁/共46頁第三十二頁，共46頁。五、操作步驟把脫分化后的愈傷組織(zzh)轉移到培養(yǎng)基上第33

18、頁/共46頁第三十三頁，共46頁。五、操作步驟兩周左右(zuyu)開始再分化，長出幼苗第34頁/共46頁第三十四頁，共46頁。五、操作步驟將幼苗移植(yzh)到外部條件下培養(yǎng)（順化）第35頁/共46頁第三十五頁，共46頁。五、操作步驟順化(shn hu)一個月后的胡蘿卜植株第36頁/共46頁第三十六頁，共46頁。培養(yǎng)基配制(pizh)(I)母液配制(pizh)： 按照MS培養(yǎng)基成分表, 配制分別配制培養(yǎng)基的母液。1、大量元素母液(10倍液) 分別稱取10倍用量的各種大量無機鹽，依次溶解于大約800ml熱的（60-80）蒸餾水中。（一種成分完全(wnqun)溶解后再加入下一種，最后加水，定容至1

19、000ml后裝入試劑瓶中，冰箱內貯存?zhèn)溆茫Ｎ?、操作步驟第37頁/共46頁第三十七頁，共46頁。2、微量元素母液(100倍液) 分別稱取100倍用量的微量無機鹽，依次溶解(rngji)于800ml重蒸水中，加水定溶到1000ml。 3、鐵鹽母液（100倍液） 稱取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸鈉)和FeSO47H2O，溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。 五、操作步驟培養(yǎng)基配制(pizh)(I )母液配制(pizh)：第38頁/共46頁第三十八頁，共46頁。4、有機物質母液(100倍數(shù)) 分別(fnbi)稱取50倍用量的各種有機物質，依次溶解于400ml重蒸水中，定容

20、至1000ml，裝入棕色試劑瓶中，貯存冰箱備用。 除上述四種母液外，培養(yǎng)基中經(jīng)常附加的各種生物素和細胞分裂素也要配成母液貯存，臨用時按濃度定量吸取加入。五、操作步驟培養(yǎng)基配制(pizh)(I)母液配制(pizh)：第39頁/共46頁第三十九頁，共46頁。5、生長素 如2,4-D、IAA、NAA等。準確稱取20mg，先用2ml95%乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，濃度為1mg/ml，再放置冰箱內貯存?zhèn)溆?biyng)。 6、細胞分裂素 如激動素(Kt)、6-芐基嘌呤(6-BA)。準確稱取20mg，先用2ml的1mol/ml HCL或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，濃度為1mg/ml，再放置冰箱內貯存?zhèn)溆?biyng)。五、操作步驟培養(yǎng)基配制(pizh)(I)母液配制(pizh)：第40頁/共46頁第四十頁，共46頁。 取1000ml燒杯一只，加大量元素(yun s)10倍母液100ml，微量元素(yun s)100倍母液10ml，鐵鹽100倍母液10ml,有機物質100倍母液10ml。此外,根據(jù)培養(yǎng)材料和實驗目的還要附加一定量的生長素,細胞分裂素及蔗糖等,然后加水至1000ml,待蔗糖充分溶解后用1mol/L 的NaOH或HCl調酸堿度為pH5.8,最后加入瓊脂粉6.5g,如用瓊脂條,則要加8g。五、操作步驟培養(yǎng)基配制(